Name: Aip1p 역학은 굴지의 R256H 돌연변이에 의해 변경 있습니까 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 배우세요 효모에서 돌연변이 액틴을 발현할 때 Aip1p 단백질 역학을 TIRF 현미경으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 세포골격 역학 연구에 필수적인 도구입니다.

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저자는 원래 PB1996 클론 유용 토론 및 기술 자문 피터 루벤스 타인 데이비드 Pellman 감사합니다. 이 작품은 천의 월에서 그랜트와 어린이를위한 라이드의 자금에 의해 지원되었다.

1. PB1996 플라스미드에 복제 <ol><li> 설계 및 주문의 DNA 표적 서열의 측면과 선택된 상위 플라스미드 독특한 제한 부위를 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 제조 회사로부터 프라이머. 주 :이 경우, 프라이머 Aip1 서열의 5 &#39;말단에서 400 염기쌍을 증폭하도록 고안되었다. XhoI에 제한 사이트는 약 20 bp의 Aip1 순서 전에 프라이머로 통합하고, XmaI는 대상 Aip1 순서 후 약 20 BP를 포함되었습니다. 클로닝에 사용되는 플라스미드는 형광위한 3XGFP 태그, 효모 균주 선택 URA 유전자 및 세균 선택 암피실린 내성 유전자를 포함 PB1996이었다. </li><li> 우라 효모 반수체 균주의 게놈 DNA를 정화. 참고 : 복제 프로세스의 다이어그램 그림 1을 참조하십시오. </li><li> 어느 EN에 제한 부위로 Aip1p 유전자를 증폭하기 위하여 두 개의 프라이머 및 효모 게놈 DNA를 사용하여 표준 PCR 반응을 실행D. PCR 제품을 소화하고 업체 당 별도의 반응에 제한 효소로 PB1996 플라스미드 프로토콜을 권장합니다. 이 경우 XmaI 및 XhoI에 1 시간 동안 37 ° C에서의 첨부 된 완충액으로 사용 하였다. </li><li> 소화 DNA 조각을 분리하는 0.8 % 아가 로스 전기 영동 젤을 실행합니다. 하나의 잘 낮은 DNA 질량 사다리를로드하고, 별도의 우물에서 각 소화에서 전체 반응을로드합니다. 염료 전면 겔의 끝 부분이 될 때까지 약 1 시간 동안 100 볼트에서 젤을 실행합니다. UV 광 하에서 겔을 시각화하고 단백질 세그먼트에 대응하는 세그먼트와 절단 된 플라스미드를 정제. </li><li> 소화 Aip1 세그먼트와 PB1996 플라스미드를 결찰. 배양 플레이트에 플레이트 (2 37 ° C에서의 시간 동안 SOC 미디어의 성장, 2 분 동안 42 ° C에서 얼음, 열 충격에 30 분 동안 100 ㎕의 세포를 10 μL의 DNA) 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 DH5α 세포에 제품을 변환 즉,이 경우 LB +에서, 선택을위한 항생제를 포함앰프의 접시. 선택과 액체 배양 한 식민지를 성장. 새롭게 디자인 된 플라스미드를 정화. </li></ol> 2. 돌연변이 효모의 생성 <ol><li> 말라의 대립 유전자가 돌연변이 효모를 구축하기 위해 삭제 된있는 반수체 효모를 사용합니다. 참고 :이 변형 염색체 액틴 유전자를 부족하고 야생형 효모를 암호화하는 플라스미드가 들어이 경우, 부모 변형 박사 피터 루벤스 타인 (아이오와 대학)에서 관대 한 선물이었고 건설 쿡 등 (20)에 의해 기술되었다. 