Name: 광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 배우세요 광 핀셋을 이용한 단일 RNA 분자의 기계적 전개 실험 방법입니다. 미세 비드와 유동 챔버를 활용하여 RNA의 2차 및 3차 구조 폴딩 역학을 정밀하게 분석하고 분자 상호작용을 평가할 수 있습니다.

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이 연구는 NSF 보조금(MCB-1054449)과 올버니 대학의 RNA 연구소에서 PTXL에 수여하는 공동 학제 간 파일럿 연구 프로그램 상의 지원을 받았습니다.

단일 분자 협 지부에 대한 RNA 분자의 1 준비 <ol><li> 관심 서열 복제. 벡터에 RNA 구조에 대응하는 DNA 서열을 복제. </li><li> 합성 및 전사 템플릿의 정화. PCR에 의한 전사 템플릿을 합성. [여기서 도시 표 1] 다음에, PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 제품을 정제하고,&gt; 200 NG / μL로 샘플을 집중한다. 정제 된 DNA가 전사를 위해 사용되기 때문에,의 RNase가없는 물 용출 농도 단계에 사용한다. </li><li> 시험 관내 전사합니다. RNA 수율을 극대화하기 위해 밤새 37 ° C에서 시험 관내 전사에 의해 RNA를 합성. 전사 후 [여기 장소 표 2], 나는 37 ° C에서 15 분 동안 DNA 템플릿을 소화 한 μL의 DNase를 추가합니다. 실리카 스핀 컬럼을 사용하여 RNA를 정제 하였다. </li><li> 비오틴 핸들 A.의 합성 먼저, 프라이머 AF 및 아르곤과 진한 PCR을 사용하여 개질 된 핸들을 생성증폭 된 DNA&gt; 200 NG / μL로를 entrate. 다음으로, 프라이머 신장 반응을 이용하여 PCR 생성물로 바이오틴 변형을 통합한다. [장소 여기 표 3] NOTE : 바이오틴 손잡이 A (비오틴-HA)을 정제없이 직접 어닐링에 사용될 수있다. 비오틴-HA는 RNA에 어닐링 할 수있는 바와 같이, 그것은 두 단계의 RNase없는 물을 사용하는 것이 중요하다. </li><li> 디그 옥시 제닌 수정 핸들 B.를 합성의 합성 프라이머 Bf로와 디그 옥시 제닌 수정 올리고 파 - BR (그림 3)를 사용하여 PCR에 의해 핸들 B (발굴-HB)를 수정 디그 옥시 제닌. 이어서, PCR 생성물을 정제하고&gt; 200 NG / μL로 샘플을 집중한다. </li><li> 핸들에 어닐링 RNA. 핸들 RNA를 어닐링. [여기서 도시 표 4 및 표 5] </li><li> 단련 된 샘플을 정화. 열처리 된 시료의 에탄올 3 볼륨을 넣고 잘 섞는다. 적어도 1 시간 동안 -70 ℃에서 혼합물을 저장합니다. 15,800 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 제거한다. 동결 건조기를 사용하여 펠렛을 건조시킵니다. 에서 펠렛을 녹여100 μL의 RNase없는 물. 참고 : 샘플을 사용할 준비가 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 광 핀셋의 2 교정 및 운영 <ol><li> 비디오 모니터의 픽셀 크기를 보정 <ol><li> 트랩으로 알려진 지름 (크기 기준)와 비드를 광 트랩을 사용합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 사용하여 포획 된 구슬의 캡처 이미지 (그림 4). </li><li> 중심 법에 의한 이미징 소프트웨어를 이용하여 비드의 직경을 결정한다. </li><li> 다른 크기의 구슬의 직경을 결정하기 위해이 절차를 반복합니다. </li><li> 화소의 물리적 크기를 얻기 