Name: 세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 학습하세요 마우스 뇌 급성 외상 유도 및 두 광자 현미경 관찰 기법. 이 방법은 생체 내 뇌 세포 반응을 실시간으로 연구하여 외상 후 조건과 잠재적 치료 전략을 탐색하는 데 활용됩니다.

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우리는 GFAP-EGFP와 CX3CR1-EGFP 마우스 균주를 제공하는 프랭크 박사 키르히 호프에 깊이 감사드립니다. 작품은 핀란드의 국제 이동성 센터, Tekes, 핀란드의 신경 과학 대학원 (FGSN), 핀란드의 아카데미에서 교부금에 의해 지원되었다.

여기에 제시된 모든 절차는 동물 보호 (동물 실험 2,006분의 62에 핀란드 법)에 대한 현지 지침에 따라 수행 하였다. 동물 라이센스 (ESAVI/2857/04.10.03/2012)는 지방 자치 단체 (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA)로부터 얻은 것입니다. 1~3개월 세의 성인 마우스, 무게 24~38g은 인증 된 대학의 동물 시설에서 개별 케이지에 보관 음식과 물을 임의로 제공 하였다. 1. 두개골 창을 통해 뇌 손상 이미징 <ol><li> 동물을 마취하고 연산 필드를 준비 <ol><li> 필터 - 멸균 인산 완충 식염수 (PBS), pH를 7.4에 용해 케타민 (Ketalar, 80 ㎎ / kg)과 자일 라진 (Rompun, 10 ㎎ / kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 마취의 깊이를 확인하기 위해 마우스의 반사 신경 정기적으로 (꼬리와 발가락 핀치 프로브를) 확인하십시오. 적절한 때 적절한 마취를 유지하기 위해 용량을 증가하지만 overd을 피하기OSE. </li><li> 마취에서 회복 후 수술, 영상 세션 첫 번째 시간 동안 가열 패드를 사용하여 37.0 ° C에서 동물을 유지합니다. </li><li> 마르지 마우스의 눈을 보호하기 위해 눈에 윤활제를 적용합니다. </li><li> 염증과 뇌 부종을 줄이기 위해 피하 주사로 덱사메타손 (Rapidexon 수의사, 2 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 이전에 또는 즉시 수술 후 30 분까지 (Ketoprophene 복강 예를 들어,) 진통제를 관리 할 수​​ 있습니다. 동물이 같은 이동, 식사를하거나 음료, 또는 체중 감소에 거부감 같은 통증 증상을 나타내는 경우, 타액 분비, 입모, 또는 비정상적인 호흡은 수술 후 진통제의 주입을 반복 소리. </li><li> 면도 기계 (재료 및 장비를 참조) 마우스 &#39;머리를 면도. 수염의 손상을 방지. </li><li> 면도 영역을 청소하기 위하여 70 % 에탄올 용액으로 쥐의 머리에 피부를 치료. </li><li> 외과 용 가위를 사용하여 (자료 참조장비) 및 집게는 (재료 및 장비를 참조), 이마에 귀 사이의 중간 선으로부터 피부를 잘라. </li><li> 조심스럽게 무딘 미세 수술 칼날로 두개골에 부착 된 결합 조직을 쳤어요. </li><li> 옆으로 피부의 경계를 밀어 약간 머리와 피부 고정 용 두개골의 청각 구멍에 귀 막대를 잡아 당깁니다. </li><li> 멸균 PBS와 두개골을 청소하고 0.5 % 클로르헥시딘 디 글루코 네이트와 마우스의 머리에 수술 사이트를 치료 한 후 멸균 면봉 및 압축 공기의 조합을 사용하여 두개골 표면을 건조. </li></ol></li><li> 찌름 상해를 가하는 <ol><li> 동물 홀더와 작은 동물 정위 악기 (재료 및 장비를 참조) 놓습니다. </li><li> 동물의 두개골의 표면에 초점을 다음 정위 악기의 쌍안 현미경의 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 쌍안 현미경을 사용하여 두개골의 브레 그마 포인트를 찾습니다. </li><li> 레기를 확인정위 좌표를 사용하여 그 명. 참고 : 직접 표면 대뇌 피질의 혈관에있는 관심있는 지역을 피하십시오. 이러한 파괴는 강하게 외상의 진행에 영향을 줄 수 있습니다. </li><li> 선택 영역 위의 30 G 바늘을 배치하고 두개골 표면을 긁어서 대상 사이트를 표시합니다. </li><li> 영향을받는 뼈 표면적 불필요한 넓히는을 피하기 위해 모든 가능한 조치와 두개골을 드릴. 현미경으로 고속 수술 드릴을 (재료 및 장비를 참조)를 사용합니다. 액체가 뚫고 영역에 나타나는 경우 드릴 중지합니다. </li><li> 바늘로 뚫고 우물의 바닥을 터치합니다. </li><li> 찌르기 응용 프로그램 사이트의 좌표에 따라 0.5 ~ 2.0 mm의 깊이로, 뇌 (삽입 속도 5~10밀리미터 / 분)로 원활하게 바늘을 찍어. </li><li> 즉시 원하는 깊이 (후퇴 속도 5-10mm / 분)에 도달 한 후 바늘을 제거하고 작은 탐폰을 가진 찌름 후 나오는 피를 닦아 (SE전자 재료 및 장비). </li><li> 또는 마이크로 펌프 (WPI) 10 μL 해밀턴 주사기 유리 피펫과 조립을 사용하여 병변 부위에 100 μM Sulforhodamine 101의 미세 주입 또는 관심의 다른 화합물을 수행합니다. 