액틴과 우라실. </li><li> 돌연변이 (21)에 대한 기본 플라스미드로 Trp의 + 선택과 PRS 플라스미드 인코딩 야생형 효모 액틴을 사용합니다. </li><li> 액틴에 과오 돌연변이를 엔지니어링하는 PRS 플라스미드에 부위 특이 적 변이를 수행합니다. <ol><li> 굴지의 R256H 돌연변이를 들어, 프라이머 5 그의 256 넘기는 256을 변경하는 &#39;ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3&#39;를합니다. 표준 돌연변이 유발을 실행단계 2.2에서 플라스미드 PCR 반응. </li><li> DH5α 세포로 PCR에서 돌연변이 말라 플라스미드를 변환 할 수 있습니다. 플라스미드 DNA를 분리하고 돌연변이를 확인하기 위해 굴지의 유전자 염기 서열. </li></ol></li><li> 2.1 단계에서 반수체 효모 균주에 돌연변이 효모 액틴을 코딩하는 플라스미드를 변환 할 수 있습니다. </li><li> 문화 Trp의 플레이트에 형질 전환 된 세포는 돌연변이 효모 말라 플라스미드를 포함하는 Trp의 +가 포함 된 효모를위한 선택합니다. </li><li> 세포는 5 - 플루오로 오로 산 (5-FOA)를 포함 접시에 Trp의 플레이트에서 하위 배양 세포에 의해 야생형 말라 우라실 (2.1에서 설명)을 인코딩 원래 플라스미드 부족에 대한 선택합니다. 5-FOA는 찬성의 기능 URA3 유전자를 발현하는 균주, 독성 형태, 5 flurouracil으로 변환됩니다. 단계적으로 선택 후 성장 세포는 돌연변이 말라 플라스미드를 포함합니다. </li><li> 새로운 효모 균주로부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다. 돌연변이 액틴 유전자가 존재하기 위해 플라스미드 시퀀스. 이들 사용추가 연구에서 훈련. 이 프로세스는도 2에 도시된다. </li></ol> 3. 효모 세포에 플라스미드를 변형 <ol><li> 효모 염색체 내에 통합을 허용하도록 제한 효소 Aip1p-GFP 플라스미드 다이제스트. 참고 : 제한 사이트는 형광 태그, 관심의 유전자 및 선택 마커를 포함하는 시퀀스 블록의 외부에 있어야합니다. 이 경우, 37 ℃에서 8 μL의 DNA와 1 시간 동안 동반 10X 버퍼의 1 μL로 HPAI의 제한 효소 1 μl를 사용 </li><li> 문화 S. 30 ° C에서 바퀴에 YPD 매체의 5 ML (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 포도당)에서 하룻밤 우라실 (우라 변형)을 합성 할 수 없습니다 (단계 2.5) 사카로 마이 세스 세레 비시 애 세포 1,000 X g에서 아래로 5 분 동안 세포를 1 ml의 스핀. </li><li> PLATE의 혼합물을 확인합니다. DDH 2 O의 43 ML 1 M 트리스 산도 7.5의 5 ㎖ 및 250 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 2 ㎖를 추가하여 10XTE을 추가 00.204 1XTE 20 ml의 폴리에틸렌 글리콜 다음 8g (PEG) (MW ~ 3300) 및 필터 살균 리튬 아세테이트 g. </li><li> 단계 3.2에서 스핀 다운 세포에서 뜨는을 가만히 따르다하고 나머지 액체에있는 세포를 재현 탁. 일시 중단 된 세포에, 10 ㎎ / ㎖ 연어 정소 캐리어 DNA의 2 μl를 추가합니다. 3.1 단계와 소용돌이에서 소화 플라스미드 DNA의 10 μl를 추가합니다. PLATE와 소용돌이의 0.5 ML을 추가합니다. 1 M DTT와 소용돌이의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 25 ℃에서 6-8 시간 동안 혼합물을 품어 가열은 10 분 동안 42 ° C에서 수욕 세포 충격. 그들은 우라 판에 밖으로 정착 microcentrifuge 관의 바닥에서 세포의 플레이트 100 μL. 2 ~ 3 일 또는 식민지 형성 할 때까지 30 ° C에서 알을 품다. </li><li> 아웃 우라 판에 각각의 식민지와 행진을 선택합니다. 