Name: 생체 외 분석에서 집계 Hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 학습하세요 생체 외 분석에서 비수정 및 과인산화 tau 단백질의 응집 동역학을 비교하는 방법을. 티오플라빈 형광을 사용하여 알츠하이머병의 분자 메커니즘을 연구하고 치료제 선별을 위한 기반을 제공합니다.

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이 작업은 MHK에 대한 National Institute on Aging(AG039768)의 지원을 받았습니다. 악기를 아낌없이 제공해 주신 Thomas Sharkey 박사와 Honggao Yan 박사님, 그리고 기술 지원을 해주신 Sean Weise와 Yan Wu 박사님께 감사드립니다.

시약 1. 준비 <ol><li> 응집 버퍼 준비 (20 mM 트리스, pH가 7.4, 100 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA). 개월 동안 실온에서 안정을 저장합니다. 사용하기 전에 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 보충합니다. 주 : HEPES 계 완충액 (10 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 mM의 EDTA, 5 mM의 DTT)도 타우 응집 유사한 결과를 생성한다. </li><li> T thioflavin 0.22 μm의 살균 필터 단위로 S 재고 (집계 완충 용액 3 mM의) 솔루션 및 필터 thioflavin 준비합니다. 달 동안, 알루미늄 호일 안정적인 덮여 튜브에서 -20 ° C에서 보관. </li><li> (300 μM, 집계 완충 용액)을 헤파린 주식 솔루션을 준비합니다. -20 ° C에서 보관, 개월간 안정. </li><li> (물에 용해 1 M) 디티 오 트레이 톨 (DTT) 주식을 준비합니다. 1.5 ml의 튜브로 나누어지는. -20 ° C에서 보관하십시오. 집계 분석하기 전에 실온에서 1 M 솔루션을 해동. 이 1,000 배 주식에서, 탈 이온수로 주식을 작업 100 mm의 나누어지는을 준비합니다. 얼음에 남겨주세요준비가 될 때까지. </li><li> C 냉동고 -80 °에서 타우를 제거합니다. 얼음에 해동. 집계 버퍼와 소정의 농도에 타우를 조정합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 20,800 XG에 마이크로 원심의 스핀 미리 형성된 큰 집계를 제거합니다. 이 사전 회전 단계는 단백질 준비의 각 배치의 후속 형광 측정의 일관성을 증가시킨다. 다른 튜브에 뜨는을 전송; 응집 반응을 조립 준비가 될 때까지 얼음에 둡니다. </li></ol> 2. 무 염료, 터미널 분석 주 :이 분석의 응집 반응은 형광 염료의 부재하에 수행된다. 모든 성분을 혼합 한 후, 반응물을 미리 정해진 시간 지점으로 진행시킨다. 분취 량은 집계 반응에서 꺼내 THT 또는 형광 읽기 전에 바인딩 아밀로이드에 대한 THS와 혼합된다. 응집 반응의 초기 부피는 필요한 시점의 수에 의존한다. 이 방법은 REQU 수 있습니다타우 단백질의 다량 반사성이지만 간단, 신속하고, 형광 또는 멀티 웰 플레이트 판독기 (설명 참조)에서 수행 될 수있다. 다음은 단계별 작업이며, 형광 정량 ISA SPEX FluoroMax-2 소형 분광을 사용. <ol><li> 표 1에서와 같이 1.5 ml의 에펜 도르프 튜브에 집약 혼합물을 설정. 각 열은 하나의 시간 지점 측정 충분하다 100 μL 반응에 필요한 성분을 나타낸다. 특정 실험에 필요한 시점에 기초하여 전체 집계 믹스 양을 조정한다. 오류를 피펫 팅을위한 공간을 제공하기 위해 각 구성 요소의 추가로 10 %를 추가합니다. 여기에 표시된 전형적인 반응 포함 헤파린은 아라키돈 산 또는 집계 버퍼에 의해 대체 될 수있다. 반응 혼합물에 1 mm로 DTT를 추가합니다. 전체 반응은 하루 이상 지속되는 경우, 환원 환경을 위해 매일 신선한 DTT (1mm)으로 보충. </li><li> 혼합 튜브를 몇 번 반전. 괞 찮아37 ° C 배양기 또는 물 목욕 각각의 반응을 CE. 교반은 타우 집계 필요하지 않습니다. </li><li> 형광을 측정하기 전에 (컴퓨터 다음, 첫 번째 램프) 분광 켭니다. 참고 : 바로 사용할 수있는 크세논 아크 램프. 그러나 최상의 결과를 기계가 형광을 읽기 전에 약 10 분 동안 워밍업 할 수 있습니다. </li><li> 컴퓨터의 소프트웨어를 시작합니다. <ol><li> 510 nm의 (5 nm의 슬릿)에 인스트루먼트 컨트롤 센터에서 실시간 디스플레이 모드, (2 nm의 슬릿) 450 nm의 설정 여기 파장과 방출 파장을 선택합니다. 닫기 실시간 디스플레이 모드 창은 인스트루먼트 컨트롤 센터로 돌아갑니다. </li><li> 파장 세트를 추가 할 수있는 상부 프레임 정수 파장 분석을 눌러 추가 &gt;&gt; 키를 선택합니다. 