Name: 한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: 학습하세요 BS3 가교 수정 스트렙타딘 수지를 이용한 트윈-스트렙 태그 융합 단백질 정화법. 이 방법은 바이러스 리보핵단백질 복합체를 고효율로 분리하여 질량 분석이 가능한 고순도 샘플을 제공합니다.

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우리는 기꺼이 시니 Miettinen, 미나 Pöllänen 및 한인 Rautavesi의 기술 지원을 인정합니다. 우리는 HEK에게 녹음 장비를 제공하는 트윈 연쇄상 구균 - 태그 GFP 및 페카 Evijärvi을 표현하는 293 세포를 제공 헬카 Nurkkala 감사합니다. 이 작품은 핀란드의 아카데미에 의해 투자되었다, 번호 138329, 134684 및 258978을 부여합니다.

1. 비스와 패 혈성-Tactin 폴리 메타 크릴 수지 (술포 숙신 이미 딜)의 가교 수베 (BS3) <ol><li> 실온 BS3 가교제의 2 ㎎을 함유 한 밀봉 된 마이크로 튜브를 평형화. 주의 : BS3는 유해 물질이다. 보호 장갑과 고글을 착용 할 것. </li><li> 재현 탁 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지 (100 MM 트리스 - 염산, 산도 8.0의 50 % 현탁액, 1 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨)에 의한 간단한 격렬한 흔들림 즉시에 피펫 팁을 사용하여 스핀 컬럼으로 서스펜션의 600 μl를 전송 끝은 잘라. </li><li> 실온에서 30 초 동안 1,500 XG에 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기하고 열을 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 450 μl를 추가합니다. </li><li> 완전히 PBS로 트리스 버퍼를 교체하고 마지막으로 원심 분리 한 후 pH를 8.0로 조정 PBS 430 μL에 수지를 떠나 이전 단계 2를 번 더 반복합니다. </li><li> (100)를 포함하는 피펫 팁 BS3으로 모세관의 호일에 구멍을1, 초순수의 L. 부드럽게 아래로 피펫에 의해 물에 BS3 분말을 녹여 바로 스핀 열 용액 20 μl를 추가합니다. 가교 반응에 BS3의 최종 농도는 ~ 1.2 ㎜이다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 열을 돌립니다. 수지가 BS3 솔루션을 적절하게 혼합되어 있는지 확인합니다. </li><li> 반응을 해소하기 위해, 3M 트리스 - 염산, 산도 7.5의 10 μl를 추가하고 실온에서 또 다른 15 분 동안 열을 돌립니다. </li><li> 실온에서 30 초 동안 1,500 XG에 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기 및 트리스 450 μL의 가교 수지를 재현 탁은 트윈 20 (TBST)와 완충 식염수. 원심 분리를 반복하고 단계를 두 번 더 씻는다. 마지막 단계에서, TBS 450 μL에 재현 탁 수지. </li><li> 끝으로 피펫 팁을 사용하여 새로운 튜브에 수지 현탁액을 전송 차단. TBS의 또 다른 450 μL와 컬럼에 남아있는 수지를 재현 탁하고 같은 튜브에 전송할 수 있습니다. 반복 일한 번 더 튜브에 열에서 수지의 최대 전송을 보장하기 위해 전자 마지막 단계. </li><li> 관을 실온에서 10 분간 방치하고 과량의 TBS를 제거하여 600 μL로 볼륨을 조절하자. 수지 (권장) 즉시 사용할 준비가 또는 냉동하지 않고, 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 교차 연결된 연쇄상-Tactin 폴리 메타 크릴 레이트 수지에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 미끼 단백질 및 관련 단지의 바인딩 <ol><li> 4 ° C에서 10 분 동안 17,000 XG에서 버퍼를 결합하고 새로운 튜브에 뜨는을 전송의 미끼 단백질 시료의 원심 분리기 1 ML. </li><li> , 패 혈성-Tactin 수지에 내인성 바이오틴 단백질의 결합을 최소화 100 μg / ML의 최종 농도에 아비딘을 추가하고 4 ℃에서 15 분 동안 회전하려면 <ol><li> 단계 1.10에서 가교 수지는 4 ° C에서 장기간 보관 한 경우에, FO 400 XG에서 원심 분리에 의해 수지를 상환4 ° C에서 R 1 분, 상층 액을 버리고 TBST 1 ㎖​​로 수지를 세척한다. 원심 분리를 반복 세척 먼저 TBST로 다음 TBS와 두 번 더, 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 1 분 400 XG에 튜브를 원심 분리기 및 초과 TBS를 제거하여 원래 볼륨을 조정합니다. </li></ol></li><li> 볼 텍싱에 의해 가교 된 패 혈성-Tactin 수지에 resuspend. 즉시 컷 피펫 팁을 사용하여 미끼 단백질 샘플이 들어있는 튜브에 수지 현탁액의 50 μl를 추가하고 4 ℃에서 또 다른 30 ​​분 동안 회전 </li><li> 기다리는 동안, 55 ° C에 thermomixer을 설정하고 단계 3.1에서 사용하기 위해 용출 버퍼 500 μl를 예열. </li><li> 4 ℃에서 1 분 400 XG에 원심 분리기 뜨는을 취소하고 미리 냉각 세척 버퍼 1 중 1 ㎖를 4 ° C에서 5 분 동안 회전에 수지를 씻어. 원심 분리를 반복하고 단계를 세 번 씻는다. 마지막 단계에서, 세척 버퍼 # 2 250 μL의 수지를 재현 탁. </li><li> TR<html> 신선한 스핀 열 수지 현탁액을 ansfer. 세척 버퍼 # 2의 또 다른 250 μL의 튜브에 남아있는 수지를 재현 탁하고 같은 C 럼에 전송할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 400 XG에 원심 분리기, 흐름을 통해 폐기하고 신선한 돌고래 코 2 ㎖ 튜브에 열을 전송합니다. 아래의 용출 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> 특정 단백질 복합체의 3. 