참고 :이 세포의 성장을 허용 염색체에 통합 Aip1-GFP와 우라 유전자를 가진 플​​라스미드를 포함합니다. 이러한 세포는 다음 microsco에서 사용될평. </li></ol> 4. 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 Aip1p 단백질의 움직임을 시각화 <ol><li> 30 ℃에서 하룻밤 바퀴에 YPD의 통합 Aip1p-GFP와 효모 세포의 문화를 성장 의 우라 미디어 9 ㎖의 하룻밤 문화의 하위 문화 1 ㎖. 그들은 로그 성장 단계를 보장하기 위해 30 ° C에서 진탕에 추가로 3 ~ 4 시간 동안 세포를 성장. </li><li> 유리 현미경 슬라이드에 세포의 3 μl를 추가하고 coverslip에 추가합니다. 세포가 5 분 동안 슬라이드에 정착 할 수 있습니다. 무대 판의 브래킷에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 목적 기름 침수 100X TIRF와 디지털 CCD 카메라를 사용하여 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 (488 NM)와 Aip1p-GFP 단백질을 관찰한다. SlideBook 5.0 소프트웨어를 사용하여, (획득 된 영상의 개별 프레임이 그림 2A에 제시되어있다) 5 프레임 / 초의 속도로 20 초 동안의 이미지를 얻을 수 있습니다. <ol><li> C에 초점을ELL 학생, 열린 SlideBook 5.0 소프트웨어 및 포커스 컨트롤에 액세스하려면 도구 모음에서 포커스 창 버튼을 클릭합니다. 범위 탭을 선택하고 100X-TIRF 목표를 선택합니다. 램프를 켜고 15 %에 램프 막대를 밀어 넣습니다. 2 × 2로 빈 설정을 변경합니다. 밝은 필드에 필터를 변경합니다. </li><li> 현미경, 컴퓨터 화면에 보이는 초점 세포를 가지고 미세 초점 다이얼을 사용합니다. </li><li> 포커스 창 내에서 컨트롤을 사용하여 램프를 끄고 살 수있는 필터를 변경하고 TIRFM 버튼을 클릭합니다. </li><li> 현미경의 오른쪽 포트에 연결된 TIRFM 조명기에에에 레이저 방출을 켭니다. </li><li> 포커스 창 내에서 스트림 탭을 선택한 다음 녹음을 시작하고 시야 버튼을 클릭 상자를 선택합니다. </li><li> TIRFM 조명기에서, 레이저의 입사각을 조정하기 위해 마이크로 미터를 돌려. 이것은 Aip1-GFP 병소에서 형광 방출을 최적화하고부터 배경 형광을 최소화하기 위해 이용된다세포와 슬라이드. </li><li> 원하는 이미지가 표시되면, 시작을 누릅니다. 20 초, 키를 눌러 정지 후. 이미지를 저장합니다. 기본 메뉴 표시 줄에서 파일 탭에서 다른 이름으로 저장 슬라이드를 선택하고 파일 위치와 이름을 입력합니다. </li></ol></li><li> 이미지를 분석 ImageJ에 소프트웨어를 사용합니다. 형광 Aip1p의 초점의 움직임과 속도를 추적하기 위해 매크로 플러그인 &quot;수동 추적기&quot;를 사용합니다. 0.2 초에 시간 간격 매개 변수를 변경합니다. <ol><li> 추가 트랙 선택을 사용하여 선택하고 4-8 결합 프레임을 각각의 형광 단백질을 추적 할 수 있습니다. 최종 트랙 명령을 사용하여 각 프레임 사이의 단백질 운동의 속도는 결과 창에 표시됩니다. </li><li> Microsoft Excel 스프레드 시트를 사용하여 각 프레임 사이의 평균 속도를 결정합니다. 또한 각각의 세포주에 대한 Aip1p 운동의 평균 속도를 계산하기 위해 값을 사용한다. 참고 : Aip1p 운동과 평균 비선형 속도의 속도의 산점도는 Figu에 표시됩니다2B를 다시. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