1 표준 오차를 설정 인수 매개 변수와 3에 최대 시련, 다음 추가를 클릭합니다. Go!를 클릭하여 데이터 표시를 엽니 다창. </li><li> 데이터 표시 창에서 새 샘플 대화 상자를 열려면 시작 ACQ을 클릭합니다. 샘플 유형에 대해 &quot;알 수없는&quot;를 선택합니다. </li></ol></li><li> 매 100 μL 집계 혼합물에 98 μL 집계 버퍼와 T. 피펫 여러 번 섞어 3 mM의 thioflavin 2 μl를 추가합니다. </li><li> 큐벳 (FCA3, 외부 차원, wxlxh = 12.5 mm X 12.5 mm X 45mm)에 전체 혼합물을 전송합니다. 샘플 실에서 샘플 홀더에 큐벳을 넣고 뚜껑을 닫습니다. 형광 데이터를 수집하려면 실행을 클릭합니다. 데이터를 기록한다. </li><li> 큐벳을 제거하고 솔루션을 가만히 따르다. 증류수 3 배 큐벳을 씻어. 와 큐벳 외부 공기를 불어 건조. </li></ol> 와 염색 3.를 SpectraMax M2 플레이트 리더에 지속적인 모드 분석 주 :이 분석은 형광 염료 또는 THS THT는 aggrega에 포함된다는 점에서 이전의 것과 다른기 반응. 이 반응의 동일한 세트의 연속 측정을 허용한다. (를 SpectraMax M2의 동작 이하 도시 된 바와 같이) 반응으로 인해 반복 사용으로,이 방법은 더 나은 자동 멀티 웰 플레이트 판독기로 이루어진다. 일반 형광 또한 빠른 작동하지만 응집 반응의 측정 주파수 인해 작업의 설명서 특성상 다소 제한적이다. <ol><li> (96 웰 흑색 고체 플레이트, 잘 부피 360 μL, 평바닥) 표 2와 같이 96 웰 플레이트에 응집 믹스를 설정한다. 각 칼럼은 하나로 충분 200 μL 반응에 필요한 성분을 나타낸다 시간 지점 측정. 수회 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 실험의 과정을 통해 매일 신선한를 1mM DTT를 보충. </li><li> 37 ° C에서 96 웰 플레이트를 품어. </li><li> 형광 측정 전에 각 시점에서, 멀티 모드 리더와 마이크로 컴퓨터를 켜. 엄마를위한 충분한 시간을 허용차임에는, 약 10 분간 안정. </li><li> 컴퓨터의 소프트웨어를 시작합니다. 37 ° C로 온도를 설정하고 형광 강도 (FI-최고 읽기) 모드, 510 nm에서 450 nm의 방출 파장에서 설정 여기 파장을 선택합니다. </li><li> 서랍에 96 웰 플레이트를 삽입하고 측정을 시작하기 위해 READ 키를 누릅니다. </li><li> 읽은 후, 플레이트를 제거하고 37 ° C 배양기로 다시 돌아갑니다. 데이터 분석 및 플로팅을위한 Excel 스프레드 시트에 데이터를 복사하여 붙여 넣습니다. </li></ol> 4.와 염색, 지속적인 모드 분석 컴팩트 분광에 <ol><li> 표 3에서 1.5 에펜 도르프 튜브에 집계 혼합물을 설정합니다. 각 열은 한 번에 포인트 측정을 위해 충분하다 200 μL 반응에 필요한 재료를 나타냅니다. </li><li> 혼합 튜브를 몇 번 반전. </li><li> 분광 켜고 단계 2.3 및 2.4에서와 소프트웨어를 설정합니다. </li><li> 전체 혼합 t 이동OA 큐벳. 샘플 실에서 샘플 홀더에 큐벳을 넣고 뚜껑을 닫습니다. 형광 데이터를 수집하려면 실행을 클릭합니다. 데이터를 기록한다. </li><li> 데이터를 실행을 클릭하고 기록하여 적절한 간격으로 계속 읽기. 집계는 고주파수 (예를 들면, 매 30 분 또는 60 초)에서 감시하는 경우, 하나의 측정이 완료 될 때까지 기계 큐벳과의 반응을 그대로 또는 반응 또는 큐벳을 교환하기에 충분한 시간이있을 때. </li><li> 큐벳을 제거하고 솔루션을 가만히 따르다. 증류수 3 배 큐벳을 씻어. 와 큐벳 외부 공기를 불어 건조. </li></ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 상이한 분석 조건으로 의존 인산화 타우 응집 빠른 반응 속도를 감지기구를 보여준다. 단말기 분석에서, 형광 염료 THT는 각 시점에서의 마스터 믹스로부터 제거 반응 부에 첨가된다. 아밀로이드 후 26 형광 측정을 유도 결합된다. 두번째 방법으로 염색 모드 타우 응집은 타우 응집체의 성장을 실시간 자동 평가에 적합한 유형의 반응을 렌더링 또는 THT THS의 존재하에 수행된다. 각 방법마다 장단점이 있습니다. 터미널 모드 반응은 타우 집계에 필요한 만 재료를 수행한다. 희석 thioflavin T 반응물을 혼합하여 본질적으로 대폭 형광 정량 반응을 정지 형광 증가 속도를 느리게. 따라서이 방법은 또한 수동 조작과 호환된다. 그러나 reactio 때문에n이 실질적 THT 첨가 종료시, 타우 다량 응집 곡선을 플롯 요구 될 수있다. 이 방법의 또 다른 잠겨진 반응 혼합물에 빈번한 액세스가 미생물 오염이나 단백질 분해 또는 단백질...