용출 <ol><li> 스핀 컬럼에 2.4 단계에서 예열 된 용출 버퍼 150 μl를 추가합니다. </li><li> 1,400 rpm으로 흔들어, 55 ° C에서 5 분 thermomixer에 품어. </li><li> 실온에서 1 분 1,500 XG에 원심 분리기. </li><li> 열을 버리고 ≤ -20 ℃에서 정제 된 표적 단백질을 저장 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598"><tbody><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) </td></tr>0 &quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 나 2 HPO 4 </td><td style="width:299px;"> 10 mM의 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KH 2 PO 4 </td><td style="width:299px;"> 2mM의 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 염화나트륨 </td><td style="width:299px;"> 137 밀리 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 의 KCl </td><td style="width:299px;"> 2.7 mM의 </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> (섹션 1.4의 pH 8.0) 달리 명시되지 않는 pH는 7.4로 조정 </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> 트리스 (TBS)를 완충 식염수 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 트리스 - 염산, pH 7.4의 </td><td style="width:299px;"> 50 mM의 </td></tr><tr height="20"><td hei<html> GHT = &quot;20&quot;스타일 = &quot;높이 : 20px의 폭 : 299px;&quot;&gt; 염화나트륨 </td><td style="width:299px;"> 150 밀리미터 </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> 트리스는 트윈 20 (TBST)와 완충 식염수 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 트리스 - 염산, pH 7.4의 </td><td style="width:299px;"> 50 mM의 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 염화나트륨 </td><td style="width:299px;"> 150 밀리미터 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 트윈 20 </td><td style="width:299px;"> 0.1 % (V / V) </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> 바인딩 버퍼 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 트리스 - 염산, pH를 8.0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM의 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 염화나트륨 </td>X; &quot;&gt; 550 밀리미터 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 불화 나트륨 </td><td style="width:299px;"> 5 mM의 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0.5 ㎜ </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 글리세린 </td><td style="width:299px;"> 10 % (V / V) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0.1 ㎜ </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> 버퍼 # 1을 씻으 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 트리스 - 염산, pH를 8.0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM의 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 염화나트륨 </td><td style="width:299px;"> 500 밀리미터 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 불화 나트륨 </<html> TD&gt; <td style="width:299px;"> 5 mM의 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0.4 ㎜ </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 이게 팔 CA-630 </td><td style="width:299px;"> 0.2 % (V / V) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 글리세린 </td><td style="width:299px;"> 5 % (V / V) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0.1 ㎜ </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> 버퍼 # 2를 세척 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 트리스 - 염산, pH를 8.0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM의 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 염화나트륨 </td><td style="width:299px;"> 150 밀리미터 </td></tr><tr height="20">2 &quot;높이 =&quot;20 &quot;스타일 =&quot;높이 : 20px의 폭 : 597px; &quot;&gt; 용출 버퍼 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> 트리스 - 염산, pH를 8.0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM의 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:299px;"> SDS </td><td style="width:299px;"> 1 % (W / V) </td></tr></tbody></table> 표 1. 본 연구에 사용 된 버퍼.