참고 : 붕규산 유리 모세관에서 유리 피펫의 준비를하는 동안, 10 ~ 20 ㎛의 직경 끝을 날카롭게. </li><li> 2-5 NL / 초의 속도로 주입 솔루션의 250-1,500 NL 달이다. 참고 : 뇌 실질 조직에서 적어도 5 분 동안 주입이 끝난 후 피펫을 남겨, 다음 솔루션의 유출을 방지하기 위해 천천히 조심스럽게 제거합니다. </li></ol></li><li> 만성 뇌 창 개두 <ol><li> 부상 사이트의 주위에 원형 창을 부드럽게하고 신중하게 두개골을 드릴. 3 ~ 3.5 mm의 창 직경을 사용합니다. </li><li> 위스콘신 다루 피질 버퍼의 드롭 (125 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 10 mM의 포도당, 10 mM의 HEPES, 증류수 H 2 O 2 ㎜ 염화칼슘 및 2 mM의 망초)을 적용ndow. </li><li> 두개골 창에 둥근 유리 커버 슬립 (# 1.5 두께)를 배치합니다. </li><li> 커버 슬립 주위 피질 버퍼의 초과를 제거합니다. </li><li> 폴리 아크릴 접착제로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 (재료 및 장비를 참조). 참고 : 접착제가 커버 슬립의 상부면에 적용되지 않았는지 확인합니다. 커버 유리를 접착제로 오염되면, 정중 microblade로 오염 접착제 제거, 유리 안정적 두개골에 접착 될 때까지 대기하여 유리 표면에 접착제가 건조 얻는다. </li><li> 5 분은 접착제가 건조 할 때까지 기다립니다. </li><li> 금속 홀더가 배치 될 수 있도록 귀 바 높이 나사를 사용하여 헤드의 위치를​​ 조정한다. </li><li> 스틸 홀더의 링 (재료 및 장비를 참조) 폴리 접착제의 작은 금액을 적용합니다. </li><li> 거꾸로 감독 금속 홀더 손잡이와 유리 커버 슬립에 스틸 홀더 링 접착제. </li><li> 5 분은 접착제가 건조 할 때까지 기다립니다. </li><li> 엠점성 조건을 달성하기 위해 3.5 cm 배양 접시에 (또는 아날로그)의 폴리 아크릴 접착제를 가진 IX 치과 시멘트 (재료 및 장비를 참조). </li><li> 시멘트 + 접착제 혼합물로 두개골 윈도우의 테두리를 밀봉하고, 피부의 경계까지 동일한 혼합물과 두개골의 노출 된 표면을 커버. </li><li> 15 분은 시멘트 + 접착제 혼합물을 건조하게하고 귀 막대를 제거 할 때까지 기다립니다. </li><li> 그것은 프로토콜 3에서 설명한 바와 같이 그 영역과 제어 영역을위한 두 개의 광자 여기 현미경 (TPEM) 촬상을 수행한다. </li><li> 촬영 후, 동물 가열 패드에 마취에서 회복하고 완전 회복 될 때까지 관찰에서 개별 케이지에 보관 할 수 있습니다. 젖은 음식은 씹는 수분을 용이하게 제공 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 뇌 손상 이미징 얇게 두개골을 통해 <ol><li> 동물 Anaesthetizing 및 연산 필드를 준비 <ol><li> 마우스를 마취 및 외상 유도 준비를단계 1.1에 기재된대로. </li></ol></li><li> 머리 숱 찌름 상해를 가하는 <ol><li> 동물 홀더와 작은 동물 정위 악기 (재료 및 장비를 참조) 놓습니다. </li><li> 동물의 두개골 표면에 초점을 다음 정위 기기에 쌍안 현미경의 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 쌍안 현미경을 사용하여 두개골에 브레 그마 지점을 찾은 정위 좌표에 따라 이미지에 표시 할 뇌 영역을 식별하고 긁힘으로 표시합니다. 참고 : 두개골의 안정성이 그 지역에 손상과 두개골 숱이 위치, 두개골의 봉합을 통해 인근에 위치 할 수 없습니다. 또한, 큰 대뇌 피질 또는 수막 혈관과 두개골 봉합 아래에있는 수막 이미징 유물을 일으킬 가능성이 있습니다. </li><li> 동물의 두개골에 관심 영역에 접착제로 코팅 된 금속 홀더를 배치, 가벼운 압력을 적용하고 금속 홀더가 단단히 두개골에 붙어 될 때까지 5 분 동안 기다립니다. </lI&gt; <li> 점성 조건을 달성하기 위해 3.5 cm 페트리 접시 (또는 아날로그)의 폴리 아크릴 접착제로 치과 용 시멘트 (재료 및 장비를 참조) 섞는다. </li><li> 시멘트 + 접착제 혼합물과 금속 홀더의 테두리를 봉인하고 피부 경계까지 동일한 혼합물과 두개골의 노출 된 표면을 커버. </li><li> 15 분은 시멘트와 접착제의 혼합물을 건조 할 때까지 기다립니다. </li><li> nonpolymerized 접착제 잔존물이 씻겨 지도록, 얇아진 두개골 영역 및 PBS와 금속 홀더의 주변 부분을 여러 번 씻어. 