다층 물고기 비늘 (의 특성

이 절차의 전반적인 목표는 X선 컴퓨터 단층촬영, 나노 인덴테이션, 푸리에 변환 적외선 분광법 및 에너지 분산형 X선 분광법과 결합된 주사 전자 현미경 분석을 수행하여 다층 구조의 석회화된 물고기 비늘의 구조, 화학적 성분 및 기계적 특성을 규명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 비늘에서 연조직을 제거하고, 비늘을 고정 및 절단한 후 단계별 연마 과정을 거쳐 분석을 위한 개별 비늘 샘플을 준비합니다. 두 번째 단계는 다이아몬드 베르코비치 팁을 사용하여 비늘의 단면을 따라 공간적으로 상관된 나노 인덴테이션을 수행함으로써 국소적인 나노 기계적 특성을 측정하는 것입니다.

다음으로, 각 층의 주요 작용기를 확인하기 위해 FTIR 현미경으로 물고기 비늘의 내층과 외층을 분석합니다. 마지막 단계로, 주사 전자 현미경의 EDX 검출기를 사용하여 물고기 비늘에 형성된 나노 압입부의 국부적 화학 조성을 상관 분석하고, 서로 다른 층과 파단면의 압입 이미지를 캡처합니다. 최종적으로, 이러한 다양한 실험 기법들을 결합함으로써 구조-물성 관계에 대한 이해를 통해 광물화된 물고기 비늘의 천연 설계 원리를 규명합니다.

벌크 통계적 나노 인덴테이션과 같은 다른 기존 시험 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 화학적 조성 구조와 국부적 기계적 특성 사이의 직접적인 상관관계를 실제로 제공한다는 점입니다. 관심 영역에서 우리는 구조적 바이오 소재의 공간적 분포, 화학적 조성 구조 및 기계적 특성을 연구하기 위해 이 방법을 실제로 적용해 왔습니다. 또한 시멘트 기반 재료, 다상 복합재, 그리고 마이크로미터 및 나노미터 길이 스케일에서 그러한 불균질성을 나타내는 모든 유형의 불균질 재료를 포함하여 많은 응용 분야가 있습니다.

어류 비늘 단축의 횡단면을 관찰하려면, 시중에서 판매되는 플라스틱 시료 홀더를 사용하여 에폭시 매립 시 시료의 방향을 올바르게 유지하면서 32 millimeter 직경의 시료 몰드에 어류 비늘을 고정합니다. 시료가 몰드에 고정되면, 경화되지 않은 에폭시를 시료 위에 붓습니다. 제조사의 지침에 따라 에폭시를 경화시킨 후, 다이아몬드 블레이드 고정밀 절단 톱을 사용하여 매립된 시료의 중앙선을 따라 절단합니다.

시료를 나노 인덴터(nano indenter)에 로딩한 후, 소프트웨어 컨트롤을 사용하여 시료를 첫 번째 압입 위치로 이동시킵니다. 해당 위치부터 시작하여 통계적으로 유의미한 데이터 세트를 얻기 위해 15 µm 간격으로 4개의 평행한 압입 행을 수행합니다. 그 다음, 나노 인덴터의 최대 하중을 5 mN, 하중 및 제하 속도를 0.1 mN/s, 유지 시간을 30 s, 각 행의 최소 압입 간격을 5 µm로 설정합니다. 배치가 완료되면 나노 인덴터를 사용하여 첫 번째와 마지막 압입 지점에 최대 하중 100 mN으로 기준 압입(fiducial indents)을 생성하며, 이 지점들은 각각 골층(bone layer) 전의 에폭시(epoxy)와 골층 후의 에폭시에 위치해야 합니다.

나노 인덴테이션(nano indentation) 후, 추가적인 탈수를 방지하기 위해 샘플을 다시 PBS 용액에 넣습니다. 샘플의 가장 긴 차원이 검출기와 평행하도록 단단히 고정합니다. 스캐너 설정을 마친 후, 스티로폼이나 파라폼과 같이 x-선 투과성 재료를 사용하여 고정된 샘플을 스캐너 스테이지에 고정합니다.

샘플이 회전 중심에 위치하도록 배치하십시오. 스캔 전 과정 동안 전체 스케일이 시야에 들어오는 가장 높은 해상도를 선택하며, 이 경우 7.5 micrometers입니다. 데이터 획득 후, x-선 투영 영상을 재구성하여 단면 영상이 포함된 데이터 세트를 생성하십시오.

그런 다음 소프트웨어를 사용하여 최종 3D 그레이스케일 이미지를 얻습니다. 스티로폼과 파라폼으로 인한 아티팩트를 제거하기 위해 그레이스케일 범위를 적절한 수준으로 조정하십시오. 연마된 시료의 나노 인덴트를 SEM 또는 주사 전자 현미경으로 이미징하려면, 인덴트된 표면이 위를 향하도록 하여 양면 탄소 테이프로 시료를 SEM 스텁에 고정하십시오. 다음으로, 시료를 SEM 챔버에 넣고 챔버를 저진공 모드로 펌핑하십시오.