(AD) 알츠하이머 병은 퇴행성 신경 알려진 신경 퇴행성 장애의 큰 컬렉션 중 하나이다. 전형적인 병리 기본 타우 병증은 신경 세포, 성상 세포와 미세 아교 세포 1-4의 신경 섬유 엉킴, NFTS입니다. NFT 밀도는인지 장애 3,5 및 신경 세포의 손실 6와 상관 관계. NFT는 직선 또는 쌍 나선형 필라멘트 (PHF) 7,8를 형성 (이하, &quot;P-타우&quot;이라한다) 주로 hyperphosphorylated 타우 단백질이 포함되어 있습니다. 타우 신경 신호 및 인신 매매 9,10 필수적이다 축삭 수송을 용이하게 생각 미세 소관 관련 단백질이다. 각 타우 분자는 2 ~ 3 정상적인 뇌의 인산염,하지만 타우 병증 환자 (11)의 여러 주름으로 포스 콘텐츠 증가가 포함되어 있습니다. 다중 키나아제는 GSK3β (글리코겐 신타 제 키나제 3β) 및 CDK5 (사이클린 드를 포함 타우 과인산 화에 기여할 가능성이있다늘어진 키나제 5) 12, 13,하지만 병적 인 인산화에 대한 직접 트리거가 어려운 14 남아있다. 또는 미세 소관 결합 모티프 근처 이상 인산화는 미세 소관 (15)에서 타우 해리 및 P 타우 결국 NFT 흠으로 중합 할 수 직선 또는 쌍 나선형 필라멘트에 oligomerizes somatodendritic 구획에 타우 잘못 지역화됩니다. 타우 과인산, NFT 형성 및 신경 퇴행 긴밀한 넥타이 P-타우 엉킴은 세포 사멸 및 기타 세포 독성 반응을 유도하고, 따라서 타우 병증의 신경 퇴행 16, 17에 대한 근본 원인임을 널리 가설되었다. 이 전제 약물 화면과 초기 임상 시험은 (18)을 출시했다. 그러나,이 가설은 (19, 20) 도전에 직면 해있다. 예를 들어,기도 Santacruz 등.이 트랜스 제닉 마우스의인지 기능이 돌연변이의 발현을 억제함으로써 개선 될 수 있음을 보여 주었다NFTS 기존 타우 분자 (21)로부터 계속하여 형성하더라도 인간 타우. 초파리 모델에서 근본적인 NFT는 신경 세포를 보호하기 위해 22, 23, 독성 세포질 타우를 격리시키는 것으로 나타났다. 분명히, NFT의 병인 역할은, 어떤 경우, 크게 타우 병증 치료제 개발의 방향에 영향을 미칠 것이다. 몇몇 β 시트 바람직한 형광 염료, 전자 현미경 및 광 산란 분광법 24-27의 결합으로 나타낸 바와 같이 높은 농도, 재조합 또는 정상 뇌 타우 단백질 자발적하지만 서서히 체외 PHF 형 구조로 중합한다. 추가 헤파린 또는 아라키돈 산, 인간 뇌에서의 풍부한 지방산 대폭 타우 isoform- 및 유도제 농도 의존적으로 28-32 PHF의 형성을 가속화. 흥미롭게도, hyperphosphorylated 타우는 AD 뇌에서 정제 또는 체외 인산화 반응에 철저한으로 제조빠른 ggregates보다 효율적으로 26,33-35. 이러한 결과는 P 타우 병리학 적 역할과 매우 잘 일치하고 있습니다. P 타우의 집계에 따라 체외 시스템은 따라서 AD 약물 검사를위한 강력한 도구로 역할을 할 수있다. 타우 집계 및 AD의 진보적 인 신경 퇴행 간의 밀접한 관계뿐만 아니라 아밀로이드 베타 플라크를 대상으로 신약 개발의 최근 실패, AD 36-38의 또 다른 핵심 조직 학적 마커, 타우 집계가 상승 제어 약물 발견에 대한 관심을 감안할 때. 사실, 여러 그룹은 이미 기본 분석 등 체외 타우 집계 반응에 사용하여, 다른 처리량 약물 화면을 시작했다. 화학 물질의 수는 39-42 관내에서 타우 응집에 억제 또는 역전 활동을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 현재의 모든 타우 집계 레귤레이터 화면 형광체의 주요 병리 마크를 벗어났습니다 수정되지 않은 타우를 사용ylation, AD의 치료에 이러한 화합물을 사용하는 특이성 및 효능에 대한 우려를 제기. 