한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

안녕하세요, 핀란드 헬싱키 대학교의 Christina McKennan입니다. 특정 단백질 복합체를 특성화하는 과정에서의 어려움 중 하나는 그 분자 구성을 결정하는 것입니다. 이를 위해서는 세포 환경으로부터 복합체를 분리하고 정제하는 방법의 개발이 필요합니다.

미생물 연구 분야는 식물 바이러스와 숙주의 상호작용이며, 따라서 우리는 감염 중에 형성되는 다양한 바이러스 리포놈 핵단백질 복합체에 관심을 가지고 있습니다. 과거에 우리는 어피니티 태그 기반 정제법을 사용하여 이러한 복합체들을 성공적으로 연구했습니다. Twin-strep 태그가 가장 우수한 태그 중 하나임이 입증되었습니다.

하지만 우리는 낮은 수율과 같은 몇 가지 제한 사항을 확인하였으며, 이에 따라 이 방법을 개선하고자 했습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Mata이며 실험 프로토콜 과정을 안내해 드리겠습니다. 그전에 먼저, 이 방법의 개요에 대해 설명해 드리겠습니다.

본 연구에서는 twin strep-tag가 붙은 단백질과 그 생리학적 결합 파트너 사이의 특정 복합체를 정제하기 위해 strep-tactin macro prep beads를 사용합니다. 녹색은 strep-tag가 붙은 tetramer를, 청색은 twin strep-tag 단백질을, 주황색은 그 결합 파트너를, 그리고 적색은 두 개의 strep-tag 복사본을 나타냅니다.

전형적인 방식에서는 회색으로 표시된 결합되지 않은 단백질들을 세척하여 제거합니다. 결합된 복합체는 분홍색으로 표시된 biotin을 통해 경쟁적으로 용출됩니다. 하지만 이 방식을 사용했을 때, 결합된 복합체의 일부만이 strep tachin 비드에서 성공적으로 분리되어 용출이 불완전하게 일어나는 것을 관찰했습니다.

이는 표적 단백질의 회수율을 낮추는 결과로 이어집니다. 분석을 더욱 어렵게 만드는 점은, SDS를 이용한 변성 용출을 통해 표적 단백질의 회수율을 개선할 수 있다는 것입니다. 변성된 twin strep tag 미끼 단백질 주변에 Miss cell이 형성됩니다.

결합 파트너와 해리된 strept actin 단량체 주변을 확인하십시오. 질량 분석법으로 시료를 추가 분석해야 하는 경우, 방출된 strept actin으로 인한 시료 오염은 허용되지 않습니다. 이러한 시료 오염 문제를 해결하기 위해, 우리는 화학적 가교 결합을 통해 strep tachin 사량체를 먼저 안정화하는 방법을 개발했습니다.

결과물로 얻은 가교 결합 수지는 미끼 단백질과 그 결합 파트너 샘플을 정제하는 데 사용되며, SDS를 이용한 용출은 높은 단백질 회수율을 보장하는 한편 수지의 화학적 가교 결합은 샘플 오염 없이 strept 태그가 붙은 미끼 단백질과 그 결합 파트너의 용출을 보장합니다. 방출된 strept을 포함하는 밀폐된 마이크로 튜브 하나에 2 mg의 BS3 가교제를 넣고 실온에서 평형화합니다.

피펫 팁의 끝부분을 잘라 레진 전송용 팁을 준비합니다. Strep-Tactin 및 Macro-Prep 레진을 짧고 강하게 흔들어 재현탁시킨 후, 즉시 현탁액 600 µL를 CoStar Spin-X 필터 컬럼으로 옮겨 4,000 RPM에서 30초 동안 원심분리합니다. 실온에서 450 µL의 인산염 완충 식염수를 첨가합니다. 이 단계의 목적은 1차 아민 Tris를 비반응성 인산염으로 교체하는 것입니다.

통과액을 버립니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 내용물을 혼합합니다. 원심분리와 세척 단계를 2회 반복하고, 레진을 430 µL의 P-B-S-P-H 8에 둡니다.

마지막 원심분리가 끝난 후, 100 µL의 Milli-Q Water가 담긴 피펫 팁으로 micro tube의 호일을 뚫습니다. 가볍게 피펫팅하여 BS3 파우더를 물에 녹입니다. BS3가 완전히 용해되면 즉시 해당 용액 20 µL를 SpinX 컬럼에 첨가합니다. 내용물이 적절히 혼합되었는지 확인하십시오.

레진이 BS three 용액과 적절히 혼합되도록 확인하며, 상온에서 컬럼을 30분 동안 회전시킵니다. 반응을 중단시키기 위해 염산으로 pH 7.5로 조정한 3 M Tris를 6 µL 첨가합니다. 상온에서 컬럼을 15분 더 회전시킨 후, 4,000 RPM에서 30초 동안 원심분리합니다.

실온에서, 가교된 수지를 450 µL의 tween 20이 포함된 tris buffered saline에 현탁시키고 통과액은 버립니다. 원심분리와 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 마지막 단계에서 수지를 450 µL의 TBS에 다시 현탁시킵니다. 수지 현탁액을 새 튜브로 옮기고, 컬럼에 남아 있는 수지를 다른 450 µL의 TBS로 다시 현탁시켜 동일한 튜브로 옮깁니다.

컬럼에서 튜브로 레진이 최대한 전이되도록 마지막 단계를 한 번 더 반복합니다. 레진 현탁액이 담긴 튜브를 실온에서 10분 동안 방치한 후, 부피를 600 microliters로 조정합니다. 과잉의 TBS를 제거함으로써 레진을 즉시 사용하거나, 얼리지 않은 상태로 4°C에서 보관할 수 있습니다.

