광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

다음 실험의 전반적인 목표는 RNA 구조에 대한 단일 분자 기계적 풀림 실험을 입증하는 것입니다. 첫 번째 단계에서는 플로우 챔버가 구성되고 기기에 장착됩니다. 두 번째 단계에서는 미크론 크기의 비드를 관심 있는 RNA 샘플과 혼합한 다음 두 가지 크기의 비드를 플로우 챔버에 로드합니다.

마지막으로, 플로우 챔버와 광학 트랩을 사용하여 비드가 서로 접촉하도록 조종하여 다양한 단일 분자 상호 작용을 평가할 수 있습니다. 궁극적으로 이 나노 조작 기술은 2차 및 3차 구조 수준에서 RNA의 접힘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 RNA가 어떻게 접히고 풀리는지와 같은 RNA 접힘 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

환경 변화에 대응하기 위해 서로 다른 확인 간에 어떻게 전달됩니까? 그리고 다른 분자와 어떻게 상호 작용합니까? 오늘의 실험은 제 대학원생인 윌리엄스 스티븐슨(Williams Stevenson) 씨가 수행할 것입니다.

그런 다음 레이저 조각기를 사용하여 2mm 너비의 슬릿 3개를 양면 폴리아미드 테이프 2개로 자릅니다. 테이프 조각 중 하나를 커버 슬립에 부착하고 테이프의 구멍을 커버 슬립의 구멍에 맞추십시오. 다른 테이프 조각을 뚫리지 않은 깨끗한 커버 슬립에 부착합니다.

두 테이프 조각에서 보호 덮개를 제거한 다음 커버 슬립 중 하나의 각 채널 사이에 유리로 당겨진 마이크로 피펫과 두 개의 BI 튜브를 놓습니다. 다음으로 두 개의 커버 안경을 끼우고 마이크로 피펫과 바이패스 튜브를 두 겹의 테이프로 제자리에 유지합니다. 흐름 챔버를 만들려면 흐름 챔버를 금속 프레임의 뒷면에 장착하고 챔버의 구멍을 유체 채널 위에 맞춥니다.

그런 다음 프레임을 뒤집고 폴리에틸렌 튜브를 통해 선택한 버퍼로 채워진 10ml 주사기에 채널을 연결합니다. 이제 전체 챔버를 두 대물렌즈 사이의 광학 핀셋에 장착하고 유체 채널이 있는 챔버의 전면이 오른쪽을 향하도록 합니다. 그런 다음 왼쪽 대물렌즈를 집어넣고 프레임의 황동 핀을 핀셋의 장착 구멍에 꽂고 나사를 조여 챔버를 제자리에 고정합니다.

번지 코드를 사용하여 악기를 테이블에서 들어 올립니다. 플로우 챔버의 반응 부위로 비드를 전달하기 전에 기기를 음향 상자에 동봉합니다. 먼저 A 무릎 꿇은 RNA 샘플을 anti-D와 혼합하고 산소 ENC 코팅 비드 또는 비드를 파낸 다음 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다.

배양 중에, 벗겨진 습관의 연꽃 현탁액과 코팅 된 구슬을 1 밀리리터 주사기에 연결하고, 주사기를 흐름 챔버의 하단 채널로 이어지는 유체 튜브에 연결합니다. 주사기를 밀어 넣어 연쇄상구균 비드를 챔버에 로드한 다음 모터 제어 소프트웨어를 사용하여 광학 트랩을 하단 바이패스 튜브의 입구 근처에 놓고 전체 챔버를 이동합니다. 그런 다음 트랙 볼을 조작하여 광학 트랩을 작동하고 연쇄구균 비드를 캡처합니다.

모터 제어 소프트웨어를 사용하여 비드를 마이크로 파이펫 끝 가까이로 이동합니다. 다음으로, 마이크로 피펫에 연결된 주사기를 당겨 비드를 진공 청소기로 진공 청소기로 마이크로 피펫에 올린 다음 주사기를 부드럽게 떨어뜨려 중간 채널에 흐름을 적용하고 남아 있는 연쇄상구균 비드를 씻어냅니다. dig bead 샘플 혼합물을 챔버의 상단 채널로 전달하고 방금 설명한 대로 dig bead를 캡처합니다.

그런 다음 광학 트랩을 사용하여 dig bead를 strep bead에 가깝게 가져옵니다. 흐름을 적용하여 중간 채널을 청소합니다. 그런 다음 한 쌍의 구슬 사이에 묶여 있는 단일 분자를 낚습니다.

포획된 dig bead를 strep bead 위에 수직으로 놓습니다. 다음으로, 트랩을 조종하여 굴착 비드를 연쇄상구균 비드 쪽으로 아래로 이동하고 모니터에서 힘 거리 플롯 창을 열어 힘의 변화를 시각화합니다. 마지막으로, 접촉하면 굴착 비드를 연쇄상구균 비드에서 수직으로 멀리 이동하여 분리력을 추적합니다.

RNA 분자가 5개의 프라임 말단과 3개의 프라임 말단에 의해 비드 사이에 묶이게 되면, 반복적으로 늘어나고 이완될 수 있습니다. 이중 연선 핸들의 탄성은 비선형 힘 확장 곡선으로 표시됩니다. 핸들 사이의 RNA 구조의 협력 접힘과 풀림은 음의 기울기를 가진 힘 확장 곡선의 갑작스러운 립과 지퍼에 의해 반영되며, 헤어핀의 다시 접힘은 힘 확장 곡선의 지퍼로 표시됩니다.

중요한 것은 동일한 분자가 매번 다른 힘으로 풀리고 다시 접힐 수 있다는 것입니다. 이러한 경향은 전이력의 분포에서 분명하게 드러난다. 피드백 메커니즘을 사용하여 RN에 일정한 힘을 유지할 수 있습니다. RNA 헤어핀의 헤어핀 폴딩은 확장의 단축으로 표시되는 반면, 풀림은 수동 모드에서 확장의 증가로 반영되는 반면, 트랩과 마이크로 파이펫의 위치는 모두 고정됩니다.

RNA가 헤어핀으로 접히고 확장이 짧아지면 갇힌 비드가 트랩의 중심에서 멀어지면서 힘을 증가시킵니다. RNA가 단일 가닥으로 확장되면 비드가 트랩 중심을 향해 이동하여 힘을 감소시킵니다. 이 기술을 사용하여 RNA 접힘 경로를 관찰하고 조작할 수 있습니다.

피코 뉴턴과 나노미터 분해능을 사용하면 단일 분자의 상태 수명과 전이력을 축적하여 RNA 접힘의 속도 상수와 자유 에너지를 유도할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 단일 분자를 피싱하는 동안 인내심을 가져야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 두 구슬 사이의 단일 분자 밧줄을 찾을 가능성은 매우 낮습니다.

따라서 많은 구슬 쌍이 전혀 달라붙지 않을 수 있습니다.