<ol><li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li>
<li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li>
<li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li>
<li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li>
<li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li>
<li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+biochemical+characterization%2C+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li>
<li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+from+an+affinity+column%3A+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li>
<li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li>
<li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li>
<li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63(2011).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45(2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

상기 프로토콜은 비오틴 또는 강한 변성제를 포함하지 않는 임의의 적절한 버퍼에 대한 관심 및 관련 착체의 트윈-Strep의 태그 미끼 단백질을 정제하는데 사용될 수있다. 프로토콜의 현재 버전에서, 결합 및 세척이 높은 염과 비 이온 세제의 존재하에 비교적 엄격한 조건하에 수행된다. 이 적은 배경을 초래하지만, 깨지기 쉬운 단백질 복합체는 이러한 조건에서 해리 수 있습니다. 이러한 낮은 친화 단지를 보존하기 위해 소금 농도가 저하 될 수 있고, 비이 온성 세제 버퍼를 바인딩 및 세척에서 감소 또는 생략 할 수있다. 트윈 Strep의 태그 시스템의 가장 큰 장점은 설계 스트렙 타비 딘도 일괄 처리에서 표적 단백질 및 그 복합체를 효율적으로 한 단계 정화를 허용 (연쇄상 구균 - Tactin) 1, 2,에있는 작은 (3kDa) 탠덤 태그의 높은 궁합 모드. 때문에 트윈 패 혈성 태그의 강한 바인딩패 혈성-Tactin으로, 수지는 높은 표적 단백질 순도 결과 높은...

최근 몇 년 동안, 패 혈성 태그 기술은 단백질 체학 및 구조 생물학을 포함한 생물 의학 연구의 많은 분야에서 널리 사용되고있다. 짧은 Strep의 태그 펩티드로 재조합 단백질의 융합에 의존이 단백질 정제 기술은, 패 혈성-Tactin 향상된 펩티드 결합능과 스트렙 타비 딘의 유전 공학적 변형을 운반 궁합 행렬들의 출현으로 성숙. 1,2 트윈 패 혈성 태그 또는 SIII 태그, 전시 재조합 단백질을보다 효율적으로 정화를 보장, 단 하나의 패 혈성 태그를 포함하는보다 연쇄상 구균 - Tactin 행렬에 대한 높은 선호도와 지정 패 혈성 태그 II의 두 복사본을 포함하는 융합 단백질 연관된 바인딩 파트너. 그러나, 패 혈성-Tactin에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질의 높은 친화력은 또한 단점이있다. 과량의 비타민 B 복합체와 단백질의 경쟁 용출 대상 단백질 수율 감소로 이어지는, 불완전 할 수 있습니다. M광석 효율적인 대안 SDS와 용출이지만, 프로테오믹스 분석 분석 호환되지 수지에서 발표 연쇄상-Tactin와 바람직하지 않은 샘플의 오염으로 이어집니다. 이 논문은 제 화학적 가교에 의하여 패 혈성-Tactin의 수지 - 결합 사량을 안정화 한 후 얻어진 가교 수지와 트윈 연쇄상-태그 된 단백질과 관련 복합체를 용출 SDS를 사용하여이 제한을 극복하는 기술을 제시한다. 따라서, 충분한 단백질 수율함으로써 질량 분석에 의한 추가 분석을 허용 연쇄상-Tactin 샘플 오염없이 달성 될 수있다. 이 방법은 표면에 노출 된 SIII 태그 3 트윈 패 혈성 태그 (아미노산 서열 WSHPQFEK (GGGS) 각각 3 WSHPQFEK 및 SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK) 어떤 재조합 융합 단백질의 정제를 위해 적당하다. 단백질은 동물, 식물 또는 세균 기원 일 수 있으며 전체 셀 중 하나로부터 단리 될 수있다해물이나 농축 세포 기관의 분수. 예를 들어, 우리는 여기에 PVA에 감염된는 담배 benthamiana 식물의 핵 부분에서 감자 바이러스 A (PVA) 4 SIII 태그가 단백질 VPG-PRO의 정화에 대해 설명합니다. 이전에 다음과 같이 수정하여, 5 바와 같이 핵 분획을 단리 하였다 : 세포를 포름 알데히드로 처리되지 않은, 나트륨 부티레이트를 5 mM의 불소화 나트륨으로 모든 버퍼에 치환하여, 완전 프로테아제 억제제 PMSF로 치환하고, 추출 트리톤 X-100 농도 버퍼 # 2는 0.3 %로 감소 하였다 (V / V) 및 (추출 버퍼 # 3) 자당 쿠션을 통해 원심 분리하여 얻은 핵 펠릿 사전 냉장 바인딩 버퍼의 1.45 ㎖에 재현 탁하고, 4 ℃에서 1.5 시간 동안 회전 SIII-태그 미끼 단백질과 관련된 단지 (미끼 단백질 샘플)를 포함하는 결과 핵 추출물 (섹션 2 참조) 아래에 설명 된 프로토콜에 따라 처리되었습니다.

