Name: qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 포르말린 고정 파라핀 임베디드 위장 생검 조직에서 qPCR을 이용한 거대세포바이러스 DNA 검출 방법을. 이 기술은 기존 염색법으로 판정이 모호한 경우에도 높은 민감도로 바이러스를 검출하여 임상 진단의 정확성을 향상시킵니다.

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우리는 인물의 준비 노력이 원고를 준비하는 그녀의 도움 에이미 Thomasson, 그리고 프레드릭 Skarstedt 라이언 크리스티을 인정합니다.

임상 시험 심사위원회의 승인을 받아, 전자 실험실 데이터베이스의 검색은 위장에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염 사례 조직 병리학 진단 (GI) 생검 (헤 마톡 실린을 나타내는 (FFPE) 블록 및 임베디드 포르말린 고정, 파라핀을 확인하기 위해 수행되었다 에오신 (H &amp; E) 및 / 또는 면역 조직 화학 (IHC)). FFPE GI 생검 조직에서 1. 조직 처리 <ol><li> 사이토 메갈로 바이러스 (CMV)에 대한 FFPE GI 생검 조직 블록을 상환 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에). 이러한 블록을 실온에서 저장된다. </li><li> 블록의 고유 한 식별 번호와 함께 사전 라벨 1.7 밀리리터의 microfuge 튜브. </li><li> 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다. </li><li> 카세트 클램프로 조직 블록 좌석. </li><li> 신선하지 않는 블레이드를 사용하여 마이크로톰에 칼 각도로 블록을 맞 춥니 다. </li><li> 10 μm의 두께 부분을 잘라 마이크로톰을 조정합니다. </li><li> 일의 잠금을 해제전자 핸드 휠 미리 블레이드를 향해 블록. </li><li> 각각의 컷이 조직의 스크롤에 출시 할 수 있도록, 10 μm의 두께 간격으로 블록의 5 부분을 잘라냅니다. 각 스크롤 원하는 생검 조직의 적절한 표현이 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다. </li><li> 포셉으로 만 교차 오염 가능성을 줄이기 위해 파라핀으로 스크롤을 조작주의하면서, 미리 라벨링 원심 분리기 튜브에 조직의 모든 5 스크롤을 배치합니다. 튜브에 뚜껑을 스냅 랙에 다시 배치합니다. </li><li> 마이크로톰에서 조직 블록을 제거합니다. </li><li> 제거하고 잎을 버린다. </li><li> 이전의 조직과 접촉 할 수있는 어떤 표면 또는 장비의 오염을 제거. </li><li> 칼 홀더에 신선한, 사용하지 않는 날을 놓습니다. </li><li> 반복 처리 할 각 추가 블록 1.4-1.14 단계를 반복합니다. 티슈 두루마리 함유의 microfuge 튜브 포까지 실온에서 저장 될 수있다DNA 추출의 전자. </li></ol> FFPE GI 생검 조직의 스크롤 2. DNA 추출 참고 :이 프로토콜이 FFPE 조직의 DNA 추출 키트 (: 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조주의)의 패키지 삽입에서 적응됩니다. <ol><li> 각 샘플의 미세 튜브에 1 ㎖의 크실렌 (MSDS를 참조하십시오주의)를 추가합니다. 적극적으로 10 초 동안 뚜껑과 소용돌이를 닫습니다. </li><li> 구체적으로 다음과 같은 수정과 제조업체의 제품 삽입에 설명 된 DNA 추출을 진행합니다. </li><li> 먼저 각각의 미세 튜브 내부 통제 (IC)의 6 μl를 추가합니다. <ol><li> 1 시간 동안 56 ° C에서 ATL / 단백질 분해 효소 K 용해 배양 한 다음, 1 시간 30 분 동안 99 ° C에서보다는 90 ° C를 품어. </li><li> 최종 DNA 용출 단계 동안, 정중 DNA 정화 컬럼의 뚜껑을 열고 오히려 buffe보다 막의 중앙에 50 μL DNase의 증류 / RNase가없는 물을 적용R은 ATE. 주 : 해당 스토리지 및 시약의 준비를위한 패키지 안내서를 참조하십시오. DNA는 5 FFPE 스크롤에서 추출해야합니다. 