생화학 적 특성화 및 AD 약물 스크리닝 응집 분석법을 개발하는 주요 장애물 중 하나는 중요한 pathophysiologically hyperphosphorylated 타우 단백질의 충분한 양의 제조이다. 타우 1N4R 이성체 및 GSK-3β 키나아제 E.에서 공동 발현되는 지퍼 원조 된 촉매 시스템을 사용하여 대장균은 류신 지퍼 융합 단백질로, 우리는이 도전 극복 (. 수이 등, 제출, 타우와 P 타우의 최종 제품에 대한 그림 1 참조; 또한 P 타우 예비 질량 분석 특성화를 위해 43 참조). 다른 타우 인산화 부위에 대한 특정 항체의 아홉 패널에서 양성 신호가 여덟 위치에서 관찰되었다 (데이타 미기재). 다음, 우리는 통합 운동 D를 차별화 할 수 프로토콜 및 측정 장치를 설명수정되지 않은 타우와 P-타우 종 사이의 ifferences. 이러한 분석은 아밀로이드 (타우 집계)에 따라 thioflavin T (THT) 또는 thioflavin S (THS)의 형광의 증가 (26) 결합을 측정 출판 프로토콜에서 수정되었습니다. 제 &quot;터미널&quot;에서, 무 염색 방법은, 응집 반응은 조립 및 아밀로이드 염료의 부재 하에서 배양 하였다. 상이한 시점에서, 각 반응의 분취 액을 제거하고, 타우 응집체를 바인딩 THT를 응집을 중지하도록 THT - 함유 버퍼의 동량 혼합. 형광은 IAP FluoroMax-2 형광 분석기에 의해 측정된다. &quot;와 염색&quot;두 번째에서 지속적인 모니터링 분석은, THT 또는 THS는 응집 반응에 포함되어 있습니다. 수동 형광 실험 전체에 걸쳐 연속적으로 측정 또는 다중 플레이트 판독기를 사용하여 할 수있다. 또한, 우리는 지속적으로 측정 미주리 집계 타우 및 P 타우 거의 생리적 농도를 사용하는 분석을 설명드. 인산화 효과는 용이하게 검출 가능한 남아있다. 다음, 우리는 단계별 작업 절차를 설명하고 이러한 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 각 방법의 장단점 일부의 토론뿐만 아니라 잠재적 인 약물 검사 응용 프로그램을 따를 것이다. 고농도, 타우 자발적 아밀로이드 - 유사 구조로 집계. 그러나, 실험실에서, 타우 fibrillization 유도제는 일반적으로 헤파린 (평균 분자량 6,000g / mol) 및 아라키돈 산으로 가속된다. 여기에 기술 된 예는 30 μm의 헤파린을 포함한다. 타우 아밀로이드 응집체의 형성은 thioflavin T (THT) 또는 S (THS) thioflavin 결합 아밀로이드에 의한 형광 모니터링합니다. (:; : 485 nm의 피크 방출 450 nm의 여기) 타우 집계에 결합하면, THT는 형광의 적색 이동을 나타낸다. THS, 다른 한편으로는, 아밀로이드 결합 전의 파장 510 ㎚ (450 nm 파장에서)에서 약한 방출을 가지고 있지만,이 fluorescenc이러한 응집 된 타우 (44)들을 주요 아밀로이드 단백질의 존재하에 예를 커진다. 두 염료는 타우와 P 타우 집계를 감지에서 잘 작동합니다. THT 때문에 (도 2 참조)의 비교적 강한 넓은 발광 피크, 510 nm에서 형광 단위의 30 % 감소가있다. 어느 염료를 사용하는 경우의 편의를 위해, 우리는 타우 응집을 모니터링 여기 / 방출 파장 (즉, 450 nm의 / 510 ㎚)의 동일한 조합을 사용한다. 타우 응집 분석의 목적 및 타우 단백질의 가용성에 따라, 염료의 존재 또는 부재 하에서 수행 될 수있다. 반응의 두 모드는 다음과 같습니다. 단일 샘플 형광 (ISA-SPEX FluoroMax-2) 및 다중 - 플레이트 판독기 (를 SpectraMax M2) - 또한, 우리는 두 개의 다른 기기의 동작을 보여준다. 독자의 특정 요구 및 장비 가용성에 맞게이 프로토콜을 적용 할 수 있어야한다.