참고 : 홀더에 두개골의 안정적인 부착을 보장하기 위해 매우 중요합니다. 이 영상 중에 준비 안정성을 가능하게한다. </li><li> 쌍안 현미경 고배율 모드를 사용하여, 직경 ~ 0.5-1.5 mm의 얇아진 두개골 영역을 생성하기 위해 고속 마이크로 드릴 두개골 뼈의 상부 층을 제거한다. 뼈 파편을 제거하기 위해 드릴링 동안 압축 공기를 사용합니다. 드릴링 intermittentl를 수행마찰 - 유도 과열을 피하기 위하여 씨닝 절차 중에 Y. 실온 용액을 사용하여 드릴 비트 차게 주기적 열을 흡수하는 얇아진 영역에 버퍼를 적용한다. 참고 : 대뇌 피질의 손상을 방지하기 위해, 얇은 층 (&lt;50 ㎛)까지 큰 지역 (&gt; 1.5 mm)를 통해 드릴하지 않습니다. 주 : 쥐의 두개골 뼈 구조가 해면 뼈의 두꺼운 층으로 구분 된 컴팩트 뼈의 두 개의 얇은 층으로 구성되어 있습니다. 혈관을 포함하는 해면 뼈의 형태로 동심원과 눈물 소관의 작은 구멍. 외부 컴팩트 뼈의 층과 스폰지 층의 대부분을 모두 제거하는 microdrill를 사용합니다. 해면골 내의 혈관의 중단 출혈의 원인이 될 수 있습니다. 이 출혈을 멈추게하는 지혈 콜라겐 스폰지를 사용합니다. </li><li> 해면골의 대부분이 제거되었는지 여부를 검사하는 두 번째 고조파 발생 (SHG) 영상을 사용합니다. 남은 뼈는 일이 있는지 확인, 과도한 숱 않도록주의준비 단계에서 50 ㎛보다 icker. </li><li> 얇게 영역의 상단에 따뜻한 버퍼의 드롭 (35 ~ 37 °의 C)를 넣습니다. 더 뼈 층을 제거하고 ~ 20 ㎛, 뼈 두께 직경 ~ 700 ㎛의 부드러운 영역을 형성하기 위해 부르 마무리 미세 수술 날 또는 마이크로를 사용합니다. 이 단계 동안, 반복적 SHG 촬상을 수행하고 정기적으로 뼈의 두께를 측정하는데 도움이된다. </li><li> 관심의 영역과 제어 영역에 대한 TPEM 이미징을 수행합니다. </li><li> 영역은 엄격히 수평 위치 박막화하는 방식으로 귀 바 높이 나사를 사용하여 헤드의 위치를​​ 조정한다. 얇아진 지역 위의 바늘을 배치하고 대상 사이트 아래에 더 큰 용기가 없는지 확인합니다. </li><li> 얇아진 두개골 표면에서 0.5 ~ 2.0 mm의 깊이로, 뇌에 바늘을 찍기 찌르기 응용 프로그램 사이트의 좌표에 따라하여 병변을 확인합니다. </li><li> 바늘을 제거하고 t 후에 나타나는 출혈을 억제그는 지혈 혈전 (재료 및 장비를 참조) 뇌 손상을 급성. 부상 사이트에서 혈전의 형태와 혈관 맥박이 멈출 때까지 기다리십시오. </li><li> 섹션 1.2.10에서 상술 한 바와 같이, 100 μM Sulforhodamine 101 또는 병변 사이트에 관심의 또 다른 화합물의 미세 주입을 수행합니다. </li><li> 프로토콜 3에서 설명한 손상의 진행 및 회복을 모니터하는 TPEM 촬상을 수행한다. </li><li> 촬영 후, 동물 가열 패드에 마취에서 의식을 회복 할 수 있습니다. 무인 동물을두고 만 전체 물리적 복구 후 자신의 홈 케이지에 반환하지 않습니다. </li></ol></li></ol> 3. 영상 <ol><li> 사용자 정의 내장 된 프레임에 금속 홀더를 부착하여 현미경으로 동물을 놓습니다. </li><li> 이미징, 마이 타이 DeepSee 레이저와 생체 내 두 광자에 최적화 XLPLN 25X 1.05 NA 침수 목적으로 장착 예 FV1000MPE 두 광자 현미경을 사용하여영상. </li><li> 광 시야 형광 모드를 사용하여 현미경으로 병변 사이트를 식별. 뇌 혈관을 시각화하고 혈관의 관찰 된 패턴에 따른 제어 영역을 선택하는 롱 패스 필터를 사용한다. </li><li> 이미지의 두 번째 고조파 발생 (SHG) 신호, 800 nm 파장에 조정 펨토초 레이저와는 380-410 nm의 바이 패스 필터를 사용하여 방출되는 빛을 수집합니다. 형광 이미징의 경우, 방출 된 광을 수집하기 위해 대역 통과 필터 (515-560 나노 미터)를 사용하고, 다음과 같은 파장의 형광을 자극하기 위해 사용된다 : GFP-860 NM, YFP - 950 nm의. </li><li> 이미지 수집을 위해 Fluoview 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 상점은 이후 반복 이미징을위한 모든 투자 수익 (ROI)의 좌표. 이미지 시간에 동일한의 ROI를 코디네이터에게 이미지의 중첩을 극대화하기 위해 모든 시간을 조정합니다. </li><li> 해당 소프트웨어 (예. ImageJ에) 이미지를 분석합니다. 여기에 제시된 복원은 Imaris 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. </li></ol>