실내 온도 (15-25 ℃)에서 모든 원심 분리 단계를 수행합니다. </li></ol></li></ol> CMV 3. qPCR에 <ol><li> 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 프로 시저 <ol><li> CMV 분석 실행을위한 엑셀 PCR 워크 시트를 생성합니다. 이 Excel 워크 시트는 마그네슘과 마스터 믹스를 만들기 위해 필요한 각 시약의 총 금액을 계산합니다. 이 샘플 당 필요한 각 시약의 양을 아래 나열된 배 샘플 및 컨트롤의 수와 곱 하나 (때문에 피펫으로 손실을 보상하기 위해). <ol><li> 양의 각 PCR 반응에 다음과 같은 시약은 표시 다음을 포함한다 : 시약0; 샘플 당 금액 CMV의 LC 마스터 믹스 유리 병 12.5 μL MG 솔루션 노란색 유리 병 2.5 μL 총 양 15.0 μL </li></ol></li><li> 물이나없는 대상 컨트롤 (NTC), 음성 대조군, 낮은 양성 대조군, 높은 긍정적 인 제어, QS3 또는 QS4 하나, 모든 환자의 샘플을, 모든 분석에 포함 실행합니다. 모세 혈관의 순서로 설정해야합니다. </li><li> 4 ℃에서 저장되는 실시간 PCR 기기의 냉각 블록 별을 얻 냉각 블록에 적합한 모세관 튜브를 놓습니다. 모세관 튜브의 표면을 만지지 마십시오. 모세 혈관을 취급 할 때는 항상 장갑을 사용합니다. </li><li> 증폭 생산에 오염되지 않은 깨끗한 후드의 모든 중합 효소 연쇄 반응을 설정TS. <ol><li> 모든 환자 샘플, 플러스 5 컨트롤을 테스트하기 위해 PCR 키트에서 마스터 튜브의 정확한 수를 제거합니다. 하자 마스터 유리 병, 마그네슘 용액 냉각 블록 PCR 등급 물 해동. 각 마스터 유리 병 (12) 시험에 대한 충분한 시약이 포함되어 있습니다. </li><li> 조심스럽게 마스터 유리 병 와동 빠른 최대 속도로 원심 분리기를 회전. </li><li> 하나의 유리 병에 각 마스터 유리 병의 내용을 결합하고 다시 부드럽게 소용돌이. </li><li> 하나의 멸균의 microfuge 튜브에 PCR 워크 시트에 표시된 금액의 마스터 믹스와 마그네슘의 솔루션을 결합합니다. </li><li> 정량 표준 (QS)입니다 위치 5 모세관을 제외하고, 각 모세관 튜브에 부드럽게 나누어지는 마그네슘과 마스터 믹스 15 μl를 섞는다. </li></ol></li><li> 깨끗한 후드에서 처리 후드 Mg를 모세관 및 마스터 믹스를 함유하는 냉각 블록을 이동. </li><li> 마스터의 나머지 30 μL에 내부 통제의 2 μL (IC)를 추가Mg를 섞는다. 위치 5 모세관 (QS에 대한 위치)에 부드럽게 나누어지는 15 μl를 섞는다. </li><li> 물 피펫 10 μL은 해당 모세관 튜브에 DNA, 또는 샘플의 DNA를 제어 할 수 있습니다. 캐핑 도구를 사용하여 모세관 튜브를 모자. </li><li> 실시간 PCR 기기에 블록 / 샘플을 냉각 가라. </li></ol></li><li> 실시간 PCR 장비를 프로그램 (표 1 참조) </li><li> 증폭과 검출은 실시간 PCR 기기에서 수행 <ol><li> 컴퓨터에 로그온 </li><li> 두 악기 아이콘을 클릭하고 소프트웨어에 로그인합니다. </li><li> 실시간 PCR 기기를 켭니다 </li><li> 전면 화면에서 &quot;CMV / EBV&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 매크로 마법사의 지시를 따릅니다. </li><li> 소프트웨어에서 메시지가 표시되면 자체 테스트를 실행하는 상자를 선택합니다. 자체 테스트 기기를 사용하고있는 각각 하루에 한 번 수행해야합니다. </li><li> 실행의 이름을 지정합니다. </li><li> LEF 상부에 위치한 샘플 개수를 조정컨트롤과 환자의 합계 페이지 t 코너는 실행에 포함 된 각각의 환자 샘플의 식별 번호를 입력합니다. </li><li> &quot;애비 양의&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> &quot;샘플 유형&quot;에서 표준에 해당하는 샘플의 유형을 지정합니다. </li><li> 정량 표준 (QS)의 예상 농도를 입력합니다. </li><li> 쿨러 블록에서 모세관 튜브를 제거하고 (블록 샘플 중 1 냉각 등, 회전 목마에 위치 # 1에 배치해야합니다) 회전 목마의 해당 위치에 배치합니다. </li><li> 악기의 원심 분리기를 눌러 시작으로 회전 목마를 놓습니다. </li><li> 원심 분리기를 열고 회전 목마를 제거합니다. </li><li> 실시간 PCR 기기에 회전 목마를 놓습니다. 