<table><tbody><tr><td>트리즈마&nbsp; base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MAL-7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td>어두운</td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892</td><td>어두운</td></tr><tr><td>헤파린</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr>에 보관<tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D9779</td><td>4 °C에 저장; C</td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>ISA SPEX FluoroMax-2</td><td>Horiba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 다중 모드 마이크로레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 타우 단클론 항체</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3494</td><td>&ndash; 80 > 씨</td></tr></tbody></table>

생체 외 분석에서 집계 hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

알츠하이머병은 신경섬유다발(NFT) 형태의 과인산화된 타우 단백질의 신경 침전물에 의해 나타나는 타우병증으로 알려진 신경퇴행성 질환의 큰 그룹 중 하나입니다. NFT의 밀도는 인지 장애 및 기타 신경 퇴행성 증상과 상관관계가 높기 때문에 타우 응집 기반 치료제 개발 노력을 촉발합니다. 그러나 지금까지 타우 응집 분석은 병리학 관련 인산화 표시가 없는 재조합 또는 합성 타우를 사용합니다. 여기에서는 재조합, 과인산화 타우를 주제로 사용하는 두 가지 분석법에 대해 설명합니다. 이러한 분석은 과인산화된 타우 응집체의 역학 또는 안정성을 조절할 수 있는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝을 위해 확장할 수 있습니다. 알츠하이머병 및 기타 타우병증에 대한 새로운 치료법은 과인산화된 타우 이소폼을 사용하여 잠재적으로 발견될 수 있습니다.