위해 선형 회귀에 의해 측정 한 비드의 직경 및 공지를 장착한다. </li></ol></li><li> 거리 보정 확인 <ol><li> 트랩에 비드를 광 트랩을 사용합니다. </li><li> 촬상 소프트웨어에 의해 그 무게 중심의 화소 위치를 결정하고 Minitweezers를 사용하여 위치를 기록한다. </li><li> diffe하는 비드 스티어<html> 위치를 임대하고 위치 결정을 반복합니다. </li><li> 교정 픽셀 크기를 이용하여 m 단위로 화소로부터 비드의 X 및 Y 위치를 변환한다. </li><li> 비디오 의해 Minitweezers 측정 위치 사이의 X 및 Y를 비교한다. 값의 두 세트에 동의한다. 이미지 해상도가&gt; 0.1 μm의이기 때문에 정확도를 보장하기 위해 측정 사이에 1 μm의를 통해 비드를 이동합니다. 거리 보정 Minitweezers에 기억 한 필적 없으면 계측기를 재조정. </li></ol></li><li> 트랩 강성 교정 <ol><li> 광학 트랩을 사용하여 구슬을 캡처 여전히를 개최합니다. </li><li> 3 초 동안 속도&gt; 5 kHz에서 바이 패스 고속 데​​이터 수집을 사용하여 트랩의 힘을 기록한다. </li><li> 소프트웨어를 이용하여 비드의 기록 동작에서 전력 스펙트럼을 생성한다. 로렌츠 (그림 5) (38) 파워 스펙트럼에 맞는 : 542 / 51542eq1.jpg &quot;너비 =&quot;200 &quot;/&gt; (식. 1) 어떤 S (F)는 F의 주파수에서의 힘을, F (C)는 코너 주파수이고, S는 0 점근 전력이다. 코너 주파수는 C F, 열 동작 전원이 점근 값의 절반으로 감소 주파수이다. F (C)가 레이저 파워와 구슬의 크기에 따라 달라집니다으로, 개별적으로 갇혀 비드를 교정. </li><li> f를 C에서 트랩의 스프링 상수 κ를 계산한다 : <img alt="식 (2)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (식. 2) 하는 γ는 비드 (식. 3)의 항력 계수이다. 힘의 변화에​​서 RNA의 확장 변경 사항을 결정하기 위해 스프링 상수를 사용합니다. </li></ol></li><li> 스토크 법률 테스트 <ol><li> 광 트랩을 사용하여 비드를 캡처. 백업 및 힘 비드를 이동 다른 속도로. </li><li> 구슬의 움직임을 기록하고 Minitweezers을 이용한 강제. </li><li> 비드의 반경을 계산한다. NOTE : 마찰력, F d를, 유체의 구형 입자의 움직임에 의해 생성은 스토크의 법칙에 의해 설명 될 수있다 : <img alt="식 (3)" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (식. 3) R은되는 구의 반경, V는 속도이다, h는 참조 테이블에서 발견 될 수있는 유체의 동점도이다. F의 D와 같은 힘을 측정하여, 비드 부의 반경은 식을 사용하여 계산 될 수있다. 3 (그림 6) 및 이미지 수집 소프트웨어에 의해 결정이 동의해야한다. 스톡스 법칙 테스트 효과적으로 전체적인 교정 및 기기의 성능을 테스트한다. </li></ol></li></ol> 단일 RNA 분자의 3 Nanomanipulation <ol><li> 유체 만들기. <ol><li> 2 번 커버 유리에 6 홀 (2mm 직경 각) (도 7a)를 뚫고 (7B 그림) 레이저 조각기를 사용하여 양면 폴리이 미드 테이프로 세 슬릿 (2mm 폭을) 잘라. </li><li> 양면 캡톤 테이프의 두 층으로이 커버 유리를 끼워 흐름 챔버를 확인합니다. 