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뇌 손상은 갑작스러운, 예측할 수없는 이벤트입니다. 여기에서, 우리는 신경 변성, 수상 돌기의 제거, 뇌 부종, 아교 흉터, 초점 지주막 하 출혈과 함께 대뇌 피질의 출혈과 증가 투자율과 같은 뇌 손상 후에 인간의 환자에서 관찰 된 병리학 적 변화의 스펙트럼을 재현 동물 모델을 설명 혈액 - 뇌 장벽. 기본 및 보조 기전뿐만 아니라, 외상 후 회복을 연구하기 위해이 부상 모델은 미세 신경 세포와 신경 교세포 구조의 생체 내 시각화의 길이와 결합했다. 유전자 변형 마우스 라인은 (Thy1-YFP-H) 7, 성상 세포 (GFAP-EGFP) 8 신경 세포에 형광 단백질을 표현하거나, 미세 아교 세포 (CX3CR1-EGFP) 9이 사용되었다. 또한, 우리는 Sulfarhodamine 101 (10)와 두 번째 고조파 발생 (SHG) 이미징 및 성상 세포의 로딩을 사용했습니다. 여기에 설명 ...

급성 뇌 손상은 자동차 충돌에서 부상의 높은 발병률과 중요한 공중 보건 문제가 떨어지거나 공격, 이후 만성 장애의 높은 보급. 뇌 손상의 치료에 대한 치료 적 접근 따라서, 병원 전 수술 및 중환자 치료의 효과를 제한하는, 완전히 증상이 남아 있습니다. 이것은 뇌 손상의 사회 경제적 영향은 특히 심각합니다. 여러 가지 이유로, 임상 시험의 대부분은 새로운 치료 방법을 사용하여 뇌 손상 후 회복에 개선을 보여 못했습니다. 동물 모델은 약물 효능은 뇌 손상 환자에서 예상 할 수있는 무대를 향해 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 매우 중요합니다. 현재, 두부 외상의 몇 가지 잘 설립 된 동물 모델은 제어 대뇌 피질의 영향 1, 유체 타악기 부상 2, 동적 대뇌 피질의 변형 3, 체중 저하 등의 존재4, 그리고 사진 부상 5. 실험 모델의 숫자는 두부 외상 관련 병리의 특정 형태 학적, 분자 및 행동 양상을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, 하나의 동물 모델은 새로운 치료 전략을 검증하는 데 완전히 성공하지 않습니다. 뇌 손상, 신뢰성 및 재현성 제어 된 동물 모델의 개발은 복잡한 프로세스 병리학을 평가하기 위해 필요하다. 최신 현미경 이미징 기술과 유전자 인코딩 형광 기자의 신규 조합은 기본 상해, 차 상해, 및 재생의 확산, 차 상해를 포함 뇌 손상의 모든 단계를 조사 할 수있는 전례없는 기회를 제공합니다. 특히, 생체 이광자 현미경 설치류 뇌의 깊은 층의 피질 세포에서도 세포 내 구조물의 실시간 시각화를 허용하는 고유의 비선형 광학 기술이다. 세포와 ORGA 여러 종류의nelles 다른 형광 마커를 조합하여 동시에 영상화 할 수있다. 이 강력한 도구를 사용하여, 우리는 외상 후 조건에서 뇌 생활에 동적 인 형태 학적 및 기능적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 뇌 손상 연구에서 생체 내 두 광자 현미경의 장점은 최근 키로프와 동료 6에 의해 입증되었다. 마일드 초점 피질 타박상 모델을 사용하여, 이들 저자들은 pericontusional 피질 급성 돌기 부상이 로컬 혈류의 감소에 의해 게이트 된 것으로 나타났다. 또한, 그들은 타박상 사이트 주위의 대사 저하 피질이 더 확산 탈분극에 의해 손상되는 것을 보여 주었다. 이 차 손상이 외상성 뇌 손상의 결과가 더 심각하고, 시냅스 회로에 영향을 미칩니다. 여기, 우리는 지역의 두뇌를위한 고급 모델로, 동시 국소 약물의 응용 프로그램과 결합 될 수있는 주사기 바늘로 정위 찌르기의 방법을 제안한다상해 및 생체 내에서 포유 동물의 뇌에 급성 외상의 병태 생리 학적 결과를 연구 도구로.