재조합 타우와 P 타우 (그림 1)을 사용하여, 우리는 단백질 집계를 amyloidal 바인딩에 THT와 THS의 강한 형광 방출의 포함 타우를 활용, 타우 및 P 타우 집계의 반응 속도를 비교하는 두 개의 서로 다른 프로토콜을 설립 및 P 타우 (그림 2). 또는 응집 반응에서 형광 염료없이 우린 과인산 (도 3-5)로 타우 응집 일관된 향상을 관찰 하였다. 이 자극은 헤파린 무관 (데이타 미기재). (도 3 및 5), P-타우 실험 과정을 통해 더 높은 형광을 나타내는 단위로 크게 느려 전에 제 30 분이내 빠른 속도에서 전형적인 반응, 타우 및 p- 타우으로 올리고머에서. 응집 반응에 THT를 포함하는 것은 통합의 속도 (그림 4)에서 상당한 지연이 발생합니다. 두 이소 접근 작은지면반응 후 오 160 시간이 시작했다. THS, 다른 한편으로는, 응집 (도 ...

수정되지 hyperphosphorylated 타우 단백질 과인산 화 - 의존성 응집 빠른 반응 속도를 나타 내기 위해 두 응집 시험 관내 어 세이에 사용 하였다. 상기 분석 방법은 알츠하이머 질환의 진행의 기초를 형성하는 피 브릴 hyperphosphorylated 타우 성향을 변조 할 화합물에 대한 미래의 화면에 대해 방법을 포장.