테이프 (그림 7C) 사이에 마이크로 피펫과 두 개의 바이 패스 튜브를 삽입합니다. </li><li> 유체 구멍 (그림 7D)을 일치시켜 금속 프레임 상에 유량 용기를 탑재합니다. </li><li> 폴리에틸렌 호스 (그림 7E)를 통해 선택의 버퍼 가득 10 ML 주사기로 챔버의 유체 채널을 연결합니다. </li><li> 두 목표 사이의 광 핀셋에 전체 챔버를 탑재합니다. 유체 채널 챔버의 앞면이 오른쪽으로 향하도록해야합니다. 올바른 목표를 후퇴와 t에 장착 구멍에 프레임 (그림 7E)의 황동 핀 플러그그는 핀셋. 챔버의 위치를​​ 고정하는 나사를 조입니다. </li></ol></li><li> 열처리 된 시료와 구슬을 혼합. 안티 - 디그 옥시 제닌 코팅 구슬 (발굴 구슬)로 어닐링 샘플을 혼합하고,이 혼합물은 5 ~ 10 분 동안 실온에서 체류 할 수 있습니다. 전형적으로, 어닐링 된 시료 1 ㎕의 완충액 1 ㎖에 5 ㎕를 발굴 비드와 혼합된다. NOTE : 비드의 양은 유동 챔버로 로딩되는 비드의 적당한 양이 바이 패스 관으로부터 전달되도록 보장하기 위해 선택되어야한다. 비드 어닐링 시료의 비율은 쉽게 정량화 될 수 없다. 이상적인 경우에, 대부분의 비즈 비즈의 작은 부분 만이 비드 당 하나의 RNA 분자를 가질 수 있도록 RNA에는 없다. 어닐링 된 샘플 및 비드 현탁액을 정량화하기 어렵다 같이, 유일한 방법은 현재 가장 및 혼합비를 변화와 핀셋 혼합물을 테스트하는 것이다. </li><li> 마일 위에, 즉 (유동 챔버에서 반응 사이트로 수 마이크로 미터 구슬 배달cropipette 팁, 그림 7C). <ol><li> 1 ML의 주사기에 스트렙 타비 딘 - 코팅 구슬 (연쇄상 구균 구슬)의 현탁액을로드합니다. </li><li> 유량 용기 (도 7a)의 바닥 채널로 이어지는 유체 튜브에 주사기를 연결합니다. </li><li> 챔버로 패 혈성 구슬을 흘러 주사기를 밀어 넣습니다. </li><li> 바닥 바이 패스 관 (도 7b)의 개구 근처 광 트랩을 배치하는 모터 제어 소프트웨어를 사용하여 전체 챔버를 이동. 그런 다음 연쇄상 구균 구슬을 캡처하는 트랙볼에 의해 광 트랩을 운영하고 있습니다. </li><li> 모터 제어 소프트웨어를 사용하여 마이크로 피펫의 선단 주변의 비드를 이동. </li><li> 마이크로 피펫에 비드를 빨아 마이크로 피펫에 연결된 주사기를 당깁니다. </li><li> 추가 연쇄상 구균 구슬을 세척하는 중간 채널에 주사기를 눌러 부드럽게 흐름을 적용합니다. </li><li> 유사하게, 시료의 혼합 챔버의 상부 채널 발굴 - 비즈 (단계 3.2 참조) 전달. </li><li> 발굴 비드를 캡처 및 광학 트랩을 사용하여 연쇄상 구균 - 비드가 가까이 가져. </li><li> 흐름을 적용하여 중간 채널을 청소합니다. NOTE : strep- 그들이 뷰 현미경 하에서 시각적으로 구별 될 수 있도록 비드가 DIG 다른 사이즈로 선택된다 (도 4). </li></ol></li><li> 낚시 &#39;구슬의 쌍 사이에 테 더링 단일 분자. <ol><li> 연쇄상 구균 비드 (그림 4)의 상부에 수직으로 발굴 비드를 놓습니다. </li><li> 트랩을 핸들에 의해 아래로 연쇄상 구균 구슬을 향해 발굴 비드를 이동합니다. 힘의 변화를 시각화하는 컴퓨터의 힘 - 거리 그래프 창을 엽니 다. </li><li> 이 구슬의 접촉시, 수직 거리 패 혈성 구슬에서 발굴 구슬을 이동합니다. </li><li> 특정 접촉이 이루어지지 않은 경우, 힘은 거의 제로 남아있다. 이 비드 분자에 의해 접속하는 경우에는, 힘이 크게 증가이 비드를 분리 할 때. 일반적으로 &quot;낚시&quot;라고 함이 절차는 종종 상승률이며구슬의 각 쌍에 ORMED 여러 번 효과적인 단일 분자 연결 고리를 찾을 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