<table><tbody><tr><td>비스(설포숙시니미딜) 수산염(BS3), No-Weigh 형식, 8 x 2 mg</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>21585</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com 주의: 유해 물질. 심한 호흡기, 피부 및 눈에 자극을 일으킵니다. 보호 장갑과 보안경을 착용하십시오.</a></td></tr><tr><td>Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)</td><td>IBA</td><td>2-1505</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr><tr><td>Spin-X 원심분리기 튜브 필터, 셀룰로오스 아세테이트 막, 기공 크기 0.45 &mu; m, 비멸균</td><td>Costar (Corning)</td><td>8163</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Dolphin-nose tubes</td><td>Costar (Corning)</td><td>3213</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Avidin&nbsp;</td><td>IBA</td><td>2-0204</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr></tbody></table>

한 단계 연쇄상-tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (bs3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

설계 스트렙 타비 딘 (연쇄상-Tactin)를 운반하는 수지에 패 혈성 태그가 융합 단백질의 친 화성 정제는 생리 학적 조건에서 단백질 복합체의 분리를위한 널리 사용되는 방법이되고있다. 트윈 패 혈성 태그 또는 SIII 태그를 지정 패 혈성 태그 II의 두 복사본을 포함하는 융합 단백질 따라서보다 효율적인 단백질 정제를 허용, 단 하나의 패 혈성 태그를 포함하는 사람에 비해 연쇄상-Tactin에 대한 높은 친 화성의 장점이 있습니다. 그러나, 이러한 장점은 비오틴과 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질의 용출이 낮은 단백질 복구에 이르는, 불완전 할 수 있다는 사실에 의해 상쇄된다. 복구 극적 도데 실 황산나트륨 (SDS)으로 변성 용출을 사용함으로써 개선 될 수 있지만 하류 단백질체 분석으로 분석 호환되지 수지로부터 방출 연쇄상-Tactin 오염을 샘플링 리드. 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 방법 연쇄상-Tactin의 그것에 수지 결합 사량을 개발했습니다제 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 레이트 (BS3)와 가교하고, 생성 된 가교 된 수지를 다음 번의 배치 정제 단계에서 목적 단백질 복합체를 정제하는 데 사용함으로써 안정화된다. 패 혈성-Tactin 오염의 부재는 질량 분석에 의한 하류 단백질 분석을 허용하는 동안 SDS와 효율적인 용출, 좋은 단백질 복구를 보장합니다. 개념의 증거로서, 우리는 바이러스에 감염된 N.의 핵에서 VPG-프로 SIII 태그가 바이러스 성 단백질의 정제를 위해 여기 프로토콜을 설명 BS3으로 가교 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지를 사용한 benthamiana 식물. 동일한 프로토콜은 또한 어떤 트윈 연쇄상-태그 단백질을 정제 및 생리 바인딩 파트너를 특성화하는데 사용될 수있다.

정화 절차를 개략적으로 서로 다른 기존의 정제 방법과 관련된 문제의 표현과 함께,도 1에 도시되어있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> 그림 1. 정화 절차의 도식 표현. 워크 플로는 공유가 가교 수지에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 미끼 단백질과 연관된 복합체의 결합, BS3으로 가교를 통해 수지 결합 패 혈성-Tactin의 사량의 안정화를 포함 ,, 멀리 언 바운드 단백질의 세척 1 % SDS 및 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석기 (LC-MS/MS)에 의해 자신의 분석과 구체적으로 결합 단백질 단지의 용출을 변성. 미끼 단백질에 두 개의 빨간색 분야는 트윈 Strep의 태그를...

