Name: 동적 칼슘의 자동 분석 2 + 신호 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 배우세요 돼지 관상동맥에서 자동화된 관심영역 분석을 이용한 내피 칼슘 활성 측정 방법입니다. 이 기술은 사용자 편향을 줄이고 생리학적 Ca²⁺ 신호 분석의 정확성을 높여 심혈관 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 및 MOP-93676의 일부 지원을 받았습니다.

1. 선박의 해부 및 이미징 <ol><li> 마틴 등 27에 설명 된대로 국내 청소년 돼지에서 수확 조직. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) HEPES는 생리 식염수 (PSS)를 버퍼 포함 아래 해부 접시에 수확 돼지 우심실을 놓습니다. <ol><li> 실체 현미경의 도움으로, 해부 주위 심장 조직의 층에서 혈관 세그먼트를 제거하여 집게와 봄 가위를 사용하여 주변 조직에서 관상 동맥 (~ 8mm 길이 0.5 mm 직경) 좌전 하행의 세그먼트를 제거합니다. 참고 : 혈관 벽에 구멍을하지 않도록주의하십시오. </li><li> 해부 접시에 PDMS 블록 (1 × 0.5 × 0.5 cm)를 배치하고 바닥에 핀 바늘을 사용합니다. 마이크로 핀들을 형성, 열두 ~ 0.3 cm 길이의 세그먼트로 약 40 μm의 직경의 텅스텐 와이어를 잘라 접시에 이것들을 배치합니다. 집게를 사용하여, micropi 가진 블록 용기 세그먼트의 한쪽 끝을 고정N. </li><li> 조심스럽게 혈관 내강에 작은 봄 가위를 삽입하고 완전히 엽니 용기의 한 쪽 아래로 길이 방향으로 잘라. 내피 위로 열린 용기 세그먼트의 방향을. </li><li> 선박이 평평한 사각형을 형성하도록 차단하는 열린 용기 세그먼트의 경계를 확보하기 위해 나머지 마이크로 핀들을 사용합니다. 참고 :, 마이크로 탑은 90 °로 구부려 블록 표면과 같은 높이까지 삽입해야합니다. 케어 overstretching로하지 않고 용기 준비 스트레칭주의해야한다; 최종 폭 ~ 시작 연신 폭을 1.5 배되어야한다. </li><li> 134 염화나트륨, 6의 KCl : HEPES에 플루로 닉 (0.03 %)와 DMSO에 용해 플루오 (Fluo) - 오전 4시 (10 μM)를 혼합하여 플루오 (Fluo) - 오전 4로드 솔루션의 작은 볼륨 (~ 1 ㎖)를 준비 밀리미터에 포함 PSS는 (버퍼 1 MgCl2를, 10 HEPES, 10 포도당), 그리고 어둠 속에서 실온에서 약 40 분 동안 로딩 솔루션으로 전체 블록을 삽입합니다. </li><li> 로드 한 후, 버퍼 HEPES의 블록을 씻어5 ~ 10 분 PSS. </li><li> HEPES가 PSS 버퍼가 포함 된 커버 글라스 바닥 챔버에서 50 ~ 100 μm의 두께 스페이서에 블록을 설치합니다. 참고 : 금속 핀이 스페이서로 사용하고 혈관 세그먼트가 아래로 향하게하고 스페이서를 만지고되지 않도록 할 수 있습니다. </li><li> 공 촛점 이미징 장비 거꾸로 현미경의 무대에 실을 배치하고 내피 세포의 층에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 3 ~ 20 배 배율 분, 공 초점 이미지 시퀀스 aquisition 소프트웨어를 사용하여 초 당 ~ 8 프레임의 프레임 속도를위한 기초 상대 형광 캡처 시간 경과 이미지 시퀀스. </li><li> 기저 형광을​​ 기록 ~ 3 분 후에는 HEPES한다 추가 3 분간 동일 HEPES에서 PSS 버퍼링 용해 물질 P (100 PM)의 부피 (~ 1 ㎖), 및 레코드와 PSS 용액을 버퍼링 대체. </li></ol></li></ol> 2. 자동 분석 <ol><li> 8 비트, G 등의 공 촛점 수집 소프트웨어에서 형광 칼슘 활동의 이미지 시퀀스 (들)을 렌더링없는 규모의 정보 rayscale &#39;. TIF&#39;형식의 파일. </li><li> 오픈 ImageJ에는 파일 메뉴에서 &#39;열기&#39;를 클릭하고, ImageJ에있는 이미지 시퀀스 (들)을 볼 수있는 탐색기 창에서 해당 이미지 시퀀스를 선택합니다. </li><li> 이미지 시퀀스 (들) 내의 활동 공간 확산의 상부 및 하부 경계를 추정하는 직사각형 ROI 도구를 사용하여 적절한 ROI 직경을 결정한다. 주 : 평균 직사각형의 직경은 투자 수익 (ROI)의 직경을하는 경우 적합한 선택입니다. </li><li> 컴퓨터 하드 드라이브에 새 폴더를 만들고 폴더 디렉토리에 이미지 시퀀스 (들)을 추가합니다. </li><li> ImageJ에에서 &#39;플러그인&#39;창을 클릭 한 다음 분석을 시작하는 &#39;LC_Pro&#39;을 클릭합니다. </li><li> 투자 수익 (ROI)의 지름 값을 입력하고 필터 임계 값 (0.05 또는 0.01 중 하나)를 선택합니다. </li><li> &#39;약물 치료&#39;확인란을 클릭하고 바로 전후에 약이 추가 된 시간 (초) 포인트 값을 입력합니다. </li><li> &#39;확인&#39;을 클릭하고파일 탐색기 창에 이미지 시퀀스 디렉토리를 입력합니다. </li></ol> 3. 그래픽 출력 <ol><li> 에서 R 버전 3.0.2을 다운로드 <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> R.의 32 비트 버전을 엽니 다 </li><li> &quot;파일&quot;다음 &#39;스크립트 열기&#39;를 클릭하고 그래픽 실험 보고서를 생성하는 &#39;traceplot.R&#39;R 스크립트를 선택합니다. </li><li> &#39;패키지&#39;를 선택하여 보정하고, gplots 패키지를 설치, &#39;패키지를 설치&#39;, 그리고 appropirate 패키지를 선택. </li><li> &#39;디렉토리 변경&#39;명령 다음, &#39;파일&#39;을 클릭하고 LC_Pro 분석 출력에 해당하는 디렉토리를 선택 탐색기 창을 사용합니다. </li><li> 스크립트 창을 클릭 한 후 &#39;실행하는 모든&#39;스크립트를 실행하는 명령. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
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<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