생체 외 분석에서 집계 Hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

이 절차의 전반적인 목적은 변형되지 않은 tau 단백질 종과 과인산화된 tau 단백질 종의 응집 역학을 모니터링하고 비교하는 것입니다. 이는 먼저 지퍼 보조 촉매 시스템(zippers assisted catalyst system)을 통해 변형되지 않은 tau 단백질과 과인산화된 tau 단백질을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 두 가지 서로 다른 기기 중 어느 것에도 적합하도록 응집 분석법을 설정하는 것입니다.tau 응집 과정은 두 가지 서로 다른 thioflavin 염료인 thioflavin S와 thioflavin T의 형광을 통해 모니터링됩니다. 마지막 단계는 응집 곡선을 도식화하고 비교하는 것입니다. 궁극적으로, 응집된 tau 종에 결합함에 따른 thioflavin 형광의 역학적 변화는 인비트로(in vitro)에서 과인산화 의존적인 tau 섬유화 촉진을 보여주는 데 사용됩니다.안녕하세요. JoVE 기사에 오신 것을 환영합니다. 과인산화 tau 단백질을 이용한 인 비트로(in vitro) 응집 분석법입니다. 제 이름은 Minko이며, 실험은 byway가 수행하고 시연할 예정입니다.본 프로토콜을 위해서는 최근 한 달 이내에 제조한 신선한 응집 버퍼가 필요합니다. 사용 직전에 1 mM의 DIO three etol을 첨가하십시오. 또한 여과된 Thioflavin T 또는 S 스톡 용액이 필요합니다. Thioflavin 스톡 용액은 모두 -20 °C에서 보관 가능하며, 단백질은 -80 °C에서 보관하십시오.얼음 위에서 수건을 당긴 후, 일관성을 위해 필요에 따라 응집 버퍼를 사용하여 농도를 조절하십시오. 응집 버퍼와 함께 4°C에서 20,800 G로 10분 동안 수건을 원심분리하십시오. 이제 상층액을 다른 튜브로 옮기고 응집 반응을 준비할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 응집 혼합물을 준비합니다. 표에 따르면, 반응물 1회 분량으로 100 microliters가 적당합니다. 반응 횟수를 기준으로 총 부피를 계산하고, 피펫팅 오차를 고려하여 10%를 추가합니다.필요한 경우 Pepper를 raonic acid 또는 응집 버퍼로 대체할 수 있습니다. 반응물을 전도 혼합한 후, 배양 없이 37 °C로 옮깁니다. 24시간마다 1 mM의 DTT를 추가로 보충하여 형광 측정을 위한 환원 환경을 유지하십시오.분광 형광 광도계를 약 10분 동안 예열하십시오. 이렇게 하면 컴퓨터 소프트웨어의 측정 일관성이 향상됩니다. 기기 제어 센터에 있는 실시간 디스플레이 모드를 선택하십시오.슬릿 너비를 2 nm로 설정하고 들뜸 파장을 450 nm로 설정하며, 슬릿 너비를 5 nm로 설정하고 방출 파장을 510 nm로 설정합니다. 그런 다음 기기 제어 센터로 돌아가 고정 파장 분석을 선택합니다. 상단 프레임의 추가(add) 키를 눌러 파장 세트를 추가합니다.표준 오차의 획득 파라미터를 1로, 최대 시도 횟수를 3으로 설정하십시오. 그런 다음 추가(add)를 클릭하십시오. 이어서 이동(go)을 클릭하여 데이터 표시 창을 엽니다.이제 데이터 표시 창에서 start act를 클릭하여 새 샘플 대화 상자를 열고 샘플 유형으로 unknown을 선택하십시오. 그런 다음, aggregation buffer 98 µL와 3 mM Thioflavin S 또는 T 2 µL를 넣어 모든 반응물을 100 µL로 준비하십시오. 혼합물이 잘 섞이도록 피펫으로 여러 번 분주하십시오.한 가지 혼합물 200 µL 전체를 FA three qve로 옮기고 정해진 위치에 로드합니다. 그런 다음 run을 클릭하여 형광 데이터를 수집합니다. vete에서 용액을 제거한 후, 증류수로 3회 헹구고 공기 흐름으로 건조합니다. 이 분석법은 이온 반응에 형광 염료가 포함되어 있어 연속 측정이 가능하며, 자동 마이크로플레이트 리더를 사용하여 수행하는 것이 더 바람직합니다.매개변수 조절을 위한 일반적인 방식 또한 수동 작업 속도에 의해 제한됩니다. 96-웰 불투명 검정 플레이트에 응집 혼합물을 준비하십시오. 웰당 부피가 360 µL인 경우, 각 시점 측정에는 200 µL면 충분합니다.피펫팅을 통해 각 반응액을 충분히 섞습니다. 96-웰 플레이트를 37 °C에서 배양하고, 매 24시간마다 1 mM의 DTT를 추가로 넣어 각 시점마다 환원 환경이 유지되도록 합니다. 측정을 위해, 컴퓨터 소프트웨어에서 멀티모드 마이크로플레이트 리더와 컴퓨터를 최소 10분 전에 켭니다.온도를 37 °C로 설정하고 형광 강도 모드를 선택하십시오. 그다음 들뜸 파장을 450 nm로, 방출 파장을 510 nm로 설정하십시오. 96 웰 플레이트를 트레이에 삽입하고 read 키를 누르십시오.측정을 마친 후, 데이터를 분석하기 전에 플레이트를 즉시 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오. 이 분석에서는 소형 분광광도계를 사용하여 연속 모드 분석을 수행할 수 있습니다. 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 응집 혼합물을 준비하십시오. 특정 시점을 측정하는 데는 200 microliter 반응액으로 충분합니다.튜브를 뒤집어 혼합합니다. 37°C 또는 상온에서 반응을 설정하고, 24시간마다 1 mM의 DTT를 추가로 첨가하여 측정값을 측정합니다. 무염료 말단 분석(no die terminal assay)에서와 동일하게 유로미터(urometer)와 소프트웨어를 설정합니다.혼합물 전체를 큐벳에 옮긴 후 시료실의 시료 홀더에 배치하고 덮개를 닫습니다. 실행(run)을 클릭하여 적절한 시간 간격으로 형광 데이터를 수집합니다. 이 간격이 30초 또는 60초와 같이 짧은 경우, 마지막 측정 시점까지 큐벳을 기기 안에 그대로 두어도 무방합니다.반응액을 vete에서 샘플 튜브로 옮기고, 완료되면 튜브를 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오. 이전 지침에 따라 recombinant tau 및 P tal을 사용하여 vete를 세척하십시오. 형광 염료의 유무와 관계없이 tau 및 P tal을 포함한 아밀로이드 단백질 응집체에 결합했을 때 flavin t와 s의 강한 형광 방출 특성을 활용하여, tau와 p tal의 응집 역학을 비교하기 위한 두 가지 서로 다른 프로토콜이 수립되었습니다.응집 반응에서, 과인산화에 의한 tau 응집의 일관된 촉진이 관찰되었습니다. 일반적으로, T와 p tal liga는 플라빈을 포함하여 초기 30분 이내에 빠르게 상승한 후 유의미하게 감소합니다. 응집 반응 내의 T는 응집 속도를 상당히 지연시킵니다.Theof Flavian s와 t는 모두 160분 동안 반응한 후 고원기에 도달했습니다. 반면, Bio flavin s는 응집의 현저한 감속을 유발하지 않았습니다. 이 절차에 따라, 개발 후 이 분석법을 사용하여 중추신경계의 다른 이소형 또는 신경퇴행성 질환의 다른 응집 성향 단백질(예: likein)에 대한 추가 분석을 수행함으로써 병인 기전에서 단백질화의 기여도를 이해할 수 있습니다.이 단백질 PA 준비 기술은 해당 분야의 연구, 수많은 질병의 탐구, 치료법 및 약물 개발을 위한 하이퍼 인산염(hyper phosphate) 방식을 제공합니다.