<html> 협 지부 샘플의 준비에서 수정 및 문제 해결 클로닝 벡터의 선택. 여기에 설명 된 일반적인 구조 (도 3) 특수 클로닝 벡터를 필요로하지 않지만, 벡터는 프로모터가 원하는 위치에서 PCR을 통해 도입 될 수 있도록 전사의 용이성을 위해 고유 T7 또는 T3 프로모터를 갖지 않는 것이 바람직하다. 순서 및 핸들의 길이. 핸들에 대한 구체적인 순서 요구 사항은 없습니다. 그러나, AT 비율 가까운 GC는 호모 폴리머 및 높은 반복 서열은 피해야하는 반면, 바람직하다. 저서에서,이 핸들은 관심 RNA 구조가 중간에 대략 위치되도록 유사한 길이를 유지한다. 이전 작업은 미묘 측정 동력학 (46, 47)에 영향을 핸들의 전체 길이가 500 내지 10,000 염기쌍까지 변화 것을 보여준다. 풀림 혼합...

광 핀셋 기술의 개발은 오랫동안 생물학 연구에서의 응용 프로그램과 함께 제공하고있다. 광 포획 효과가 처음 발견되었을 때, 아서 Ashkin 오염 된 물에서 박테리아 레이저 포커스 하나에 포획 될 수 있음을 관찰 하였다. 그 이후로, 박테리아는 생물 물리학 학생들의 세대에 대한 의도하지 않은, 재미 실험뿐만 아니라 미생물 생리학 2,3를 공부하는 심각한 연구 도구가되었습니다 덫. 광 트래핑 기술은 미세 가공 대상물 (1)을 고정화 집속 레이저 빔을 사용한다. 실제로, 또한 트랩 (ΔX)의 중심으로부터 변위에 의해 포획 된 개체에 힘 (F)을 측정 광 스프링 같은 레이저 트랩 기능한다. κ 짧은 범위, F = κ X ΔX, 내 트랩의 스프링 상수이다. 트랩은 광에 마이크로 picoNewton (PN) 정밀도로 힘을가하도록 사용될 수있다copic 객체와 나노 미터 (nm의) 정확도로 위치를 측정한다. 지난 20 년 동안 광 핀셋 생물 물리학에서 가장 일반적으로 사용되는 단일 분자 기술 중 하나가되었다. 이 기술은 폴딩 및 DNA 4-6, 7-9 RNA, 단백질 10, 11의 역학을 연구하기 위해 사용되어왔다. 광 핀셋은 DNA 복제 12, RNA 전사 (13), 및 단백질 합성 14,15,뿐만 아니라 많은 다른 생체 분자 이벤트 16-18을 관찰하는데 사용되었다. 단일 분자 방법은 주로 RNA의 견고한 접이식 에너지​​ 풍경을 탐구하는 RNA 구조의 연구에 사용된다. RNA 서열은 일반적으로 인해 RNA의 간단한 화학 조성 및 기재 페어링 규칙 여러 안정한 상호 배타적 구조로 접을 수있다. 이것은 긴 RNA 구조 다형성, 즉 리보 스위치 (19, 20)에서 발생하는 등, 유전자 조절에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. recent 게놈 전체의 조사는 몇도 크게 셀룰러 사체 (21)의 큰 부분의 구조 및 단백질 합성에 영향을 작게하는 온도 변화를 밝혔다. 이 예는 이전에 생각보다 다른 RNA 폴딩의 생물학적 역할은 아마도 더 중요하고 널리 퍼져 있음을 암시한다. 구조 다형성은, 그러나, 많은 분자의 평균 속성을 검사 기존의 생화학 및 생물 물리학 적 접근 방법에 대한 도전을 포즈. 예를 들어, &quot;을&quot;과 riboswitch &quot;오프&quot;를 입체 형태는 상호 배타적입니다. 이종 구조에서 파생 된 평균 구조는 생물학적으로 관련 이형를 닮은 것 같지 않다. 또한, 번역되지 않은 RNA와 mRNA의 보통 구조를 형성한다. 단백질과 RNA를 규제와의 상호 작용은 일반적으로 상호 작용의 일환으로 기존 구조의 전개가 필요합니다. 따라서 RNA 전개 / 접힘을 공부하는 것은 해당된다RNA 생물학의 문제를 해결합니다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 단일 분자 방법은 한 번에 22 ~ 27에 하나의 분자를 연구함으로써 RNA 구조 다형성을 해명하기 위해 사용되었습니다. 인기 단일 분자 형광 방법에 비해 기계적인 전개 기반 핀셋 개별 분자의 입체 형태는 가해진 힘에 의해 조작 될 수 있고, 나노 미터 정밀도로 측정 할 수있는 장점을 제공한다. 이 기능은 nanomanipulation 큰 RNA의 계층 폴딩 28 해부 될 수있는 개별적인 구조적 도메인의 전개 / 폴딩을 모니터하기 위해 이용 될 수있다. 대안 적으로, 단일 가닥 여러 이형태 중 하나에 접하도록 지시 할 수있다; 또는 기존의 구조가 기계적으로 서로 다른 형태 (29)에 접힘하도록 유도 될 수있다. 