방법은 (연쇄상 구균 - Tactin) 수지가 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 (BS3)와 가교 수정 스트렙 타비 딘에 트윈 패 혈성 태그가 융합 단백질 및 특정 단지의 효율적인 정제에 설명되어 있습니다. 방법은 빠른 속도, 좋은 표적 단백질의 회수 및 고순도의 이점을 갖고, 질량 분석법에 의한 후속 분석과 호환된다.

한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

안녕하세요, 핀란드 헬싱키 대학교의 Christina McKennan입니다. 특정 단백질 복합체를 특성화하는 과정에서의 어려움 중 하나는 그 분자 구성을 결정하는 것입니다. 이를 위해서는 세포 환경으로부터 복합체를 분리하고 정제하는 방법의 개발이 필요합니다.미생물 연구 분야는 식물 바이러스와 숙주의 상호작용이며, 따라서 우리는 감염 중에 형성되는 다양한 바이러스 리포놈 핵단백질 복합체에 관심을 가지고 있습니다. 과거에 우리는 어피니티 태그 기반 정제법을 사용하여 이러한 복합체들을 성공적으로 연구했습니다. Twin-strep 태그가 가장 우수한 태그 중 하나임이 입증되었습니다.하지만 우리는 낮은 수율과 같은 몇 가지 제한 사항을 확인하였으며, 이에 따라 이 방법을 개선하고자 했습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Mata이며 실험 프로토콜 과정을 안내해 드리겠습니다. 그전에 먼저, 이 방법의 개요에 대해 설명해 드리겠습니다.본 연구에서는 twin strep-tag가 붙은 단백질과 그 생리학적 결합 파트너 사이의 특정 복합체를 정제하기 위해 strep-tactin macro prep beads를 사용합니다. 녹색은 strep-tag가 붙은 tetramer를, 청색은 twin strep-tag 단백질을, 주황색은 그 결합 파트너를, 그리고 적색은 두 개의 strep-tag 복사본을 나타냅니다.전형적인 방식에서는 회색으로 표시된 결합되지 않은 단백질들을 세척하여 제거합니다. 결합된 복합체는 분홍색으로 표시된 biotin을 통해 경쟁적으로 용출됩니다. 하지만 이 방식을 사용했을 때, 결합된 복합체의 일부만이 strep tachin 비드에서 성공적으로 분리되어 용출이 불완전하게 일어나는 것을 관찰했습니다.이는 표적 단백질의 회수율을 낮추는 결과로 이어집니다. 분석을 더욱 어렵게 만드는 점은, SDS를 이용한 변성 용출을 통해 표적 단백질의 회수율을 개선할 수 있다는 것입니다. 변성된 twin strep tag 미끼 단백질 주변에 Miss cell이 형성됩니다.결합 파트너와 해리된 strept actin 단량체 주변을 확인하십시오. 질량 분석법으로 시료를 추가 분석해야 하는 경우, 방출된 strept actin으로 인한 시료 오염은 허용되지 않습니다. 이러한 시료 오염 문제를 해결하기 위해, 우리는 화학적 가교 결합을 통해 strep tachin 사량체를 먼저 안정화하는 방법을 개발했습니다.결과물로 얻은 가교 결합 수지는 미끼 단백질과 그 결합 파트너 샘플을 정제하는 데 사용되며, SDS를 이용한 용출은 높은 단백질 회수율을 보장하는 한편 수지의 화학적 가교 결합은 샘플 오염 없이 strept 태그가 붙은 미끼 단백질과 그 결합 파트너의 용출을 보장합니다. 방출된 strept을 포함하는 밀폐된 마이크로 튜브 하나에 2 mg의 BS3 가교제를 넣고 실온에서 평형화합니다.피펫 팁의 끝부분을 잘라 레진 전송용 팁을 준비합니다. Strep-Tactin 및 Macro-Prep 레진을 짧고 강하게 흔들어 재현탁시킨 후, 즉시 현탁액 600 µL를 CoStar Spin-X 필터 컬럼으로 옮겨 4,000 RPM에서 30초 동안 원심분리합니다. 실온에서 450 µL의 인산염 완충 식염수를 첨가합니다. 이 단계의 목적은 1차 아민 Tris를 비반응성 인산염으로 교체하는 것입니다.통과액을 버립니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 내용물을 혼합합니다. 원심분리와 세척 단계를 2회 반복하고, 레진을 430 µL의 P-B-S-P-H 8에 둡니다.마지막 원심분리가 끝난 후, 100 µL의 Milli-Q Water가 담긴 피펫 팁으로 micro tube의 호일을 뚫습니다. 가볍게 피펫팅하여 BS3 파우더를 물에 녹입니다. BS3가 완전히 용해되면 즉시 해당 용액 20 µL를 SpinX 컬럼에 첨가합니다. 내용물이 적절히 혼합되었는지 확인하십시오.레진이 BS three 용액과 적절히 혼합되도록 확인하며, 상온에서 컬럼을 30분 동안 회전시킵니다. 반응을 중단시키기 위해 염산으로 pH 7.5로 조정한 3 M Tris를 6 µL 첨가합니다. 상온에서 컬럼을 15분 더 회전시킨 후, 4,000 RPM에서 30초 동안 원심분리합니다.실온에서, 가교된 수지를 450 µL의 tween 20이 포함된 tris buffered saline에 현탁시키고 통과액은 버립니다. 원심분리와 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 마지막 단계에서 수지를 450 µL의 TBS에 다시 현탁시킵니다. 수지 현탁액을 새 튜브로 옮기고, 컬럼에 남아 있는 수지를 다른 450 µL의 TBS로 다시 현탁시켜 동일한 튜브로 옮깁니다.컬럼에서 튜브로 레진이 최대한 전이되도록 마지막 단계를 한 번 더 반복합니다. 