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 생물학적 샘플에서 분리된 단백질 응집체의 파종 활성을 감지하기 위한 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 유세포 분석 분석을 보여줍니다. 타우 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포는 타우 씨앗을 함유한 리포좀 형질도입 복합체와 함께 배양됩니다. 이 씨앗은 리포터 단백질의 응집을 매개하여 유세포 분석기에서 FRET 양성 신호를 생성합니다.

Tau-Seed 유도 Reporter 단백질 응집을 검출하기 위한 FRET 유세포 분석 기법

이 동영상은 pH 민감성 형광 표지 타우 응집체를 사용하여 쥐 미세아교세포의 Tau 흡수를 정량화하는 세포 기반 분석을 보여주며, 정량적 평가를 위해 형광 활성화 세포 분류를 통해 분석됩니다.

미세아교세포에 의한 타우 단백질 흡수를 평가하기 위한 세포 기반 분석

이 비디오는 아밀로이드 β(Aβ) 응집체에 의한 신경 성장 원뿔 붕괴의 체외 평가를 보여줍니다. 뉴런을 Aβ 응집체로 처리하면 세포골격 불안정화가 발생하여 축삭돌기 끝에 있는 성장 원뿔이 붕괴됩니다. 성장 원뿔의 붕괴 정도를 평가하기 위해 처리된 세포를 대조 세포와 비교합니다.

뉴런 성장 원뿔 붕괴에 대한 응집된 아밀로이드 β의 체외 평가

이 비디오는 단백질 응집을 연구하기 위해 노란색 형광 단백질(YFP)로 태그된 돌연변이 인간 타우 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스로 인간 신경 세포를 transduction하는 과정을 보여줍니다. 이는 바이러스 진입에서 돌연변이 타우 발현까지의 단계를 간략하게 설명하며, 뉴런에서 눈에 보이는 세포질 타우 응집체의 형성으로 절정에 이릅니다.

타우 단백질 응집 분석을 위한 인간 뉴런의 렌티바이러스 매개 형질도입

여기에서는 Tau 단백질을 사례 연구로 사용하여 핵 자기 공명 분광법(NMR)으로 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 Tau는 데이터 수집 및 분석 전에 kinase에 의해 동위원소로 농축되고 in vitro에 변형됩니다.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

이 원고는 타우 hyperphosphorylation, 타우에 바인딩 microtubules, 및 약물 치료에 따라 세포내의 지역화를 측정을 측정 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 약물 또는 다른 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩 대상 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

이 원고에 설명 된 타우 집계 분석 결과 vivo에서 타우 misfolding 및 집계의 예상된 기능을 모방 합니다.

생체 외에서 타우 단백질 및 마약 검사의 집계를 공부에 대 한 분석 결과

여기 타우 이해 더 나은 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 특성화 하는 조사 가능한 도구를 만들기의 목표와 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다.

Microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과

이 프로토콜은 인간 신경 배양이 돌연변이 인간 타우를 코딩 하는 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트와 형질 도입 하는 절차를 자세히 설명 합니다. 형질 도입 배양은 타우 응집 체 및 관련 병 리를 표시 합니다.

인간 뉴런의 렌 티 바이러스 매개 된 형질 도입을 이용한 타우 응집 연구를 위한 시험관 내 모델

타우는 세포질과 미세관을 결합하는 핵에 모두 존재하는 신경 단백질로 알츠하이머 병 관련 유전자의 변조를 포함한 틀에 얽매이지 않는 기능을 발휘합니다. 여기서, 우리는 세포질 타우에서 오는 간섭을 배제하면서 핵타우의 기능을 조사하는 방법을 설명한다.

질병 관련 유전자의 발현을 조사하는 도구로 타우 세포 국소화의 변조

학습하세요 생체 외 분석에서 비수정 및 과인산화 tau 단백질의 응집 동역학을 비교하는 방법을. 티오플라빈 형광을 사용하여 알츠하이머병의 분자 메커니즘을 연구하고 치료제 선별을 위한 기반을 제공합니다.

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