생물학적 조건에서 RNA 구조가 온도 변화 또는 리간드 결합시에 변경 될 수있다. 직접 조작의 분자의 능력tructure는 RNA 구조 연구의 새로운 장을 엽니 다. 원칙적으로, 예컨대 원 자간 력 현미경과 자기 핀셋과 같은 다른 기계적 방법은 또한 단일 RNA 분자의 폴딩을 연구하는데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 애플리케이션으로 인해 상대적으로 낮은 공간 해상도 (30)에 크게 제한된다. 광 핀셋의 고용은 RNA 구조가 기계적인 힘에 의해 전개 할 수 있습니다. 전개 기계의 장점은 여러 가지다. 금속 이온과 리간드 유도 된 폴딩은 주로 차 구조로 한정되는 반면에 힘은 모두 2 차 및 3 차 구조를 전개 할 수있다. 온도 및 변성제 크게 물과 용질의 활동에 영향을 미칠 수있다. 반대로, 힘은 분자 구조를 교란하는 국소 도포; 주변 환경에의 힘의 영향은 무시할 수있다. 또한, 용융 온도가 가장 작은 RNA 구조의 접힘 열역학을 연구하는 데 사용되는,광 핀셋은 일곱베이스 쌍 tetraloop의 머리 핀의 자형으로 28에서 400 염기 라이 보자 임 (31)에 이르기까지 다양한 크기와 RNA의 구조를 연구하는 데 사용 된 반면. 또한, RNA의 구조는 기계적으로 중온 온도에서 전개 될 수있다. 대조적으로, 열 용융 실험에서의 RNA를 펼쳐, 온도는 일반적으로 상당히 잘 특히 Mg를 2 + 이온의 존재하에, RNA 가수 분해를 증가 생리적 온도 이상으로 상승된다. 그것은 힘의 기계적 효과가 구조에 적용되는 방법에 의존한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 가해진 힘은 접는 에너지 풍경을 올라옵니다. 예를 들면, 힘이 머리핀에 적용될 때, 염기쌍 순차 시간 (도 1A)에 하나씩 세분화된다. 리핑 포크 가해진 힘에 수직 인 나선 축을 따라 진행한다. 최소한 키스 착체가 신장 상태로되면 반대로,이 키스가해진 힘에 평행 염기쌍은 힘로드를 공유 (도 1B). 2 차 및 3 차 폴딩 (28, 32)를 구별하기 위해 이용 될 수있는 서로 다른 기계적 응답에 가해진 힘의 결과로 헤어핀과 키스 복잡한 상대의 다른 형상. 전개 기계의 이론적 측면은 이전에 8,9,30을 검토하고있다. 이 작품은 설정하고 단일 분자 기계 전개 분석을 수행 할 수있는 기본적인 방법을 설명합니다. 실험 설정. 우리의 기계 당기는 실험에서, 협 지부의 RNA 샘플은 두 개의 이중 가닥 DNA / RNA 손잡이로 측면에 관심있는 RNA (그림 2)로 구성되어 7. 전체 분자는 각각-비오틴 스트렙 타비 딘과 디그 옥시 제닌 항 디곡 시게 닌 항체의 상호 작용을 통해 표면이 피복 미크론 크기의 비드 (Spherotech)에 닿는 될 수있다. 한 비드 힘 측정 광학 조원에 의해 개최됩니다AP는 다른 반면, 마이크로 피펫의 선단에 유지된다. 비드 사이의 상대 거리가 트랩 조향 또는 마이크로 피펫을 움직이는 하나에 의해 변경 될 수있다. 이 방법을 사용하여 비드를 테 더링 단일 RNA 분자는 연신 및 완화 될 수있다. 샘플의 준비. 협 지부에 대한 RNA 샘플의 합성은 몇 단계 (그림 3)를 포함한다. 먼저, 관심 RNA에 대응하는 DNA 서열은 제 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 다음으로, 세 PCR 반응은 두 개의 손잡이와 전사의 템플릿을 생성하기 위해 수행된다. 전사 템플릿 핸들 영역 및 삽입 된 서열을 포함한다. 전체 길이의 RNA는 시험 관내 전사에 의해 합성된다. 마지막으로, RNA 및 화학적으로 변형 핸들은 협 지부에 대해 분자를 생성하기 위해 함께 열처리된다. 보정 및 핀셋의 작동. Minitweezers 사용의 기본적인 디자인이 작품의 D는 듀얼 빔 광 핀셋 (33)의 다음과 같습니다. 첫 번째 세대 광 핀셋에 비해 많은 개선으로, Minitweezers 특별한 안정성을 표시합니다. 여러 나라에서 연구 그룹의 숫자는 단일 분자 연구 14,15,34-37에 Minitweezers를 사용합니다. 교육 비디오를 포함하여 장치의 건설, 교정 및 운영의 세부 사항은, &quot;족집게 연구소&quot;웹 사이트 (http://tweezerslab.unipr.it)에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 염기 매일 수행되어야 개선 및 교정 과정을 상세히 설명한다.