병원성 돌연변이에 대한 연구에서 세포 골격과 유틸리티의 역학을 시각화 할 수있는 효과적인 전략은 여기에 설명되어 있습니다. 고급 영상 기법은 세포막에 가까운 단백질의 세포 내 이동을 이해하는 새로운 기회를 만들었습니다. 전반사 형광 현미경 (TIRF)는 살아있는 세포의 기능 연구를위한 중요한 기술이다. TIRF는 커버 슬립과 수성 매질의 굴절률의 차이로 인해 사라져가는 필드를 만들고 각진 여기 레이저를 사용합니다. 에바 네 센트 필드 에너지는 형광 물질을 자극하지만, 커버 슬립과 물 사이의 계면의 거리와 함께 지수 적으로 감소한다. 이 잡음 비율과 커버 슬립 / 매체 인터페이스 위의 50 ~ 250 nm의에서 강력한 해상도 높은 신호가 발생합니다. 이러한 자질은 TIRF 현미경에게 적은 비용으로 살아있는 세포에서 단일 분자 수준에서 세포 골격 단백질을 시각화 할 수있는 강력한 도구를 만들광독성 및 기타 기술 (24)에 대한 향상된 대비 상대 - 26. <p class="jove_c...

악틴 세포 골격을 구성하는 지배적 인 단백질과 세포 분열, 세포 기관의 움직임, 세포 운동성, 수축, 및 신호 등의 중요한 세포 과정에 참여하고 있습니다. 지난 10 년간 굴지의 질병을 일으키는 돌연변이는 근육 병증에서 관상 동맥 질환 1-7로, 질환의 범위에 이르는 6 인간 말라 이소 각각 발견되었다. 말라의 돌연변이가 질병으로 이어질하는 과정은 밝혀 계속. 효모 모델은 하나의 필수 말라 이소, 유전 온순함과 굴지의 순서와 기능의 높은 보존의 장점으로 인해 굴지의 기능에 대한 변이의 생화학 적 효과를 연구하기위한 황금 표준 남아있다. 연구는 개별 말라 돌연변이가 지배적 인 부정적인 영향 8 분자의 특정 기능 장애로 이어질 것을 보여줍니다. 예를 들면,리스 - 118 잔기에 영향을 γ-비 - 근육 액틴의 난청 유발 돌연변이에 의해 규제를 변경할액틴 결합 단백질 Arp2 / 3 9. 연구 자주 체외에서 사용하는 단백질의 분석 : 단백질 상호 작용을. 세포 생물학에 돌연변이를하는 걸하고, 특히, 셀에 결합 단백질의 현지화를하는 걸의 효과에 대한 조사가 제한됩니다. 생체 내에서 효모 세포 골격의 연구는 종래 거꾸로 형광 현미경 (10)에서 고정 된 세포의 이미지에 의존하고 있습니다. 이 실험은 액틴 세포 골격의 형태에 대한 기초 자료를 제공. 조사는 이후 복잡한 세포 구조 네트워크 (11), (12)를 시각화하는 세 가지 차원 공 촛점 이미징을 통합했다. 이 영상은 말라 패치 및 필라멘트의 풍요와 상대 위치의 정량화를 허용합니다. 얇은 단면도 전자 단층 보존 세포 내 구조물 (13)에 상대적으로 조밀 사상 네트워크의 모폴로지 화상에 사용되어왔다. 붐비는 세포의작은 단면 걸음이 기술로 미세 자세히 검사 할 수 있습니다. 영상 연구는 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포에 확장되었습니다. 사진 표백 및 배경 형광이 검토 될 수있을 때, 시간 경과 영상은 조사 세포 골격 단백질의 역학 및 환경 조건 (11), (14)에 대한 응답으로 할 수 있습니다. 별도로, 체외에서 액틴 필라멘트의 역학의 시각화는 전체 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경의 도입에 의해 진행되었다. 폭 넓은 분야 현미경에 비해 TIRF는 감소 배경 형광의 장점과 개별 필라멘트 (15, 16)를 모니터링하는 향상된 명암이있다. 이러한 특성으로, TIRF 현미경 원형질막 (17, 18)에 셀룰러 구조를 모니터링하는 세포 생물학에서 적응되었다. 세포 골격의 변화를 포함하여 세포 사건, 수저 광독성, 최대한의 대비, 최소한의 배경 개화 (19)를 실시간으로 시각화 될 수있다. 더 나은 운동, 현지화, 셀, TIRF 현미경과 단백질 태그의 세포 골격 단백질의 회전율에 말라 돌연변이의 효과를 이해하기 위해 사용되었다. 여기서, 사카로 마이 세스 세레 비시에있는 골격 역학 굴지의 임상 적 돌연변이의 효과를 연구하는 방법이 설명되어 있습니다. 특히, 액틴 결합 단백질, Aip1p의 현지화 및 움직임이 가시화하고 굴지의 R256H 돌연변이를 발현하는 세포의 정량 하였다. 이 기술은 생체 외 생화학 적 연구를 보완하고 단백질 상호 작용 및 기능의 큰 이해를 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>rpi</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Amresco</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Change-IT 다중 돌연변이 부위 지시 돌연변이 유발 키트</td><td>USB Corporation</td><td>4166059</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>DNA, 연어 고환</td><td>에서 단일 가닥Sigma</td><td>9007-49-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>93302</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td>경고! 유해한 자극</td></tr><tr><td>곰팡이/박테리아 DNA 키트</td><td>Symo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>HpaI</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트</td><td>AlfaAesar</td><td>6108-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Low DNA Mass Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>NE Buffer #4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>12532-016</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>모든 키트가 작동합니다</td></tr><tr><td>. 빠른 결찰 키트</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris 베이스 초순수</td><td>rpi</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 젤 및 PCR 클린업 시스템</td><td>Promega</td><td>1/6/2015</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>YPD 미디어</td><td>LabExpress</td><td>3011-URA</td><td></td></tr> <tr><td>미디어</td><td>LabExpress</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>Invitrogen</td><td>4359659</td><td>모든 PCR 기계가 작동합니다.</td></tr><tr><td>TIRF 현미경</td><td>올림푸스 IX81</td><td></td><td></td></tr><tr><td>하마마츠 ORCA-R 카메라</td><td>하마마츠</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aip1p 역학은 굴지의 r256h 돌연변이에 의해 변경 있습니까

