세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

안녕하세요, 저는 헬싱키 대학의 신경과학 센터의 박사후 연구원인 Michel iv입니다. 안녕하세요, 저는 헬싱키 대학의 대학원생인 헬 스타인입니다. 이 비디오에서는 뇌 세포 행동 및 외상 후 상태에 대한 사진 이미징을 위해 쥐의 뇌에 국소 급성 외상을 적용하는 방법을 설명합니다.

하자, C, 급성 뇌 손상은 선진국 인구의 상당 부분에 영향을 미치는 심각한 병리학입니다. 다광자 현미경을 사용하면 생리학적 및 병리학적 조건에서 살아있는 설치류 뇌의 조직 맥락에서 세포를 연구할 수 있습니다. 여기에서는 주사기 바늘로 정위 찌르기로 적용되는 급성 뇌 손상 방법을 설명한 다음 뇌 세포 행동과 외상 후 상태에 대한 두 개의 광자 이미징

국소 뇌 손상의 정위 가해 방법은 급성 외상의 병태 생리학적 결과를 연구하는 도구입니다. 포유류의 뇌에서는 특정 뇌 영역을 특이적으로 표적으로 삼고 날카로운 바늘로 손상시켜 뇌 실질에서 원하는 너비와 깊이의 외상을 생성할 수 있습니다. 이 비디오에서는 급성 뇌 손상과 두개골 창 또는 두개골 얇아짐 절차를 함께 사용한 다음 외상 후 뇌의 뉴런과 신경교세포에 대한 두 개의 광자 이미징을 사용합니다.

여기에 제시된 모든 실험은 동물 실험에 대한 헬싱키 대학 규정에 따라 수행되며, 마우스는 케타민과 진의 복강 간 주사로 마취됩니다. 두개골을 노출시키기 위해 피부 조각을 제거한 다음 정위 매니퓰레이터에 부착된 가열 테이블의 이어바를 사용하여 동물을 고정합니다. 직경 0.3mm의 강철 바늘이 있는 주사기가 미세 주입 설정에 고정됩니다.

마이크로 주입 설정을 통해 쌍안 현미경을 사용하여 뇌의 정의된 영역에 외상성 찌르기를 적용할 수 있으며 두개골의 브레그 포인트를 찾습니다. 우리는 정위 좌표를 사용하여 관심 영역을 식별합니다. 우리는 고속 수술 드릴을 사용하여 표시된 지점에서 두개골을 부드럽고 조심스럽게 뚫습니다.

우리는 뚫린 우물에 찌르기를 바르고 우물 바닥 높이에서 시작하여 바늘을 0.5-2mm 깊이로 뇌에 잠시 담그십시오. 이 방법의 놀라운 장점은 동일한 작은 우물에 DI 또는 약물을 주입할 수 있으므로 손상 부위에 솔루션을 정확하게 전달할 수 있다는 것입니다. 피질에 용액을 전달하기 위해 전자 컨트롤러가 있는 마이크로 인젝터와 정위 매니퓰레이터에 부착된 10마이크로리터 주사기를 사용합니다.

유리 피펫의 끝이 뇌 표면에 닿을 때, 우리는 그것을 0.5에서 1mm 더 담급니다. 그런 다음 마이크로 인젝터 컨트롤러를 사용하여 초당 5나노리터의 속도로 0.5-2마이크로리터의 D 또는 약물 용액을 뇌에 주입합니다. 그런 다음 뼈를 부상 부위 주위에 부드럽게 뚫고 두개골의 둥근 조각을 제거합니다.

뇌 표면은 피질 완충액으로 헹구고 두개골 입구 위에 얇은 둥근 덮개 슬립을 놓습니다. 커버 슬립은 폴리 아크릴아미드 접착제로 밀봉되고 강철 홀더는 커버 슬립 상단에 접착됩니다. 두개골 창을 두개골에 강하게 부착하기 위해 치과 용 시멘트가 홀더 주위에 배치됩니다.

마취된 마우스는 두 개의 광자 현미경에 장착되고 세포는 살아있는 뇌 내의 손상 부위에서 이미지화됩니다. 이 이미지는 뇌 손상 후 3시간 후에 촬영되었습니다. 손상 부위는 성상세포의 GFAP 프로모터 아래에서 GFP를 발현하는 형질전환 마우스의 뇌에 나타납니다.

GFP가 녹색 성상세포를 발현하는 것 외에도, 많은 성상세포 세포는 황 반추위 1 0 1 주입에 의해 빨간색으로 염색됩니다. 흰색 섬유는 두 번째 고조파 생성 신호를 나타내며, 아마도 세포 외 기질의 섬유 구조를 시각화하는 것으로 보입니다. 두 번째 고조파 생성은 부상 부위를 묘사하는 귀중한 도구로 판명되었습니다.

이 신호는 단백질 섬유와 같은 비중심 대칭 구조에 의해 방출되며 외인성 염색이 필요하지 않습니다. 두 번째 고조파 생성 신호는 뇌 표면에서 가장 강렬하며 뇌 실질 깊숙이 퍼지지 않습니다. 이 이미지에서는 부상 부위에 활성화된 미세아교세포가 축적된 것을 볼 수 있습니다.

미세아교세포는 녹색으로, 두 번째 고조파 생성은 회색으로 표시됩니다. 부상 부위 근처에서 활성화된 미세아교세포는 두개골 표면을 준비하는 동안 분기 과정이 거의 없는 특징적인 형태를 나타냅니다. 정위 좌표를 사용하여 이미지화할 뇌 영역을 찾고 펜으로 표시합니다.