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세포 및 다세포 수준에서 복잡한 Ca2+ 신호를 해독하려면 엄격한 실험 및 분석 접근 방식이 필요합니다. 여기서, Ca2+ 의존성 형광의 시간 분해 공초점 이미지 서열이 온전한 세포 필드 내에서 통계적으로 관련된 Ca2+ 신호를 식별하고 정량화하는 자동 분석에 노출되는 접근 방식을 설명합니다. 제시된 특정 사례에서, 동맥 세그먼트를 돼지 심장으로부터 분리하고, 내피를 노출시키기 위해 핀으로 열고, Ca2+ 표시기 Fluo-4 AM, 공초점 이미징을 받고 맞춤형 알고리즘 LC_Pro로 평가되었습니다. 이 알고리즘은 1) 통계적(p < 0.01) 노이즈를 초과하는 동적 Ca2+ 변화 부위를 감지 및 추적하고, 2) 활성 사이트 센터에서 관심 영역(ROI)을 자동으로 정의하고, 3) ROI에서 평균 형광 강도를 분석하여 특정 이벤트 매개변수를 결정하도록 설계되었습니다. 이 접근 방식은 사용자 오류와 편향을 줄이고, 오프라인 분석 시간을 ...

칼슘 2 +는 분자 및 세포 내 칼슘 2 + 수준을 높게 조절되는 신호 유비쿼터스 두 번째 메신저입니다. 세포 내 칼슘 2 + 신호가 복잡하고 고립 과도, 진동, 파도 1 전파 포함 - 4. 칼슘 2 +의 공간과 시간 제어 생체 신호 특이성을 기초로 생각, 따라서 칼슘 2 + 신호 패턴의 분석은 여러 필드 5의 조사에 상당한 관심입니다. 예컨대 플루오 (Fluo) -4의 Fura-2와 같은 칼슘 2 + 인디케이터 염료는 일반적으로 형광 현미경 5-12로 내 Ca 2 + 신호를 측정하기 위해 사용된다. 16 - 일반적으로, 시간적 칼슘 2 + 신호는 시간에 따른 사용자 정의 지역 내의 평균 형광의 변화, 또는 관심 영역 (ROI) 5,6,13로 평가됩니다. 현재, 수동 ROI 분석은 시간과 노동력에19 -가 많은 로아를 확인하고 반복적 인 연산 17을 수행하는 사용자가 필요로하기 때문에 긴장의. 이 기술은 인공 신호 모드와 낮은 진폭 또는 확산 신호 (18, 20)의 배제의 도입을 포함, 많은 사용자의 오차가있을 수 있습니다. , 자동 ROI 검출 알고리즘은 이전에 최적의 투자 수익 (ROI)의 위치를 결정하기 위해 통계적 다양한 접근 방법을 사용하여 구현되었지만, 일반적으로 라인 스캔 또는 의사 선 시간이 17에서 하나의 공간 차원으로 분석을 제한 스캔 이미지의 분석에 국한되어 19-22. 또한, 기존의 많은 알고리즘 캘리포니아주기, 지역화 과도에서 전파 파도 (23, 24)에 이르기까지 다양 2 + 릴리스 이벤트의 다양성을 포괄하기에 충분하지 않습니다. 생리 칼슘 2 + 신호의 종합 평가는 종종 더 큰 이미지의 인형도 만들고의 존재에 의해 복잡그 많은 실험 시스템의 잡음 차별 신호를 혼동 역할을합니다. 이전에, 캘리포니아에 자동 ROI 검출 알고리즘 솔루션 2 +는 (건강, 베데스다, MD의 국립 연구소)가 개발하고 (25), (26)을 검증 된 NIH ImageJ에 소프트웨어를위한 플러그인으로 구현, 과도 감지 신호. LC_Pro 불리는이 알고리즘은 두 가지 차원의 시간 경과 이미지 시퀀스에서 칼슘 2 + 과도 신호를 포괄의 ROI를 확인하고 분석 할 수 있도록 설계되었습니다. 여기서 실제 실험 프로토콜 및 돼지 관상 동맥 내피의 알고리즘의 적용이 가능한 대표적인 데모 그래픽 출력을 생성하기 위해 오픈 소스 통계 처리 소프트웨어 R을 후 처리하여 추가로 제공된다.

<table><tbody><tr><td>해부 접시</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>엘라스토머 키트는</td></tr><tr><td>HEPES 완충 PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES 산</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 와이어</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>플루로닉 F-127</td><td>라이프테크</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>금속 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리 바닥 챔버</td><td></td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>설계 회전 디스크 컨포칼 현미경</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">에서 다운로드: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html"용 LC_Pro 플러그인> 다운로드 : http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html< / a></td></tr><tr><td>R 소프트웨어</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">다운로드 위치: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot 스크립트</td><td></td><td></td> <td>< a href = "https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing"> 다운로드 : https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing< / a></td></tr></tbody></table>

동적 칼슘의 자동 분석<sup&gt; 2 +</sup이미지 시퀀스에서&gt; 신호

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

세포 내 칼슘 2 + 신호는 일반적으로 형광 칼슘 2 + 지표 염료 및 현미경 기술을 연구한다. 그러나, 칼슘 2 + 영상 데이터의 정량 분석 시간과 바이어스에 따라 달라질 수 있습니다. 또한 (ROI)의 검출 영역에 기초하여 자동화 된 신호 분석 알고리즘은 일차원 라인 스캔 측정에 대해 구현되어 있지만 이차원 이미지 시퀀스에서 최적화 된 신분증과의 ROI 분석을 통합 전류 알고리즘은 없다. 여기서 이미지 시퀀스에서 수집 및 급속의 ROI 분석을위한 알고리즘을 설명한다. 이 타원이 최적의 투자 수익 (ROI)의 위치를 결정하기 위해 노이즈 필터링 된 신호에 맞게 활용하고, 진폭, 시간 및 공간 확산의 칼슘 2 + 신호 파라미터를 계산한다. 이 알고리즘은 ImageJ에 (NIH) 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수 플러그인으로 구현되었습니다. 함께 오픈 소스 통계 처리 소프트웨어 R 용으로 작성된 분석 스크립트와,이러한 접근법은 실험 출력 퀵 통계 분석을 수행하기위한 고용량 파이프 라인을 제공한다. 저자는이 분석 프로토콜의 사용은 생리적 칼슘 2 + 신호의보다 완전하고 공정한 특성으로 이어질 것입니다 것이 좋습니다.