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

굴지의 변이는 종종 세포 골격 기능을 변경하는 특정 분자의 변화로 인해 인간의 질병의 범위가 발생할 수 있습니다. 본 연구에서는 형광의 영상은 전체 내부 형광 (TIRF) 현미경은 세포 골격 역학의 변화를 시각화하고 정량화하는 데 사용됩니다를 사용하여 단백질을 태그. TIRF 현미경과 형광 태그의 사용은 굴지의 돌연변이에 의해 발생 골격 역학의 변화를 정량화 할 수 있습니다. 이 기술을 이용하여 살아있는 세포에서 세포 골격 함수의 정량화는 소중하게 단백질 기능의 시험 관내 연구를 보완한다. 예를 들어, 액틴 잔기 R256에 영향 과오 돌연변이는이 아미노산 규제 상호 작용에서 중요한 역할을 제안하는 세 인간 액틴 동형에서 확인되었다. 골격의 움직임에 말라의 돌연변이 R256H의 효과는 효모 모델을 이용하여 연구 하였다. 말라 해중합에 cofilin을 지원하는 것으로 알려져 있습니다 단백질, Aip1는했다N-말단에 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그와 TIRF 현미경을 사용하여 생체 내에서 추적. 야생형과 돌연변이 균주 모두에서 Aip1p 운동의 환율을 정량 하였다. R256H 돌연변이 액틴을 발현하는 세포에서 Aip1p의 움직임은 제한과 운동의 비율은 1.60에 비해 R256H 세포에서 0.88 ± 0.30 μm의 / 초 (야생형 세포에서 측정 거의 절반의 속도입니다 ± 0.42 야생형 세포 μm의 / 초, P &lt;0.005).

이미지에 대한 방법은 셀의 골격 단백질의 동역학이 제시된다. 액틴 결합 단백질, Aip1p는 GFP 태그했다. 태그 된 제품을 코딩하는 플라스미드를위한 디자인은도 1에 도시된다. 플라스미드 후 효모 세포로 형질 전환 하였다. 형광 발현은 Aip1p는 셀의 단백질 거동의 시각화를 허용 태그. Aip1p는 일반적으로 엔도 시토 시스 (22)의 사이트에서 말라 패치에 지역화. 그림 2A와 같이 Aip1p의 움직임을 정량화하기 위해 50 개 이상의 형광 Aip1p의 초점은, 10 개 이상의 셀에서 추적했다. 평균 속도는 각 형광 Aip1p 에리어 (도 2b 참조)에 대하여 계산 하였다. 야생형 세포에서 Aip1p 운동은 셀에 걸쳐 다양하고, 나중에 사라진다. 야생형 세포 Aip1p의 움직임의 속도는 보통 / 초 1.60 ± 0.42 μM이다. 말라 CY의 비정상적인 형태를 갖는 것으로 알려져 R256H 돌연변이 액틴을 발현하...