<table><tbody><tr><td>미니트위저</td><td>Steven B. Smith Engineering</td><td></td><td><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td></tr><tr><td>데이터 수집 카드</td><td>National Instruments</td><td>USB-6351</td><td></td></tr><tr><td>비디오 카드</td><td>National Instruments</td><td>PCI-1407</td><td></td></tr><tr><td>Labview 프로그래밍 소프트웨어</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI Vision Builder</td><td>내쇼날인스트루먼트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 조각기</td><td>에필로그 레이저 시스템</td><td>Zing-16</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 키트</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear 키트</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-11-UTP</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>FERR0081</tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>New England Labs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 코팅 마이크로스</td><td>피어 Spherotech</td><td>SVP-20-5</td><td></td></tr><tr><td>Antidigoxigenin 코팅 마이크로스피어</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>크기 표준 마이크로스</td><td>피어 Spherotech</td><td>PPS-6K</td><td></td></tr><tr><td>Kapton 테이프</td><td>Kaptontape.com</td><td>KPPTDE-1</td><td></td></tr><tr><td>제 2 호 커버 유리</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543D</td><td></td></tr></tbody></table>

광 핀셋으로 단일 rna 분자의 nanomanipulation

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

인간 게놈의 상당 부분이 전사하지만 번역되지 않습니다. 이 게시물 게놈 시대에, RNA의 규제 기능은 점점 더 중요한 것으로 나타났다. RNA의 기능은 종종 다른 구조를 채택하는 능력에 달려있다, 그것은 직접적 RNA 서열로부터 삼차원 구조를 예측하는 것은 곤란하다. 단일 분자는 한 번에 하나의 분자 구조 분자를 모니터링하여 RNA 구조 다형성의 문제를 해결하기 위해 쇼 전위에 접근한다. 이 작업은 정확하게 광 핀셋을 사용하여 단일 RNA 분자의 폴딩 구조를 조작 할 수있는 방법을 제시한다. 첫째, 방법은 단일 분자 기계 작업에 적합한 분자가 설명되어 합성합니다. 광 핀셋의 적절한 운영을 보장하기 위해 다음, 다양한 교정 절차가 설명되어 있습니다. 다음으로, 다양한 실험을 설명한다. 기술의 유틸리티를 설명하기 위해 기계적으로 전개 RNA 헤어핀의 결과와 단일 RNA 키신g 단지는 증거로 사용된다. 이러한 예에서, nanomanipulation 기술은 독립적으로, 2 차 및 3 차 구조를 포함하여 각 도메인의 폴딩을 연구하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 한계와 방법의 미래 응용 프로그램이 논의된다.