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 을 눌러 &quot;시작 실행&quot;. </li><li> 실시간 PCR 악기 샘플은 각각의 위치를​​ 확인합니다. 이 검사가 완료 될 때까지 악기에서 멀리 떨어진 곳에서 걷지 않는다 ESPE모세관의 하나가 컨베이어에없는 경우 cially. 악기는이를 기록하고 실행이 계속 될 경우 요청합니다. 떠나기 전에 예라고 응답. </li><li> 실행이 완료되면, 생성 된 보고서를 닫습니다. </li><li> &quot;절대 정량&quot;을 클릭합니다. </li><li> 다음 색상 보정에있는 화살표를 클릭합니다. </li><li> 드롭 다운 상자에서 &quot;색상 선택 보상&quot;을 클릭합니다. </li><li> 실행에 적용 할 최신 색 보정 파일을 선택합니다. </li><li> 상자가 뜨면 확인을 클릭합니다. </li><li> 표준 곡선의 화살표를 클릭합니다. </li><li> 드롭 다운 메뉴에서 &quot;외부 사용&quot;을 선택합니다. </li><li> 가장 최근의 외부 표준 곡선 파일을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. </li><li> 농도가 할당되어있는 경우 곡선이 존재하지 일직선를 보장하기 위해 절대 정량 메뉴의 각 곡선 봐. 705/Back (530)의 절대 정량이 자동으로 분석됩니다. </li></ol></li><li> 숨어품 질 관리 <ol><li> 어느 쪽이든 더 자주하는 쪽을 택 시약의 새로운 로트 번호가 수신 될 때마다 새로운 표준 곡선, 또는 6 개월마다, 생성합니다. </li><li> 마그네슘과 마스터 믹스에 각 표준의 10 μl를 추가합니다. 이전에 추출 된 DNA와 키트에 포함 된 기준을 고려한다. </li><li> 마그네슘은 정확한 정량을 보장하기 위해 표준 곡선을 생성하는 데 사용과 마스터 믹스에 각 표준에 대한 내부 통제의 1 μl를 추가합니다. 아니 템플릿 컨트롤 (NTC)에 대한 밀리그램 마스터 믹스에 IC를 추가하지 마십시오. </li><li> 16 데이터 포인트에 달하는, NTC 및 정량 표준 QS 4, 3, 2, 1, 표준 곡선을 생성하기위한 실행 QS4의 1:10 희석의 세 개의 반복을 준비한다. </li><li> 반복 된 표준에 대한 드롭 다운 메뉴 &quot;의 복제&quot;를 선택합니다 </li><li> 채널 530/back의 없음을 선택하고 실행을 분석 할 때 색 보정을 켜 </li><li> &quot;(런) 표준 곡선&quot;에서 &quot;선택 전으로 저장영원한 &quot;곡선의 이름을 지정합니다. 저장할 때 &quot;표준 곡선으로 적용&quot;주석을 입력합니다. </li><li> 결과를 그래프. 그 결과 선형 계수는 0.81 ≥해야합니다. </li><li> 매일 실행의 경우, 런타임에서 컨트롤로 QS3 또는 QS4의 복사본을 포함한다. 현재 외부 표준 곡선은 분석 단계에서 실행으로 가져올 수있다. </li><li> 실행 관리 : DNA 제어, 음성 대조군, 낮은, 높은 양을 제어합니다. 예상 바이러스 부하가 결정하고 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정된다. </li><li> 각 샘플에 IC를 추가하고 DNA를 추출하는 동안 제어 할 수 있습니다. </li><li> 컨트롤의 범위 밖으로 떨어질 경우, 받아 들일 수없는 결과를 기록하고, 문제 해결에 대한 분석을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 컨트롤의 주파수 <ol><li> NTC, 음, 낮은 양, 양의 높은, 및 표준 제어 : 모든 실행에 포함. </li></ol></li></ol> 참고 : 컨트롤에 대한 허용 한계를. 더 피크가 관찰 될 수 없습니다노 템플릿 (NTC) 및 음성 대조군에 대한 개발. 봉우리는 530 채널에 존재해야하며, 예상 바이러스 부하는 결정 낮고 높은 긍정적 인 컨트롤의 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정됩니다.