작동 거리를 3.0에서 5.0 mm 사이로 조정하십시오. 고전압을 활성화하고 시편에서 관심 영역으로 이동하며, 이 경우에는 anoe 및 뼈 층에 존재하는 구조물들이 해당됩니다. 그 다음 5 kV에서 15 kV 사이의 고전압과 3.9 nA의 낮은 빔 전류에서 이미지를 획득하십시오.

해상도를 높이기 위해, 저진공 후방 산란 전자 BSE 검출기를 사용하여 최소 3곳의 관심 영역을 250배에서 10,000배 배율로 촬영함으로써 생체 광물 함량 및 밀도 변화의 식별을 돕습니다. 그 후, 각 압입선 끝의 기준 마크로 표시된 나노 압입 그리드가 포함된 연마된 시편의 관심 영역으로 이동합니다. 고전압이 최소 15 kilovolts인지 확인하십시오.

빔 전류는 최소 3.9 nano amps이며, 작동 거리는 5.0 millimeters보다 커야 합니다. 그다음 EDX를 사용하여 분석할 영역의 후방 산란 전자 이미지를 캡처합니다. EDX 분석 소프트웨어를 사용하십시오.

압흔 라인을 따라 화학 분석을 수행할 영역을 찾는 데 도움이 되도록 동일한 이미지를 캡처합니다. 다음으로, 라인 분석 기법을 사용하여 첫 번째 압흔에서 시작하여 마지막 압흔에서 끝나는 관심 압흔 라인을 따라 화학 분석을 수행할 라인을 배치합니다. 화학적 조성과 기계적 특성 사이의 직접적인 공간적 상관관계를 제공하기 위해, 압흔의 수와 동일한 수의 분석 지점이 라인을 따라 배치되도록 지정합니다.

라인의 위치를 잡고 포인트들을 정확하게 지정합니다. 라인 분석이 완료된 후 EDX 소프트웨어를 사용하여 라인 분석을 시작합니다. 시편의 연마된 표면 위 지정된 라인을 따라 얻은 포인트 스펙트럼에서 정량 분석할 관심 원소들을 식별합니다.

관심 원소가 확인되면, 제동 복사(bremsstrahlung) 및 기타 효과를 보정하기 위해 배경 보정을 수행합니다. 소프트웨어의 디콘볼루션 분석(deconvolution analysis) 옵션을 선택하여 지정된 선을 따라 각 지점의 정량 분석을 수행함으로써 각 지점의 화학적 조성을 정량화합니다. 마지막으로, 정량적 화학 분석 결과와 분석된 지정 선의 이미지를 함께 저장하여, nano indentation을 사용하여 anoe 층에서 측정한 기계적 특성과의 공간적 상관관계를 파악하는 데 활용합니다. nano indenture를 통해 계산된 평균 탄성 계수는 69.0 giga pascals이며 경도는 3.3 giga Pascals입니다.

나노 인덴테이션 분석 결과, 골층의 평균 탄성 계수는 14.3 giga pascals, 경도는 0.5 giga pascals로 측정되었습니다. anoe 층과 골층은 화학 조성에서 정량적인 차이를 보입니다. 골층에서 나타나는 탄소 스파이크는 낮은 무기질화 정도에 기인한 것으로 보이며, 이는 탄소 증가와 BSE 이미지 밝기 감소로 이어집니다. 골층과 ENE 층의 FTIR 스펙트럼을 통해 외곽 gwe 층에서는 하이드록시아파타이트 시그니처가, 내부 골층에서는 콜라겐 시그니처가 관찰됩니다.

X선 컴퓨터 단층촬영 결과, 비늘이 겹치는 부분에서는 gwe 층이 뼈 층을 덮지 않는 것으로 나타났습니다. 밝은 회색의 gwe 층은 밀도가 더 높고 더 단단하며 강성이 높은 반면, 어두운 회색의 뼈 층은 밀도와 강성이 더 낮습니다. ging 층 중심 근처에서 뚜렷한 구멍들이 관찰되며, 이는 해당 층의 불균일성을 보여줍니다.

식각된 파단면의 저배율 SEM 이미지는 ging 층에서 층상 패턴으로 조직된 나노 구조를 보여주며, 이는 FTIR 결과와 상관관계가 있습니다. 식각된 파단면의 고배율 SEM 이미지에서는 ging 층에 배향된 나노 로드가 나타나는 반면, 골 층에서는 발달 후 섬유 형태의 나노 구조가 관찰됩니다. 이 기술은 화학적 조성, 구조 및 기계적 특성의 공간적 분포를 연구하고 다상 복합 재료의 계면을 분석하기 위한 생체 재료 및 복합 재료의 추가 연구를 위한 길을 열었습니다. 이제 이 영상을 시청함으로써, 구조적 생체 재료에서 화학적 조성을 구조 및 기계적 특성과 공간적으로 상관시켜 분석하기 위한 시편 준비 및 분석 수행 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

이러한 기술들은 다른 유형의 불균일 다상 재료를 연구하는 데에도 적용 및 응용이 가능합니다.