공간에 의해 제한, 단일 RNA 분자의 nanomanipulation는 기계 전개 RNA 헤어핀의 예와 차 구조를 가진 RNA를 표시하여 설명된다. 단일 머리 핀 분자를 조작 테더가 비드 사이에 확립되면, 테더에 연장 및 힘은 사용자 정의 된 프로토콜을 사용하여 조작 될 수있다. 일반적인 네 개의 조작 프로토콜은 일반적으로 사용된다. 포스 램프 실험. 단일 RNA를 조작하는 가장 직관적 일반적인 실험 (세로도 4에 도시 된 바와 같이) 반복 스트레칭 및 핸들의 헬리컬 축 방향으로 분자를 완화하는 것이다. 힘 F, 및 트랩 위치를, Y는, 시간의 함수로서 기록된다. TRA의 스프링 상수 인 F / κ - 분자 (E)의 확장은, E...

광학 핀셋은 5' 및 3' 말단에서 개별 분자를 늘려 RNA 접힘을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기에서는 핀셋을 위한 RNA 분자를 합성하고, 기기를 보정하고, 단일 분자를 조작하는 방법을 설명하는 일반적인 절차에 대해 설명합니다.

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

다음 실험의 전체적인 목적은 RNA 구조를 대상으로 한 단분자 기계적 언폴딩(unfolding) 실험을 시연하는 것입니다. 첫 번째 단계에서는 유체 챔버를 제작하여 기기에 장착합니다. 두 번째 단계에서는 마이크론 크기의 비즈를 분석 대상 RNA 샘플과 혼합한 후, 서로 다른 두 가지 크기의 비즈를 유체 챔버에 로딩합니다.마지막으로, 유동 챔버와 광학 트랩을 사용하여 비드들을 서로 접촉하도록 유도함으로써 다양한 단일 분자 상호작용을 평가할 수 있습니다. 궁극적으로, 이 나노 조작 기술은 RNA의 2차 및 3차 구조 수준의 폴딩을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 이 방법은 RNA가 어떻게 폴딩되고 언폴딩되는가와 같은 RNA 폴딩 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.환경 변화에 반응하여 어떻게 서로 다른 구조 사이를 전이할까요? 그리고 다른 분자들과는 어떻게 상호작용할까요? 오늘의 실험은 대학원생인 Williams Stevenson 씨가 수행하겠습니다. 유동 챔버(flow chamber)를 만들기 위해, 먼저 2번 커버슬립 한 장에 지름 2mm 구멍 6개를 뚫는 것으로 시작하십시오.그 다음 레이저 각인기를 사용하여 두 조각의 양면 폴리아미드 테이프에 2 mm 너비의 슬릿 3개를 뚫습니다. 테이프의 구멍을 커버슬립의 구멍과 일치시키면서 테이프 한 조각을 커버슬립에 부착합니다. 나머지 테이프 한 조각은 구멍이 뚫리지 않은 깨끗한 커버슬립에 부착합니다.두 개의 테이프에서 보호 덮개를 제거한 후, 커버슬립 한 쪽의 각 채널 사이에 글라스 풀드 마이크로 피펫과 두 개의 바이패스 튜브를 배치합니다. 다음으로, 두 층의 테이프로 마이크로 피펫과 바이패스 튜브가 제자리에 있도록 고정하여 두 개의 커버 글라스를 샌드위치처럼 겹칩니다. 유동 챔버를 만들기 위해, 챔버의 구멍이 유체 채널과 일치하도록 금속 프레임 뒷면에 유동 챔버를 장착합니다.그런 다음 프레임을 뒤집고 폴리에틸렌 튜브를 통해 채널을 선택한 버퍼가 채워진 10 milliliter 주사기에 연결합니다. 이제 챔버의 유체 채널이 있는 전면이 오른쪽을 향하도록 하여, 전체 챔버를 두 대의 대물렌즈 사이의 광학 집게(optical tweezers) 위에 장착합니다. 그 후 왼쪽 대물렌즈를 뒤로 물리고 프레임의 황동 핀을 광학 집게의 장착 구멍에 꽂은 다음, 나사를 조여 챔버를 위치에 고정합니다.번지 코드를 사용하여 기기를 테이블에서 들어 올리십