두개골 수색자 바로 위에 위치한 관심 영역은 피해야 하는데, 이 영역은 두개골이 덜 안정적이며 수막의 아래에 있는 큰 혈관으로 인해 이미징 품질이 저하되기 때문입니다. 최소한의 압력을 가하여 동물의 두개골에서 관심 영역 위에 접착제로 코딩된 두개골 홀더를 놓습니다. 그런 다음 홀더 주위에 치과용 시멘트를 놓고 두개골 홀더가 두개골에 단단히 접착될 때까지 약 5분 동안 기다립니다.

두개골 홀더의 개구부를 PBS로 여러 번 세척하여 잔류 중합되지 않은 접착제를 제거합니다. 쌍안 현미경으로 보면 두개골의 원형 영역은 일반적으로 관심 영역보다 직경이 0.5-1.5mm입니다. 쥐의 두개골은 두 개의 얇은 조밀한 뼈 층과 그 사이에 끼워진 두꺼운 해면질 뼈 층으로 구성되어 있습니다.

해면질골은 동심원으로 배열된 작은 구멍과 혈관을 포함하는 여러 개의 운을 포함하고 있으며, 얇아지면서 조밀한 뼈의 외층과 대부분의 해면골을 제거합니다. 고속 마이크로 드릴을 사용하여 드릴링 중 압축 공기를 사용하여 뼈를 날려 버립니다. 파편은 마찰로 인한 뼈의 과열을 피하기 위해 간헐적으로 드릴링을 수행합니다.

냉각, 액체의 보링 비트, 실온에서 유지하고 주기적으로 피질 완충액을 얇아지는 부분에 적용하여 열을 관찰합니다. 해면질의 뼈를 통과하는 혈관에서 약간의 출혈이 엷어지는 과정에서 발생할 수 있습니다. 이 출혈은 보통 몇 분 이내에 저절로 멈춥니다.

2차 고조파 생성 이미징을 사용하여 이 퐁지 뼈 조직의 대부분이 제거되었는지 확인하십시오. 이 단계에서 두개골 두께는 여전히 50마이크로미터 이상이어야 합니다. 두개골을 피질 완충액의 한 방울에 담그고 두개골 얇아짐 절차를 계속하십시오 미세 수술 블레이드 또는 마이크로 마감 버를 사용하여 두께 약 20 마이크로 미터, 직경 700 마이크로 미터의 매우 얇고 매끄러운 제제를 얻습니다 얇게 만드는 과정의 마지막 단계에서 두 번째 고조파 세대 이미징을 사용하여 제방을 반복적으로 검사합니다.

선택한 영역은 부상 전후에 이미지화할 수 있습니다. 외상으로 인한 수술로 인한 인공물을 통제하기 위해 얇은 영역의 여러 다른 영역을 이미지화해야 합니다. 가해. 얇은 영역 위에 바늘을 놓습니다.

그 밑에 큰 그릇이 없는지 확인하십시오. 찌르는 부위의 좌표에 따라 바늘을 뇌에 0.5-2mm 아래쪽으로 담그십시오. 바늘을 제거하고 급성 뇌 손상 후 나타나는 출혈을 억제합니다.

지혈 탐폰을 사용하여 혈전이 형성되고 부상 부위에서 맥동이 발생할 때까지 기다립니다. 예를 들어, 황 루민 1 0 1 또는 다른 염료를 함유하는 용액을 침착제는 두개창 제제를 위해 상기에서 설명한 것과 동일한 방식으로 손상 개구부에 주입할 수 있다. 두개골 엷게 하는 제제의 두개골 창과 대조적으로, 약물과 염료를 전달하기 위해 부상 부위에 반복적으로 접근할 수 있습니다.

모든 작업의 무균 상태를 유지하면 염증을 예방하여 얇아진 부위를 투명하게 유지하는 데 도움이 됩니다. 여기에서 두개골이 얇아진 후 이미지화된 부상 부위를 볼 수 있습니다. 왼쪽 이미지에서 외상 후 20분 후에 피질 뉴런의 YFP 라벨이 붙은 수상돌기로 둘러싸인 부상 쪽을 볼 수 있습니다.

오른쪽 이미지는 외상 후 5일이 지난 동일한 동물의 동일한 뇌 영역을 나타냅니다. 이 이미지에서 뇌 2광자 현미경의 또 다른 예를 볼 수 있습니다. 두개골이 얇아진 후 회색으로 표시된 두 번째 고조파 생성 신호로 뼈를 볼 수 있습니다.

왼쪽 패널에서 녹색으로 표시된 미세아교세포. 이 실험 설정에서는 오른쪽 패널에 표시된 것처럼 부상 부위 주변의 뼈 아래에서 미세아교세포를 관찰할 수 있습니다. 본 연구에서는 만성 두개골 창과 두개골 얇아짐 제제를 모두 사용하여 살아있는 뇌 내의 외상 후 상태에서의 세포 행동을 연구했습니다.

두 방법 모두 특정 장점과 제한 사항이 있습니다. 만성 두개골 창은 더 나은 해상도, 뇌 조직에 대한 더 깊은 침투 및 여러 이미징 세션의 편리함을 제공합니다. 반면, 두개골 얇아짐 시술은 영상 부위에 염증을 유발할 가능성이 적고 약물 및 염료의 반복적인 적용이 가능합니다.