굴지의 질병을 일으키는 돌연변이는 세포 골격 기능을 변경할 수 있습니다. 골격 역학 전체 내부 형광 현미경을 사용하여 찬란 태그 단백질의 영상을 통해 정량화된다. 예를 들어, 세포 골격 단백질, Aip1p는 돌연변이 말라 이소, R256H을 발현하는 세포의 현지화 및 이동을 변경했다.

Aip1p 역학은 굴지의 R256H 돌연변이에 의해 변경 있습니까

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

본 절차의 전반적인 목표는 돌연변이 액틴 이소폼을 발현하는 효모 내에서 액틴 결합 단백질의 이동을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 플라스미드를 제작하고, 액틴 상호작용 단백질 one 또는 IP one P 유전자에 three x green fluorescent protein Fluor four를 태깅합니다. 두 번째 단계는 야생형 또는 돌연변이 액틴만을 발현하는 효모 균주를 생성하는 것입니다.다음으로, GFP가 태그된 A IP one P 플라스미드를 야생형 또는 돌연변이 효모 균주에 형질전환합니다. 마지막 단계는 야생형 및 돌연변이 효모 세포 내에서 태그된 A IP one P의 이동을 이미징하고 분석하는 것입니다. 최종적으로 전반사 조명 현미경을 사용합니다.형광 또는 turf 현미경법은 R256H 돌연변이 actin을 발현하는 효모에서 AIP1P의 이동 속도가 야생형 actin보다 느리다는 것을 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법은 결합 파트너들의 상대적인 시간적 이동과 같이 세포골격 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 저는 야생형 균주와 달리 돌연변이 효모 균주에서 AIP1P를 결손시켰을 때 치사성이 나타난다는 것을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.공초점 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 향상된 대비와 이미징 속도입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 조정 가능한 설정 항목이 매우 많고 이미지 품질의 판단 기준이 주관적이기 때문에, 개별 실험에 맞게 현미경 설정을 최적화하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 명시된 지침에 따라 A IP one PGFP 플라스미드와 변이 효모 균주를 제작하는 것으로 이 프로토콜을 시작하고, 플라스미드를 제한 효소로 절단하여 효모 염색체 배양액으로의 통합이 가능하게 하십시오.우라실을 합성할 수 없는 준비된 S-C-V-C-A 세포를 30 °C의 회전 배양기에서 5 mL의 YPD 배지로 하룻밤 동안 배양합니다. 세포 현탁액 1 mL를 1000 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그다음, 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 플레이트 혼합물을 제조하고 여과 멸균하며, 세포 상층액을 따라내고 남은 액체에 세포를 다시 현탁하여 세포 현탁액을 만듭니다.10 mg/mL salmon testes carrier DNA 2 µL를 첨가합니다. 그다음 소화된 plasmid DNA 10 µL를 넣고 볼텍싱한 후, 0.5 mL의 plate를 넣고 다시 한번 볼텍싱합니다. 마지막으로 1 M DI three etol 20 µL를 첨가하고 볼텍싱합니다.혼합물을 25 °C에서 6~8시간 동안 배양한 후, 42 °C 항온수조에서 10분 동안 세포에 열 충격을 줍니다. 마이크로 원심분리 튜브 바닥에 가라앉은 세포 100 µL를 취하여 minus U 플레이트에 도말합니다.30 °C에서 2~3일 동안 또는 콜로니가 형성될 때까지 배양합니다. 개별 콜로니를 선택하여 minus.ATE 배지에 스트리킹합니다. 현미경 관찰을 준비하기 위해, 이 세포들은 염색체에 A IP one GFP 및 UroGen이 통합된 플라스미드를 포함하고 있습니다.A IP one PGFP가 삽입된 효모 세포 배양액을 YPD 배지에서 30°C로 하룻밤 동안 휠 위에서 배양합니다. 하룻밤 배양한 배양액 1 mL를 9 mL의 minus Euro 배지에 분주하여 계대 배양합니다. 세포가 대수 성장기에 도달할 수 있도록 30°C 쉐이커에서 3~4시간 더 배양합니다.다음으로, 3 µL의 세포를 유리 현미경 슬라이드에 넣고 커버글라스를 덮습니다. 