nanomanipulation-of-single-rna-molecules-by-optical-tweezers

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

단일 분자 자석 족집게 플랫폼 G-quadruplexes를 조작 하는 보고, G4 안정성과 규제의 연구에 대 한 수 있는 다양 한 단백질에 의해.

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

이 프로토콜은 광학 핀셋을 사용하여 RNA 단백질 상호 작용을 연구하기위한 완벽한 실험 워크플로우를 제공합니다. 공초점 현미경 검사법과 광학 핀셋의 조합을 포함하여 몇 가지 가능한 실험 설정이 설명되어 있습니다.

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

여기에서는 최대 1.2kHz의 속도로 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노기계적 측정을 수행하는 고속 자기 핀셋 설정에 대해 설명합니다. 우리는 모델 시스템으로 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체에 대한 적용을 소개하지만 기계 생물학적 사건에 관여하는 다른 분자에도 적용 할 수 있습니다.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

이 프로토콜은 단일 분자 자기 핀셋을 사용하여 텔로미어 DNA 결합 단백질(텔로미어 반복 결합 인자 1[TRF1] 및 TRF2)과 인간 세포에서 추출한 긴 텔로미어 간의 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. 텔로미어 및 텔로메릭 반복 결합 인자에 대한 준비 단계, 단일 분자 실험의 실행, 데이터 수집 및 분석 방법에 대해 설명합니다.

Single-Molecule Magnetic Tweezers를 사용한 텔로머 단백질-DNA 상호 작용 분석

광학 해상도 photoacoustic 현미경 (또는 - PAM)는 영상 광학 흡수 능력이 새로운 기술을...

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

우리는 짧은 DNA 분자의 기계적 성질을 탐험 할 수있는 일정한 힘을 축 광 핀셋의 사용을 보여줍니다. 축 방향으로 DNA를 스트레칭함으로써, 우리는 우리 ~ 100 nm의 짧은으로 DNA 분자를 연구 할 수 있습니다 steric hindrances 및 종래의 측면 조작하여 발생하는 유물을 최소화합니다.

상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

간편하고 재현 절차는 일반적인 상업적으로 이용 가능한 유형 I 콜라겐 모노머에서 세 구조적으로 구분 콜라겐 어셈블리를 만들기위한 설명되어 있습니다. 기본 유형은 섬유 긴 간격 또는 segmental 긴 간격 콜라겐은 300 nm의 긴 1.4 나노 미터 직경 단량체 빌딩 블록이 노출되는에 조건을 변화하여 구성 할 수 있습니다.

기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

배우세요 광 핀셋을 이용한 단일 RNA 분자의 기계적 전개 실험 방법입니다. 미세 비드와 유동 챔버를 활용하여 RNA의 2차 및 3차 구조 폴딩 역학을 정밀하게 분석하고 분자 상호작용을 평가할 수 있습니다.

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

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