<table><tbody><tr><td>2A-sa 벙어리 핀셋, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>30 G &frac12; 바늘</td><td>BD</td><td>REF 304000</td><td></td></tr><tr><td>동물 트리머, 면도 기계</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>쌍안 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 가열 패드가있는 생물학적 온도 컨트롤러</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>무딘 미세 수술 블레이드</td><td>BD</td><td>REF 374769</td><td></td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 붕규산 튜브</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>유리 피펫 생산용</td></tr><tr><td>Carprofene</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘 디글루코네이</td>트 <td>Sigma</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>치과 시멘트</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>FaunaPharma</td><td>라피덱슨 수의사</td><td></td></tr><tr><td>일회용 드릴</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 겸자, 110mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Ealing 마이크로 전극 풀러</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>유리 피펫 생산용 수직 풀러</td></tr><tr><td>눈 연고</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td></td></tr><tr><td>Foredom 드릴 제어</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Foredom 마이크로 모터 핸드피스</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>마우스 용 가스 마취 플랫폼</td><td>Stoelting</td><td>50264</td><td>입체 운동 기구</td></tr><tr><td>조립 지혈 콜라겐 스폰지</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol vet</td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee 레이저</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>금속 홀더</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microdressing 겸자, 105mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>WPI</td><td>MF34G-5</td><td>마이크로 주사기 충전 모세관</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>다광자 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil 주사기 10 &뮤; </td><td>l WPI</td><td>NANOFIL</td><td>해밀턴 주사기</td></tr><tr><td>부직포 면봉 5 x 5</td><td>Molnlycke 건강 관리</td><td>Mesoft</td><td>수술용 탬폰</td></tr><tr><td>폴리아크릴 접착제</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>라운드 유리 커버슬립&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 두께&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>작은 동물 입체 기구</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Stoelting 마우스 및 신생아 쥐 어댑터</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>입체 기구에 조립</td></tr>.<tr><td>학생 홍채 가위, 스트레이트 11.5cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>분자 프로브</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 마이크로 주사기 펌프 및 마이크로 4 마이크로 주사기 펌프 컨트롤러</td><td>WPI</td><td>UMP3-1</td><td>마이크로 인젝터 및 컨트롤러</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun vet</td><td></td></tr></tbody></table>

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

급성 뇌 손상은 종종 다른 사고 머리 손상의 결과 및 인구의 상당 부분 영향을 미치지 만, 그것에 대한 효과적인 치료법은 아직 없다. 현재 사용되는 동물 모델의 제한은 병리 메커니즘에 대한 이해를 방해. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 생리적, 병리 적 조건에서 그대로 동​​물의 뇌 내에서 세포와 조직을 연구 할 수 있습니다. 여기서는 외상 조건 하에서 뇌 세포 행동의 이광자 촬상 의해 공부 급성 뇌 손상의 두 모델을 설명한다. 선택된 뇌 영역은 뇌 실질 조직의 제어 폭과 깊이의 외상을 생산하는 날카로운 바늘로 부상하고 있습니다. 우리의 방법은 동시 약 응용과 결합 될 수있는 주사기 바늘로 찌름 정위를 이용한다. 우리는이 방법은 포유류의 뇌에 급성 외상의 병태 생리 학적 결과의 세포 메커니즘을 연구하는 고급 도구로 사용될 수 있음을 제시한다 <em&gt; 생체 내. 두개골 창 두개골 숱이 비디오에서는, 우리는 두 가지 준비를 급성 뇌 손상을 결합한다. 우리는 또한 외상 후 뇌 재생의 멀티 세션 이미징을위한 두 제제의 장점과 한계에 대해 설명합니다.