세포가 슬라이드 위에 안착될 때까지 5분 동안 기다립니다. 슬라이드를 스테이지 플레이트 브래킷에 고정하기 전, 오일 침수 100 x TIRF 대물렌즈와 디지털 CCD 카메라가 장착된 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 A IP one PGFP 단백질을 관찰합니다.세포에 초점을 맞추려면 slide book 5.0 소프트웨어를 열고 툴바의 focus window 버튼을 클릭하십시오. 초점 제어 기능에 액세스하려면 scope 탭을 선택하고 100 x turf 대물렌즈를 선택하십시오. 램프를 켜고 램프 바를 15%로 조절하십시오. 현미경의 bin 설정을 2x2로 변경하고 필터를 brightfield로 변경하십시오.컴퓨터 화면에 보이는 것처럼 세포가 초점에 맞도록 미동 초점 조절 나사를 사용하십시오. 초점 창 내의 제어 장치를 사용하여 램프를 끄고, 필터를 live로 변경한 다음, 현미경의 오른쪽 포트에 부착된 T-I-R-F-M 조사기의 T-I-R-F-M 버튼을 클릭하십시오. 레이저 방출을 on으로 설정하고 초점 창 내의 stream 탭을 선택하십시오.녹화 시작(start recording) 옆의 확인란을 선택한 다음, TIR FM 조명 장치의 명시야(brightfield) 버튼을 클릭하십시오. 마이크로미터를 돌려 레이저의 입사각을 조정합니다. 이는 원하는 이미지가 표시될 때 A IP one GFP foci의 형광 방출을 최적화하고 세포와 슬라이드에서 발생하는 배경 형광을 최소화하는 데 사용됩니다.시작 버튼을 누릅니다. 초당 5프레임의 속도로 20초 동안 이미지를 획득합니다. 20초 후, 중지 버튼을 누릅니다.메인 메뉴 바의 파일 탭에서 이미지를 저장하십시오. 'Slide as'로 저장하기를 선택하고 파일, 위치 및 이름을 입력하십시오. 다음으로, Image J 소프트웨어를 사용하십시오.이미지를 분석하려면 매크로 플러그인 manual tracker를 사용하여 형광 A IP one P foci의 이동과 속도를 추적하십시오. 시간 간격 파라미터를 0.2 seconds로 변경하십시오. add track 선택 기능을 사용하여 4~8개의 연속된 프레임 동안 개별 형광 단백질을 선택하고 추적하십시오.N track 명령을 사용하면 각 프레임 사이의 단백질 이동 속도가 결과 창에 표시됩니다. Microsoft Excel 스프레드시트를 사용하여 각 프레임 간의 평균 속도를 구하십시오.해당 값들을 사용하여 A IP one P 이동의 평균 속도를 계산하거나, 관심 있는 각 세포주에 대해 A IP one P 이동을 정량화하십시오. 10개 이상의 세포에서 50개 이상의 형광 A IP one P 초점을 추적하였습니다. 야생형 세포에서 A IP one P 이동의 대표적인 결과가 예상대로 나타나 있습니다.R 2 56 H 변이체 Acton을 발현하는 세포에서 형광 표지된 a IP one P는 세포 전체를 빠르게 이동한 후 사라집니다. a IP one P는 야생형 세포와 비교하여 이동성이 더 낮습니다. Image J를 사용하여 a IP one P의 궤적을 추적함으로써 단백질의 이동을 정량적으로 매핑합니다.야생형 균주에서 A IP one P는 세포 전체에 걸쳐 분포하지만, 제한된 영역 내에서만 이동합니다. mutant acton 균주에서는 각 형광 A IP one P 영역에 대해 평균 속도를 계산하였습니다. 야생형 세포에서 A IP one P 이동의 평균 속도는 1.60 ± 0.42 µm/s입니다. 액틴 세포골격의 비정상적인 형태를 갖는 것으로 알려진 R 2 56 H 돌연변이 액틴을 발현하는 세포는 돌연변이 균주에서 변화된 A IP one P 표현형을 나타냅니다.A IP one P의 이동은 제한적이며 더 느립니다. A IP one P 이동의 평균 속도는 0.88 ± 0.30 µm/s입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 turf 현미경을 사용하여 세포골격 단백질을 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차를 수행하는 동안 세포가 건조되거나 광퇴색(photo bleached)되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

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Aip1p 역학은 굴지의 R256H 돌연변이에 의해 변경 있습니까

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