공초점 이미지 시퀀스에서 Ca2+ 역학의 자동 분석을 수행하기 위해 맞춤형 알고리즘인 LC_Pro가 개발 및 구현되었습니다. 그림 1에 묘사된 바와 같이, 이 알고리즘은 A) 통계적(p &lt; 0.01) 노이즈 이상의 역동적인 Ca2+ 변화 지점을 검출하고 추적하며, B) 활성 지점 중심에 관심 영역(ROI)을 자동으로 정의하고, C) ROI에서의 평균 형광 강도를 계산하여 특정 이벤트 파라미터를 결정하는 순차적 처리 모듈을 활용합니다. 알려진 강도와 위치를 가진 컴퓨터 생성 가우시안 펄스를 사용하여 알고리즘의 그래픽 개요를 보여줍니다(그림 2). 신호 펄스(그림 2A 및 B)는 표준 정규 분포를 위한 z-score를 사용하여 이진법으로 변환되었으며, 신호 임계값 이상의 픽셀 위치에 최적 적합 타원이 할당되었습니다(그림 2C). 최적의 R...

여기에서는 2차원 타임랩스 이미지 시퀀스 내에서 양의 신호 영역에 할당된 최적의 타원 정렬을 기반으로 하는 새로운 관심 영역 분석 프로토콜이 시연됩니다. 이 알고리즘을 통해 연구자는 최소한의 사용자 입력 및 바이어스로 생리학적 Ca2+ 신호를 종합적으로 분석할 수 있습니다.