형질 전환 생쥐의 외상 후 뇌 영상 1) 만성 두개골 창 2) 머리 숱이, 우리는 두 가지 작업 절차를 최적화했다. 실험 준비의 개략도는 그림 1에 제시되어있다. 0.3 mm 외경 (30 G)의 스틸 바늘에 의한 외상 찌르기는 드릴 아니라 (그림 1A)에 적용됩니다. 머리 숱이 약 300 μm의 (그림 1C)의 제한을 적용하는 경향이있는 반면, 성공적인 두개골 창 준비 Thy1-YFP -의 3 차원 재구성에서와 같이, pial 표면 (그림 1B) 아래 650 μm의 최대 깊이에서 촬영을 할 수 있습니다 H 마우스 대뇌 피질의 피라미드 뉴런. 뇌 피질의 조절 볼륨있는 수상 돌기 모세 혈관 망의 파괴의 제거에서 사라지게 외상 결과. 제 이일 동안 병변 면적이 증가하고 외상 유도 수지상에 blebbing 및 수지상 후퇴 B의 형성perilesion 지역에서 UL...

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

안녕하세요, 저는 헬싱키 대학교 신경과학 센터의 박사후 연구원 Michel iv입니다. 안녕하세요, 저는 헬싱키 대학교의 대학원생 Hel Stein입니다. 이 영상에서는 뇌세포의 행동과 외상 후 상태를 광학 이미징으로 분석하기 위해, 마우스 뇌에 국소 급성 외상을 가하는 방법을 설명하겠습니다.급성 뇌 손상은 선진국 인구의 상당 부분에 영향을 미치는 심각한 병리 현상입니다. 다광자 현미경을 이용하면 생쥐의 살아있는 뇌 내에서 생리적 및 병리적 조건하에 조직 맥락 속의 세포들을 연구할 수 있습니다. 본 논문에서는 주사바늘을 이용한 정위 찔림 방식으로 유도하는 급성 뇌 손상 방법과, 이후 이어지는 뇌세포 행동 및 외상 후 상태에 대한 이광자 이미징 기법을 설명합니다.정위 고정법을 이용한 국소 뇌 손상 유발법은 급성 외상의 병태생리학적 결과를 연구하기 위한 도구입니다. 포유류의 뇌에서 특정 뇌 영역을 정밀하게 표적화하고 날카로운 바늘로 손상을 입힘으로써, 뇌 실질 내에 원하는 너비와 깊이의 외상을 유도할 수 있습니다. 본 영상에서는 급성 뇌 손상을 두개창 제작 또는 두개골 얇게 만들기 과정과 결합하여 시행한 후, 외상 후 뇌의 뉴런과 글리아 세포를 이광자 이미징으로 관찰하는 방법을 살펴보겠습니다.여기에 제시된 모든 실험은 헬싱키 대학교의 동물 실험 규정에 따라 수행되었으며, 마우스는 케타민과 자일라진의 복강 내 주사를 통해 마취되었습니다. 두개골을 노출시키기 위해 피부 조직 일부를 제거한 후, 정위 고정 장치에 연결된 가열 테이블의 이어 바를 사용하여 동물을 고정했습니다. 직경 0.3 millimeter의 강철 바늘이 장착된 주사기를 미세 주입 장치에 고정했습니다.미세 주입 설비를 통해 뇌의 특정 영역에 외상성 자극을 가할 수 있습니다. 쌍안 현미경을 사용하여 두개골에서 breg 지점을 찾습니다. 입체 좌표를 사용하여 관심 영역을 확인합니다. 고속 외과용 드릴을 사용하여 표시된 지점의 두개골을 부드럽고 조심스럽게 천공합니다.천공된 웰에 바늘을 대고 웰 바닥 높이를 기준으로 뇌 속으로 0.5에서 2mm 깊이까지 짧게 삽입합니다. 이 방법의 주목할 만한 장점은 동일한 작은 웰에 DI 또는 약물을 주입할 수 있어 손상 부위에 용액을 정확하게 전달할 수 있다는 점입니다. 피질로 용액을 전달하기 위해, 전자 컨트롤러가 장착된 마이크로 인젝터와 스테레오택틱 매니퓰레이터에 연결된 10 µL 시린지를 사용합니다.유리 피펫의 끝이 뇌 표면에 닿으면, 0.5~1 mm 정도 더 깊게 삽입합니다. 그런 다음 마이크로 인젝터 컨트롤러를 사용하여 D 또는 약물 용액 0.5~2 µL를 초당 5 nL의 속도로 뇌에 주입합니다. 이후 손상 부위 주변의 뼈를 조심스럽게 드릴로 뚫고 원형의 두개골 조각을 제거합니다.뇌 표면을 피질 완충액으로 헹구고, 두개골 개구부 상단에 얇고 둥근 커버슬립을 배치합니다. 커버슬립을 폴리아크릴아미드 접착제로 밀봉하고, 커버슬립 위에 스틸 홀더를 접착제로 고정합니다. 두개골에 크레이니얼 윈도우가 단단히 부착되도록 홀더 주변 전체에 치과용 시멘트를 도포합니다.마취된 마우스를 이광자 현미경에 고정하고, 살아있는 뇌의 손상 부위에서 세포 이미지를 촬영합니다. 이 이미지는 뇌 손상 3시간 후에 촬영되었습니다. 손상 부위는 별아교세포(astrocyte)의 GFAP 프로모터 하에서 GFP를 발현하는 형질전환 마우스의 뇌에서 확인되었습니다.GFP를 통해 녹색으로 발현되는 성상교세포 외에도, 많은 성상교세포들이 sulfur rumine 1 0 1 주입에 의해 적색으로 염색되었습니다. 흰색 섬유는 제2고조파 생성(second harmonic generation) 신호를 나타내며, 이는 아마도 세포외 기질의 섬유 구조를 시각화한 것으로 보입니다. 제2고조파 생성은 손상 부위를 묘사하는 데 유용한 도구임이 밝혀졌습니다.신호는 단백질 섬유와 같은 비중심 대칭 구조에서 방출되며 외인성 염색이 필요하지 않습니다. 제2고조파 생성 신호는 뇌 표면에서 가장 강하게 나타나며 뇌 실질 깊숙이 퍼지지 않습니다. 