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</ol>

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많은 실험 방법은 혈청 학적 검사, 바이러스 배양, 분자 바이러스 혈증의 분석, 조직 검사 재료의 조직 학적, 그리고 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 (FFPE) 조직 검사 최근에 설명 된대로, 분자 분석을 포함하여 거대 세포 바이러스의 진단 (CMV) 감염을 사용할 수 있습니다 조직 5,6. 혈청 검사는 진단의 의지가 한 번 만 안정적으로 노출을 식별하고 급성 CMV 감염 7과 잘 상관하지 않습니다. 기존의 초기 항원 쉘 유리 병 모두 바이러스 성 문화, 후자 8의 경우 가장 2-3일에, 긴 분석 시간에 의해 방해된다. 분자 혈증 분석법은 대부분 모니터링 치료 효능 9-11위한 잠재력 정량적되는 장점을 갖는, 개발되고있다. 위장 (GI) 요로의 지역 참여에 대한 임상 우려가있을 때 불행하게도, 바이러스 혈증의 분석은 조직의 참여를 반영하고 구체적으로 지역화 감염을 식별하지 않습니다. 따라서, Histology은 위장관의 CMV 감염을 식별하기위...

임상 검체에서 거대 세포 바이러스 (CMV) 감염의 해석은 매우 중요하다. CMV는 헤르페스 바이러스의 betaherpesvirinae 아과의 구성원입니다. 다른 헤르페스 바이러스와 유사하게, CMV 활성 바이러스 복제 하나의 부족에 의해 특징 영구 또는 잠복 감염을 확립하는 기능을 갖는다. 바이러스의 재 활성화는 질병의 증상 2-4을 동반 할 수 비리 릴리스 특징 활성 바이러스 복제, 선도, 스트레스 또는 다른 면역 억제의 시간 동안 발생할 수 있습니다. 위장 (GI) CMV 질환의 증상은 자주 복통 및 / 또는 혈변 1이 (가) 있습니다. 조직 학적으로 거대 세포 바이러스 위장염의 진단은 헤 마톡 실린 및 CMV 바이러스 흠을 식별 할 수 에오신 (H &amp; E)를 사용합니다. 임상 혐의가 높은 아직 명백한 흠이 발생하지 않습니다되는 경우, 면역 조직 화학 (IHC)는 자주 외래 시험 방법으로 사용됩니다. 그러나, IHC또한 해석이 어려운 (그림 2) 5 만들고, 드문 비 고전 나타나는 세포의 염색 패턴 (모호한)에 의해 방해 할 수 있습니다. 이는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) GI 생검 조직과 GI 생검에서 CMV를 검출하는 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)로부터 추출 된 DNA를 사용하고자 하였다. 이 기술은 GI 생검에서 거대 세포 바이러스의 검출에 유용한 것으로 표시하고, 모호한 IHC 염색의 경우 5,6에 특히 도움이되었습니다. 또한, qPCR에 또한 6 사용할 수있는 경우 추가 임상 CMV 테스트 데이터와 상관 관계가 표시되었습니다. CMV를 감지하는 qPCR에의 사용은 CMV에 대한 임상 혐의가 높은 경우 초기 진단과 치료로 이어질 수 있지만, H &amp; E 및 CMV IHC는 부정적이다.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml 마이크로퓨지 튜브</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>톱니 겸</td>자 <td>전자 현미경 서비스</td><td>62086-1S</td><td>마이크로 펜치 MF-1</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기(마이크로퓨지)</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: X3P</td><td>1</td></tr>갤런 <tr><td>에탄올</td><td>Fisher Fisher</td><td>Scientific: ET108</td><td>96-100% </td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>CMV LC PCR 보충 키트</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 원심분리기</td><td>Roche</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 냉각 블록</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10800058001</tr><tr><td>LightCycler 캡핑 도구</td><td>Roche</td><td>3357317</td><td></td></tr>색 <tr><td>보정 키트</td><td>Roche</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu; l 모세 혈관</td><td>Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>블레이드</td><td>Sakura</td><td>Fisher Scientific : 4689</td><td>Accu-Edge 로우 프로파일</td></tr></tbody></table>

qpcr에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 cytomegaloviral dna의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

