고립 된 혈액 관류 쥐 폐 준비에 단일 미세 혈관 투과성의 양을

본 실험 절차의 전반적인 목적은 형광 기반 방법을 사용하여 분리된 쥐 폐의 단일 미세혈관 투과성을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 쥐의 폐를 분리하고 자가 혈액을 관류함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 좌심방 미세카테터를 폐의 작은 영역에 삽입하여 형광 표지된 덱스트린을 주입하는 것입니다.

그런 다음 표지된 덱스트린을 주입하는 동안 폐 미세혈관의 이미지를 수집합니다. 마지막 단계는 소프트웨어를 사용하여 이미지로부터 단일 미세혈관의 투과성을 정량화하는 것입니다. 최종적으로, LPS 처리 후와 같은 서로 다른 조건 하에서 폐 미세혈관의 투과도 정도를 확인할 수 있습니다.

이 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Kava Kasami 박사가 시연하겠습니다. 먼저, 마취 상태가 확실히 유지되고 있는 수컷 쥐의 기관 절개술을 수행하십시오. PE 90 기관 캐뉼라를 사용하고 봉합사로 고정합니다. 다음으로, 21 gauge 버터플라이 바늘을 사용하여 심장에 100 to 200 units의 heparin을 주입하십시오.

1분간 기다린 후 혈액을 전부 제거합니다. 제거한 혈액을 수집하여 식염수와 함께 따로 보관합니다. 길이가 4cm이고 한쪽 끝이 확장된 3mm tigon 튜브로 제작된 캐뉼라 2개를 채웁니다.

이제 흉강 절개술을 수행합니다. 우심실로 캐뉼라를 삽입할 수 있을 만큼만 충분히 절개한 후, 한쪽 캐뉼라의 확장된 끝부분을 폐동맥 방향으로 밀어 넣습니다. 봉합사로 캐뉼라를 고정합니다.

동일한 기술을 사용하여 다른 캐뉼라를 좌심실의 심첨부에서 좌심방 방향으로 삽입합니다. 2mm 너비의 탯줄 테이프로 이를 고정합니다. 이제 방해가 되는 결합 조직을 제거하고, 캐뉼라가 삽입된 상태의 폐와 심장을 함께 적출합니다.

폐의 횡격막 표면이 위를 향하게 하고 세 개의 캐뉼라를 모두 정렬시킨 상태로 페트리 접시에 옮깁니다. 해부된 표본을 압력 트랜스듀서에 연결된 18번 티곤 튜브(tigon tubing)가 유입 및 유출 튜브 역할을 하도록 설치된 조절 가능한 스테이지로 이동시킵니다. 이제 수집한 혈액을 동일한 부피의 5% albumin 용액과 혼합합니다.

이 혼합물을 로딩 리저버에 넣습니다. 펌프를 14 milliliters per minute의 속도로 작동시킵니다. 튜브 내부에 기포가 없는지 확인하십시오.

준비 단계에서 폐동맥을 폐 유입 튜브에 연결하고, 좌심방 캐뉼라를 유출 튜브에 연결합니다. 튜브 내에 공기가 없는지 다시 한번 확인하고, 션트가 열려 있는지 확인하십시오.

기관 캐뉼라를 세 번째 압력 변환기에 연결합니다. 30% oxygen으로 기관 캐뉼라를 통해 폐를 팽창시킵니다. 폐를 5 cm H₂O 압력으로 유지합니다.

이제 션트를 클램프로 고정하고 펌프를 14 milliliters per minute로 가동합니다. 폐 관류를 시작하려면, 관류 중에 펌프를 조절하여 폐동맥압을 약 10 centimeters of water로 유지하고 좌심방압을 3 centimeters of water로 유지하십시오. 혈액이 주입된 폐를 준비하는 것부터 시작하십시오.

먼저, 30cm 길이의 PE 90 튜빙 안에 40cm 길이의 PE 10 튜빙을 삽입하여 주입 카테터를 제작합니다. PE 10 튜빙의 반대쪽 끝을 1cc 주사기에 연결된 30게이지 바늘에 부착합니다. 폐에 연결된 튜빙의 끝부분을 준비된 시료 위로 가져온 후, 주입 카테터를 여기에 연결합니다.

주입 카테터를 좌심방으로 안내한 다음, 저항이 느껴질 때까지 폐 안으로 진입시킵니다. 과도한 힘을 가하면 폐에 손상을 줄 수 있습니다. 마이크로카테터로 인해 폐에 손상이 발생하면 프로토콜의 성공률이 낮아지므로, 마이크로카테터의 적절한 삽입이 매우 중요합니다.

다음으로, 주사기에 Ringer액을 채워 펌프에 연결합니다. 분당 10 µL의 속도로 용액을 천천히 주입하십시오. 주입 부위를 제외한 폐 표면을 촉촉하게 유지하기 위해 플라스틱으로 빠르게 감싸면, 점차 주입 부위가 폐의 나머지 부분에 비해 창백해질 것입니다.

이제 폐를 시각화하기 위해 22 millimeter 커버슬립에 O-링을 부착하여 관찰창을 만듭니다. 스톱콕 그리스를 사용하여 O-링을 시험관 홀더에 고정하십시오. 그런 다음 관찰창을 주입 부위 위에 배치합니다.

20 x 대물렌즈를 커버슬립 위로 회전시켜 위치시키고 폐에 초점을 맞추어 설정을 완료합니다. 시각적 왜곡은 발생하지 않아야 합니다. 이제 선택한 용액을 폐에 주입하십시오.

이 예시에서는 식염수 투여 후, 시린지 펌프를 사용하여 1 mL의 ZI 결합 덱스트린을 60분에 걸쳐 폐에 주입합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 1시간의 주입 과정 동안 1분마다 한 장의 이미지를 기록하고, 이어지는 세척 단계 동안 10분 더 기록을 계속합니다. FITC-덱스트린 주입이 끝나면 동일한 유량으로 링거액을 최소 10분 더 주입하여 이를 세척합니다. 이후 획득한 이미지를 분석할 때, FITC 주입 중 관심 영역의 최대 형광 강도를 측정합니다.

그 다음, 10분간의 세척 후 잔류 형광의 최대 형광 강도를 측정합니다. 혈관 투과성의 변화는 박테리아 리포폴리사카라이드 처리 후 fitzy dextrin 주입을 사용하여 조사되었으며, 이는 LI의 널리 사용되는 모델입니다. Ringer액으로 처리한 미세혈관에서는 잔류 fit e 형광이 낮게 나타났으나, LPS로 처리한 혈관에서는 높게 나타났습니다. 또한, Ringer액 주입과 비교하여 LPS 주입은 투과성 지수의 유의미한 감소를 유발했으며, 이는 이미지 영역 내 모든 혈관에서 전반적인 투과성 증가가 일어났음을 시사합니다.

또한, 링거액 주입과 비교하여 LPS 주입은 투과성 지수를 유의하게 감소시켰으며, 이는 영상 영역 내의 모든 혈관에서 전반적인 투과성 증가가 일어났음을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후에는 고립된 조류 폐를 준비하고, 왼쪽 꼬리에 마이크로카테터를 삽입하며, 마이크로 수준에서 투과성을 정의하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.