이 이미지에서 손상 부위에 활성화된 미세아교세포가 축적된 것을 확인할 수 있습니다.미세아교세포는 녹색으로, 제2고조파 생성은 회색으로 표시되었습니다. 손상 부위 인근의 활성화된 미세아교세포는 두개골 표면을 준비하는 동안 분지 돌기가 적은 특징적인 형태를 나타냅니다. 정위 좌표를 사용하여 이미징할 뇌 영역을 찾고 펜으로 표시하십시오.두개골 검색기 바로 위에 관심 영역이 위치하지 않도록 하십시오. 해당 영역은 두개골이 덜 안정적이며, 뇌수막의 하부에 있는 대혈관들이 영상 품질을 저하시키기 때문입니다. 접착제로 코팅된 두개골 홀더를 최소한의 압력으로 동물 두개골의 관심 영역 위에 배치하십시오. 그 다음 홀더 주변에 치과용 시멘트를 도포하고, 두개골 홀더가 두개골에 단단히 접착될 때까지 약 5분 동안 기다리십시오.중합되지 않고 남은 접착제를 제거하기 위해 스컬 홀더의 개구부를 PBS로 여러 번 세척합니다. 실체 현미경 하에서 관심 영역 위의 두개골을 보통 직경 0.5에서 1.5mm 정도의 원형 영역으로 얇게 깎아냅니다. 마우스의 두개골은 두 개의 얇은 치밀골 층과 그 사이에 낀 두꺼운 해면골 층으로 구성되어 있습니다.해면골은 동심원 형태로 배열된 작은 강들과 혈관을 포함하는 다수의 소관을 포함하고 있으며, 얇게 만드는 과정에서 치밀골의 외부 층과 해면골의 대부분을 제거합니다. 고속 마이크로 드릴을 사용하여 드릴링 중에 압축 공기로 뼈 부스러기를 날려 보냅니다. 마찰로 인한 뼈의 과열을 방지하기 위해 드릴링을 간헐적으로 수행하십시오.액체 내에서 냉각하여 상온으로 유지하고, 얇아지는 부위에 피질 버퍼를 주기적으로 도포하여 열을 관찰합니다. 얇게 만드는 과정 중에 해면골을 통과하는 혈관에서 약간의 출혈이 발생할 수 있습니다. 이러한 출혈은 보통 몇 분 이내에 자연적으로 멈춥니다.제2고조파 생성(second harmonic generation) 이미징을 사용하여 스펀지골 조직의 대부분이 제거되었는지 확인하십시오. 이 단계에서 두개골 두께는 여전히 50 µm 이상이어야 합니다. 두개골을 피질 버퍼(cortex buffer) 한 방울에 담근 후, 미세 수술용 칼이나 마이크로 피니싱 버(micro finishing bur)를 사용하여 두개골 얇게 만들기 과정을 계속 진행하십시오. 얇게 만드는 최종 단계에서 두께 약 20 µm, 직경 약 700 µm의 매우 얇고 매끄러운 표본을 얻을 때까지 제2고조파 생성 이미징을 사용하여 표본을 반복적으로 관찰하십시오.선택한 영역은 손상 유발 전후로 이미징할 수 있습니다. 외상 유발로 인해 수술 중 발생할 수 있는 인위적 결과물(artifact)을 제어하기 위해 얇은 영역의 여러 다른 부위를 이미징해야 합니다. 바늘을 얇은 영역 위에 배치하십시오.그 아래에 큰 혈관이 없는지 확인하십시오. 천자 부위의 좌표에 따라 바늘을 뇌 속으로 0.5에서 2mm 깊이로 찌릅니다. 바늘을 제거하고 급성 뇌 손상 후 발생하는 출혈을 억제하십시오.지혈 탬폰을 사용하여 혈전이 형성되고 손상 부위의 박동이 가라앉을 때까지 기다립니다. 예를 들어, sulfur Rumine 1 0 1 또는 다른 염료를 포함하는 용액을 위에서 설명한 두개창 준비 과정과 동일한 방식으로 손상 개구부에 주입할 수 있습니다. 두개골 박층 준비법의 경우, 두개창과 달리 약물 및 염료 전달을 위해 손상 부위에 반복적으로 접근할 수 있습니다.모든 조작 과정에서 무균 상태를 유지하면 염증을 방지하여 얇게 만든 영역의 투명도를 유지하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 두개골 박층화 후 촬영한 손상 부위의 이미지를 볼 수 있습니다. 왼쪽 이미지에서는 외상 20분 후, YFP로 표지된 피질 뉴런의 수지상 돌기로 둘러싸인 손상 부위를 확인할 수 있습니다.오른쪽 이미지는 외상 후 5일이 지난 동일한 동물의 뇌의 동일 영역을 나타냅니다. 이 이미지에서 뇌 이광자 현미경의 또 다른 예를 확인할 수 있습니다. 두개골을 얇게 만든 후, 회색으로 표시된 제2고조파 생성 신호를 통해 뼈를 관찰할 수 있습니다.왼쪽 패널에서 microglia가 녹색으로 표시되어 있습니다. 이러한 실험 설정에서는 오른쪽 패널에 나타난 바와 같이 손상 부위 주변의 뼈 아래에서 microglia를 관찰할 수 있습니다. 본 연구에서는 살아있는 뇌 내의 외상 후 조건에서 세포 행동을 연구하기 위해 만성 두개창(chronic cranial window)과 두개골 박층화(skull thinning) 준비법을 모두 사용하였습니다.두 방법 모두 특정한 장점과 한계가 있습니다. 만성 두개창(chronic cranial window) 방식은 더 높은 해상도와 뇌 조직 내 더 깊은 침투 깊이를 제공하며, 여러 차례의 이미징 세션을 수행할 수 있어 편리합니다. 반면, 두개골 박층화(skull thinning) 절차는 이미징 부위의 염증 유발 가능성이 더 낮으며, 약물과 염료를 반복적으로 투여할 수 있다는 장점이 있습니다.