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

다음 실험의 전반적인 목적은 자동 ROI 분석을 통해 돼지 관상동맥의 내피 세포 칼슘 활성을 분석하는 것입니다. 이를 위해 우선 돼지 관상동맥을 절개하고 개방한 후, 두 번째 단계로 내피 세포의 칼슘 활성을 측정합니다. 획득한 칼슘 측정값에 대해 자동 ROI 분석을 수행하여 칼슘 활성의 요약된 결과물을 도출합니다.다음으로 출력물에 소프트웨어 스크립트를 실행하여 칼슘 활성 분석 결과를 통계적으로 분석하고 그래픽으로 구현하며, 자동화된 ROI 분석 및 통계 처리를 기반으로 칼슘 신호 과도 파라미터를 보여주는 칼슘 활성 분석 결과가 도출됩니다. 수동 ROI 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 자동화된 분석이 더 빠르고 포괄적이며 사용자 오류가 발생할 가능성이 적다는 점입니다. 이 절차에서는 채취한 돼지 우심실을 HEPES 완충 생리식염수가 담긴 A-P-D-M-S 하단 해부 접시에 넣으십시오.실체 현미경 하에서, 주변 심장 조직층으로부터 좌전하행 관상동맥의 일부 세그먼트를 박리하여 제거합니다. 이때 혈관벽을 뚫지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 해부 접시에 PDMS 블록을 놓고 바늘을 사용하여 바닥에 고정합니다.디쉬에 버퍼를 추가하십시오. 그 다음, 직경 약 40 micron의 텅스텐 와이어를 0.3 centimeter 길이의 세그먼트 12개로 절단하여 마이크로 핀을 만들고 이를 디쉬에 넣으십시오. 포셉을 사용하여 혈관 세그먼트의 한쪽 끝을 마이크로 핀으로 블록에 고정하십시오.소형 스프링 가위를 혈관 내강에 조심스럽게 삽입하고, 혈관의 한쪽 면을 따라 세로로 절개하여 완전히 엽니다. 그 다음, 혈관 내피세포가 위를 향하도록 열린 혈관 분절의 방향을 잡습니다. 나머지 마이크로 핀을 사용하여 열린 혈관 분절의 가장자리를 블록에 고정함으로써 혈관이 평평한 직사각형 형태가 되도록 합니다.그런 다음 1 mL의 flu oh 4:00 AM 로딩 용액을 준비합니다. 로딩 후, 블록 전체를 실온의 암조건에서 약 40분 동안 로딩 용액에 담가 둡니다. 그 후, HEPES 완충 PBS로 블록을 5~10분 동안 세척합니다. 이어서, HEPES 완충 PBS가 들어 있는 커버글라스 바닥 챔버 내의 50~100 µm 두께 스페이서 위에 블록을 마운팅합니다.공초점 이미징 장비가 갖춰진 도립 현미경의 스테이지 위에 챔버를 놓고, 공초점 이미지 시퀀스 획득 소프트웨어를 사용하여 내피세포층에 초점을 맞춥니다. 20배 배율과 초당 8프레임의 프레임 속도로 3분 동안 기저 상대 형광의 타임랩스 이미지 시퀀스를 캡처합니다. 3분간 기저 형광을 기록한 후, HEPS 완충 PSS 용액을 HEPS 완충 PSS에 용해된 100 pM substance P와 동일한 부피로 교체하고 추가로 3분 동안 기록합니다. 