이 방법은 모든 twin strep tag 융합 단백질 및 관련 복합체의 정제에 적합합니다. 단백질은 동물, 식물 또는 세균 유래일 수 있으며, 전체 세포 용해물 또는 농축된 세포소기관 분획물로부터 분리할 수 있습니다. 본 예시에서는 바이러스에 감염된 식물의 핵 분획물로부터 감자 바이러스 A의 twin strep tag 단백질인 VPG Pro를 분리합니다. 먼저 결합 버퍼에 희석된 미끼 단백질 샘플 1 mL를 4°C에서 13,000 RPM으로 10분 동안 원심분리하는 것으로 시작하십시오.

내인성 비오틴화 단백질이 strep tact 및 레진에 결합하는 것을 최소화하기 위해 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 avadon을 첨가하고, 내용물이 충분히 혼합되었는지 확인합니다. 4 °C에서 15분 동안 회전 혼합합니다.

보텍싱을 통해 가교 결합된 레진을 재현탁하고, 컵 피펫 팁을 사용하여 레진 현탁액 50 µL를 베이트 단백질 샘플이 들어 있는 튜브에 즉시 첨가합니다. 기다리는 동안 4 °C에서 30분 동안 더 회전시킵니다. 써모 믹서를 55 °C로 설정하고, 용출 단계에서 사용할 Elu 버퍼 500 µL를 예열한 후 4 °C에서 2000 RPM으로 1분 동안 원심 분리합니다.

상층액을 버리고 미리 냉각시킨 세척 버퍼 1(wash buffer 1) 1 mL로 레진을 세척합니다. 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다. 마지막 단계에서 원심 분리 및 세척 단계를 3회 반복합니다.

레진을 250 µL의 세척 완충액 2번에 다시 현탁하고, 레진 현탁액을 새로운 spinx 컬럼으로 옮깁니다. 튜브에 남아 있는 레진을 추가로 250 µL의 세척 완충액 2번에 다시 현탁하여 동일한 컬럼으로 옮긴 후, 4 °C에서 2000 RPM으로 3분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 새로운 dolphin nose 2 mL 튜브로 옮기고 통과액은 버립니다.

즉시 다음의 용출 단계로 진행하십시오. 예열된 용출 버퍼 150 µL를 spinx 컬럼에 첨가합니다. 해당 용액을 thermo mixer에서 55 °C로 5분 동안 1400 RPM으로 흔들어 섞으며 배양합니다. 실온에서 4,000 RPM으로 1분간 원심분리한 후 컬럼을 폐기하십시오.

정제된 표적 단백질은 이제 추가 분석을 위한 준비가 되었으며 -20 °C 이하에서 보관할 수 있습니다. 이미지는 biotin을 이용한 strept actin macro prep resin으로부터의 단백질 용출이 SDS를 이용한 용출에 비해 불완전함을 보여줍니다. western blot 신호 강도의 차이는 두 가지 용출 기술로 얻은 단백질 수율의 차이를 반영합니다. SDS를 이용한 용출이 biotin을 이용한 용출보다 훨씬 효율적이지만, 이는 방출된 strept actin으로 인한 시료 오염을 초래합니다.

이미지는 Strept actin Macro prep resin에서 얻은 SDS EITs의 은 염색 겔(silver stain gel)을 보여주며, 왼쪽 레인에는 방출된 strept actin이 존재하지만 오른쪽 레인에는 없음을 확인할 수 있습니다. 왼쪽 시료는 가교 결합되지 않은 resin에서 용출되었으며, 오른쪽 시료는 BS three로 가교 결합된 resin에서 용출되었습니다. 이러한 결과에 기초하여, 우리는 BS three를 이용한 가교 결합이 SDS 용출 과정 동안 resin으로부터의 strept actin 방출을 방지한다는 결론을 내렸습니다.

본 예제에서는 bait 단백질인 VPG PRO와 그 결합 파트너들을 정제하기 위해 BS3로 가교 결합된 Streptactin macro prep resin을 사용하였습니다. 정제된 샘플의 일부를 취하여 단백질 식별을 위한 질량 분석(mass spec analysis)을 수행하였습니다. 음성 대조군에서 특정 밴드가 나타나지 않은 것은 풀다운(pull down)의 특이성을 확인시켜 줍니다.

아래쪽 밴드는 베이트 단백질인 VPG PRO에 해당하며, 위쪽 밴드는 질량 분석법으로 확인된 결합 파트너 NIB 복제본에 해당합니다. 지금까지 스트렙-탁틴 수지로 인한 변성 및 용출과 관련된 한계를 극복하기 위해 화학적 가교 결합을 어떻게 사용할 수 있는지 보여드렸습니다. 이 방법은 단백질-단백질 복합체의 정제뿐만 아니라, 포름알데히드로 가역적 가교 결합이 된 것을 포함하여 핵산이 포함된 단백질 복합체를 정제하는 데에도 사용할 수 있습니다.

마지막으로, 이 방법은 strep tech 막 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있습니다. 계면활성제로 가용화합니다. 이러한 소수성 단백질을 용액 상태로 유지하기 위해서는 계면활성제가 필요합니다.

하지만, 이러한 성분의 존재는 스트렙타비딘의 용출로 인한 샘플 오염을 유발할 수 있습니다. 온화한 비오틴 용출법을 사용할 때라도, 레진의 가교 결합이 샘플 오염 문제의 해결책이 될 수 있다고 생각합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 감사합니다.