레진 현탁액이 담긴 튜브를 실온에서 10분 동안 방치한 후, 부피를 600 microliters로 조정합니다. 과잉의 TBS를 제거함으로써 레진을 즉시 사용하거나, 얼리지 않은 상태로 4°C에서 보관할 수 있습니다.이 방법은 모든 twin strep tag 융합 단백질 및 관련 복합체의 정제에 적합합니다. 단백질은 동물, 식물 또는 세균 유래일 수 있으며, 전체 세포 용해물 또는 농축된 세포소기관 분획물로부터 분리할 수 있습니다. 본 예시에서는 바이러스에 감염된 식물의 핵 분획물로부터 감자 바이러스 A의 twin strep tag 단백질인 VPG Pro를 분리합니다. 먼저 결합 버퍼에 희석된 미끼 단백질 샘플 1 mL를 4°C에서 13,000 RPM으로 10분 동안 원심분리하는 것으로 시작하십시오.내인성 비오틴화 단백질이 strep tact 및 레진에 결합하는 것을 최소화하기 위해 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 avadon을 첨가하고, 내용물이 충분히 혼합되었는지 확인합니다. 4 °C에서 15분 동안 회전 혼합합니다.보텍싱을 통해 가교 결합된 레진을 재현탁하고, 컵 피펫 팁을 사용하여 레진 현탁액 50 µL를 베이트 단백질 샘플이 들어 있는 튜브에 즉시 첨가합니다. 기다리는 동안 4 °C에서 30분 동안 더 회전시킵니다. 써모 믹서를 55 °C로 설정하고, 용출 단계에서 사용할 Elu 버퍼 500 µL를 예열한 후 4 °C에서 2000 RPM으로 1분 동안 원심 분리합니다.상층액을 버리고 미리 냉각시킨 세척 버퍼 1(wash buffer 1) 1 mL로 레진을 세척합니다. 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다. 마지막 단계에서 원심 분리 및 세척 단계를 3회 반복합니다.레진을 250 µL의 세척 완충액 2번에 다시 현탁하고, 레진 현탁액을 새로운 spinx 컬럼으로 옮깁니다. 튜브에 남아 있는 레진을 추가로 250 µL의 세척 완충액 2번에 다시 현탁하여 동일한 컬럼으로 옮긴 후, 4 °C에서 2000 RPM으로 3분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 새로운 dolphin nose 2 mL 튜브로 옮기고 통과액은 버립니다.즉시 다음의 용출 단계로 진행하십시오. 예열된 용출 버퍼 150 µL를 spinx 컬럼에 첨가합니다. 해당 용액을 thermo mixer에서 55 °C로 5분 동안 1400 RPM으로 흔들어 섞으며 배양합니다. 실온에서 4,000 RPM으로 1분간 원심분리한 후 컬럼을 폐기하십시오.정제된 표적 단백질은 이제 추가 분석을 위한 준비가 되었으며 -20 °C 이하에서 보관할 수 있습니다. 이미지는 biotin을 이용한 strept actin macro prep resin으로부터의 단백질 용출이 SDS를 이용한 용출에 비해 불완전함을 보여줍니다. western blot 신호 강도의 차이는 두 가지 용출 기술로 얻은 단백질 수율의 차이를 반영합니다. SDS를 이용한 용출이 biotin을 이용한 용출보다 훨씬 효율적이지만, 이는 방출된 strept actin으로 인한 시료 오염을 초래합니다.이미지는 Strept actin Macro prep resin에서 얻은 SDS EITs의 은 염색 겔(silver stain gel)을 보여주며, 왼쪽 레인에는 방출된 strept actin이 존재하지만 오른쪽 레인에는 없음을 확인할 수 있습니다. 왼쪽 시료는 가교 결합되지 않은 resin에서 용출되었으며, 오른쪽 시료는 BS three로 가교 결합된 resin에서 용출되었습니다. 이러한 결과에 기초하여, 우리는 BS three를 이용한 가교 결합이 SDS 용출 과정 동안 resin으로부터의 strept actin 방출을 방지한다는 결론을 내렸습니다.본 예제에서는 bait 단백질인 VPG PRO와 그 결합 파트너들을 정제하기 위해 BS3로 가교 결합된 Streptactin macro prep resin을 사용하였습니다. 정제된 샘플의 일부를 취하여 단백질 식별을 위한 질량 분석(mass spec analysis)을 수행하였습니다. 음성 대조군에서 특정 밴드가 나타나지 않은 것은 풀다운(pull down)의 특이성을 확인시켜 줍니다.아래쪽 밴드는 베이트 단백질인 VPG PRO에 해당하며, 위쪽 밴드는 질량 분석법으로 확인된 결합 파트너 NIB 복제본에 해당합니다. 지금까지 스트렙-탁틴 수지로 인한 변성 및 용출과 관련된 한계를 극복하기 위해 화학적 가교 결합을 어떻게 사용할 수 있는지 보여드렸습니다. 이 방법은 단백질-단백질 복합체의 정제뿐만 아니라, 포름알데히드로 가역적 가교 결합이 된 것을 포함하여 핵산이 포함된 단백질 복합체를 정제하는 데에도 사용할 수 있습니다.마지막으로, 이 방법은 strep tech 막 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있습니다. 계면활성제로 가용화합니다. 이러한 소수성 단백질을 용액 상태로 유지하기 위해서는 계면활성제가 필요합니다.하지만, 이러한 성분의 존재는 스트렙타비딘의 용출로 인한 샘플 오염을 유발할 수 있습니다. 온화한 비오틴 용출법을 사용할 때라도, 레진의 가교 결합이 샘플 오염 문제의 해결책이 될 수 있다고 생각합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 감사합니다.