이 과정에서 공초점 획득 소프트웨어를 통해 형광 칼슘 활성의 이미지 시퀀스를 스케일 정보가 없는 8비트 그레이스케일 TIFF 형식 파일로 렌더링합니다.그 다음 ImageJ를 실행합니다. 파일 메뉴에서 'Open'을 클릭하고 탐색기 창에서 적절한 이미지 시퀀스를 선택합니다. ImageJ에서 이미지 시퀀스를 확인하려면, 사각형 ROI 도구를 사용하여 이미지 시퀀스 내 방사능 활성도의 공간적 퍼짐에 대한 상한선과 하한선을 추정하여 적절한 ROI를 설정합니다. 이어서, 컴퓨터 하드 드라이브에 새 폴더를 생성하고 해당 폴더 디렉토리에 이미지 시퀀스를 추가합니다.Image J에서 플러그인(plugins) 창을 클릭합니다. 그런 다음 lc pro를 클릭합니다. 분석을 시작하려면 ROI 직경 값을 입력하고, 이어서 필터 임계값(filter threshold value)을 선택하십시오.약물 처리 체크박스를 클릭하고 약물을 첨가하기 직전과 직후의 시점 값을 입력하십시오. 그다지 확인을 클릭하고 파일 탐색기 창에 이미지 시퀀스 디렉토리를 입력하십시오. 이 단계에서 R 버전 3.0 0.2를 다운로드하여 설치하십시오.그런 다음 32비트 버전의 R을 실행하십시오. 'file'을 클릭한 후 'open script'를 선택하고, 그래픽 실험 보고서를 생성하기 위한 trace plot RR 스크립트를 선택하십시오. 'packages'를 선택하여 calibrate 및 gpls 패키지를 설치하십시오.패키지를 설치한 후 적절한 패키지를 선택하십시오. 파일(file)을 클릭한 다음 디렉터리 변경(change directory) 명령을 선택하고, 탐색기 창을 사용하여 lc pro 분석 출력에 해당하는 디렉터리를 선택하십시오. 그런 다음 스크립트 창을 클릭하고 모든 실행(run all) 명령을 클릭하여 여기에서 스크립트를 실행하십시오.기초 샘플링 간격에 이어 substance P 자극 샘플링 간격이 포함된 입력 이미지 시퀀스의 타임랩스 이미지가 그레이스케일 타임랩스 이미지 시퀀스로 표시되어 있습니다. 기초 및 자극 간격에 대한 최적의 용해(lysis) 영상은 lc Pro로 렌더링되었으며, 자동으로 설정된 각 ROI로부터 얻은 시간 의존적 스케일 강도 곡선이 여기에 표시되어 있습니다. 대표 실험에서 얻은 대조군 및 substance P 자극 이벤트의 피크 진폭, 반치폭(duration at half max) 및 최대 공간 확산에 대한 히스토그램이 lc Pro의 출력 데이터를 R을 사용하여 그래픽으로 처리하여 렌더링되었습니다.특히 substance P 자극은 이벤트 수를 증가시켰으며, man Whitney U Test 결과 중앙값 진폭과 지속 시간이 유의미하게 오른쪽으로 이동하였습니다. 이 절차를 수행할 때, 초점 평면의 이동이나 잘못된 대비 설정으로 인한 이미지 아티팩트를 최소화하는 것이 중요하며, 이는 분석 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