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이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

이 비디오는 마우스의 외상성 뇌 손상(TBI)을 보여줍니다. 두개골을 노출시킨 후 TBI 부위를 표시합니다. 그런 다음 마우스가 TBI 장치 아래에 위치합니다. 충격은 금속 막대를 들어 올려 두개골과 접촉하는 임팩터에 자유롭게 떨어뜨릴 수 있도록 함으로써 전달됩니다.

마우스 뇌에 외상성 뇌 손상 전달

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

운동 선수는 매년 수백 건의 경증 외상성 뇌 손상 (mTBI) / 뇌진탕을 흡수합니다. 그러나 뇌에 대한 이들의 결과는 제대로 이해되지 못했습니다. 따라서 임상 적으로 적절한 증상을 반복적으로 반복하는 단일 및 반복 mTBI의 동물 모델은 mTBI 및 뇌진탕의 연구를 발전시킬 수있는 수단을 제공합니다.

단일 및 반복적 인 경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

이 프로토콜은 마우스 모델에서 경미한 외상성 뇌 손상을 설명합니다. 특히, 경미한 정중선 폐쇄 두부 손상을 유도하기 위한 단계별 프로토콜 및 동물 모델의 특성화가 충분히 설명된다.

생쥐의 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 전자기 제어 폐쇄 머리 모델

이 연구는 이광자 현미경을 사용하여 뉴런 발현 EGFP의 후속 생체 내 이미징을 위해 마우스에 반복적인 외상성 뇌 손상을 전달하고 두개골 창을 동시에 이식하는 방법을 보여줍니다.

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

Pseudofracture, 무균 musculoskeletal 외상의 재현성 murine 모델은, 늦은 용어 외상후 면역 반응의 평가를 위해 수 있습니다. 이 문서는 여러 외상의 연구를 허용하는 실험 모델 조합의 가능성을 포함하여 단계 모델 단계의 절차 실행을 설명합니다.

Pseudofracture : 급성 주변 조직 외상 모델

학습하세요 마우스 뇌 급성 외상 유도 및 두 광자 현미경 관찰 기법. 이 방법은 생체 내 뇌 세포 반응을 실시간으로 연구하여 외상 후 조건과 잠재적 치료 전략을 탐색하는 데 활용됩니다.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

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