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여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

소설과 고효율 두 단계 친화도 크로마 토그래피 프로토콜이 개발되었고 자세하게 설명되어 있습니다. 방법은 두 개의 본질적 동질성과 작은 정화 태그를 기반으로하고 다른 특성을 가진 대상 단백질의 다양한 적용됩니다.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

출처: Murata, T., et al. Streptococcus mutans에서 고분자량 단백질의 정제. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 Streptococcus mutans에서 분비되는 폴리히스티딘 태그 단백질의 정제를 위한 단계별 절차를 보여줍니다.

Streptococcus mutans에서 폴리히스티딘 태그 단백질을 정제하는 절차

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

TAP(Tandem Affinity Purification) 방법은 단백질체학을 위해 주로 진핵생물인 세포 추출물에서 천연 복합체를 분리하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 구조 연구를 위한 천연 복합체의 정제에 최적화된 TAP 방법 프로토콜을 제시합니다.

탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

Botin streptavidin 전략을 사용 하 여 정화 RNA 또는 단백질 복합물은 eluted 더 정화와 기능 분석에 대 한 부적 절 한 형태로 변성 조건에서 솔루션. 여기, 우리가 네이티브 및 완전 한 기능 RNA 또는 단백질 복합물 저조한 RNA와 부드러운 UV 차입 단계 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여이 전략의 설명.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.

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학습하세요 BS3 가교 수정 스트렙타딘 수지를 이용한 트윈-스트렙 태그 융합 단백질 정화법. 이 방법은 바이러스 리보핵단백질 복합체를 고효율로 분리하여 질량 분석이 가능한 고순도 샘플을 제공합니다.

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