automated-analysis-of-dynamic-ca2-signals-in-image-sequences

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

심장 근육 세포에서 관형 막 구조가 세포 내 네트워크를 형성한다. 우리는 품질 관리, 최첨단 형광 현미경 II) 살아있는 세포 염색을 포함하여 마우스의 심장에서 심근 세포의 난) 절연을위한 프로토콜을 최적화 대해 설명하고, ⅲ) 직접 이미지 분석은 구성 요소의 복잡성과 세포 멤브레인의 가소성을 정량화하기 네트워크.

심방과 심실에서 심장 근육 세포에 관형 막 네트워크 분석

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

우리는 동적 세포 돌출부의 길이에 따른 상대 단백질 농도의 반자동 추적을위한 소프트웨어 솔루션을 제시합니다.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

선물이 단일 레이블이 없는 단백질의 실시간 광학 탐지에 대 한 프로토콜으로 그들은 살아있는 세포에서 분 비 됩니다. 이 간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 다양 한 다른 생물 학적 시스템 및 구성에 적용 될 수 있는 기반으로 합니다.

레이블 무료 이미징의 단일 단백질 분 비 iSCAT 현미경 검사 법을 통해 살아있는 세포에서

유전자 인코딩된 Ca2 + 지표 (GECIs) 근본적으로 어떻게 현장에서 캘리포니아2 + 이미징 수행 달라졌다. 이러한 녹음에서 데이터 복구를 최대화 하기 위해 캘리포니아2 + 신호의 적절 한 분석이 필요 합니다. 이 종이에 프로토콜 캘리포니아2 + 신호를 원래의 spatiotemporal 매핑 및 입자 기반 분석을 사용 하 여 기록의 정량화를 촉진 한다.

세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

이 프로토콜은 마취마우스에 있는 가까운 혈관에서 백혈구 및 혈류 데이터를 심신하는 두뇌에서 형광 칼슘 심상을 취득하고 분석하는 단계를 제시합니다. 이러한 기술은 벽화 세포 생리학의 연구에 유용하며 모든 세포 유형의 칼슘 과도를 조사하기 위해 적응 할 수 있습니다.

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

TrackMate Analysis of Calcium Imaging(TACI)은 z축의 움직임을 검사하고 각 z-스택의 최대값을 식별하여 해당 시점에서 세포의 강도를 나타내는 3D 칼슘 이미징 분석을 위한 오픈 소스 ImageJ 플러그인입니다. 측면(x/y) 방향으로 겹치지만 다른 z-평면에서 겹치는 뉴런을 분리할 수 있습니다.

TACI: 3D 칼슘 이미징 분석을 위한 ImageJ 플러그인

이 프로토콜에서는 생리학적 내강내 압력에서 폐내 정맥(작은 폐정맥 또는 PV)에서 Ca2+ 신호를 기록하고 분석하기 위한 새로운 기술을 제시합니다. 이 기술에는 작은 PV를 분리하고, Ca2+ 지표로 배양하고, 캐뉼러 및 가압하고, Ca2+ 신호의 컨포칼 이미징 및 데이터 분석이 포함됩니다.

생리학적 내강내 압력에서 작은 폐정맥의 Ca2+ 신호 이미징

이 보고서에서는, 우리는 전극이나 만성적인 실험에 microdialysis 프로브의 설치 기반에 대한 가벼운 치료 치과 수지의 새로운 응용 프로그램을 제안합니다. 이 자료는 두개골에 직접 접착 수 있습니다.

만성 실험에 장착 전극 또는 Microdialysis 프로브를위한 라이트 - 치료 치과 접착제 수지의 응용

배우세요 돼지 관상동맥에서 자동화된 관심영역 분석을 이용한 내피 칼슘 활성 측정 방법입니다. 이 기술은 사용자 편향을 줄이고 생리학적 Ca²⁺ 신호 분석의 정확성을 높여 심혈관 연구에 활용됩니다.

동적 칼슘의 자동 분석

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