그것은 심각한 감염을 개발하기 위해 자신의 더 큰 위험 관련, 위장 (GI) 면역 억제 환자의 기관에 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염을 식별하는 데 매우 중요합니다. CMV 감염의 검출을위한 다수의 실험 방법 혈청학, 바이러스 배양, 분자 및 방법을 포함하여 개발되었다. 종종, 이러한 방법은 CMV와 조직의 참여를 반영하고 특히 지역 조직의 참여를 식별하지 않습니다. 따라서 위장관에서 CMV 감염의 검출은 자주 생검 조직의 조직 학적 전통에 의해 이루어집니다. 면역 조직 화학 (IHC)과 함께 헤 마톡 실린과 에오신 (H &amp; E) 염색이 생검 검사의 대들보가 남아있다. H &amp; E와 IHC 때로는 해석이 어려워, 비정형 (모호한) 염색 패턴을 초래한다. 그것은 CMV 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)이 성공적으로 매우 포르말린 - 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 조직에서 수행 될 수 있다는 것을 나타내었다민감도와 특이도가 높은. 이 프로토콜의 목적은 임상 실험실 설정에 FFPE 생검 조직에서 CMV의 검출을위한 qPCR에 테스트를 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 GI 조직 검사에서 CMV에 대한 모호한 염색의 경우 환자에 대한 큰 도움이 될 전망이다.

228 조직 블록의 총 모호 CMV IHC와 조직학 및 긍정적 인 면역 조직 화학 (IHC), 18 일을 기준으로 91 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 긍정적 인 사례로 구성되었다 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에), 79 음의 컨트롤에 의해 테스트되었습니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, CMV 양성 케이스 전형적인 CMV 바이러스 개재물 (A) 및 / 또는 양성 IHC 염색 (B)을 보여준 것이다. 음성 대조군이 더 의심스러운 조직 학적 또는 IHC 염색 5 표시되지 것입니다 반면 모호한 경우는 드문, 비 고전 나타나는 염색 패턴 (C)을 증명하고있다. 조직 병리학 CMV에 대한 긍정적 인 91 생검, 88 qPCR에 (표 2)에서 양성이었다. 기존의 조직학 기반으로 진정한 긍정적 인 정의와, ...

이 프로토콜은 포르말린이 고정된 파라핀 내장 생검 조직에서 거대세포바이러스의 qPCR 검출을 설명하며, 이는 빠르고 민감하며 특이적이며 모호한 헤마톡실린 및 에오신 또는 면역조직화학적 염색 패턴을 해석하는 데 유용합니다.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

다음 절차의 전반적인 목적은 위장관 생검 조직, 특히 기존의 염색법으로 결과가 모호하게 나타난 생검 조직에서 거대세포바이러스(cytomegalovirus) DNA 검출의 민감도를 높이는 것입니다. 이는 먼저 포르말린 고정 파라핀 임베딩된 위장관 생검 조직을 절단하여 스크롤 형태로 수집함으로써 달성됩니다. 그 다음, 증폭을 위해 해당 조직 스크롤에서 DNA를 추출합니다.사용된 특이적 프라이머는 거대세포바이러스(cytomegalovirus) DNA를 선택적으로 증폭합니다. 위장관 생검 조직에 일반적인 방법을 적용했을 때 결과가 불분명한 경우, 이 민감한 방법으로 거대세포바이러스 DNA를 검출할 수 있습니다. 헤마토실린, 은 염색 및 면역조직화학 염색과 같은 해당 분야의 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점는 슬라이드 상에서 비정형적인 염색 패턴을 해석할 필요가 없다는 점입니다. 위장관 생검 조직의 절편 제작 시연은 실험실의 조직 기술자인 Zainab van Horn이 담당하며, 실험실에서의 핵산 추출 및 RT-PCR 준비 과정 또한 시연될 예정입니다.Rebecca Jocelyn. 본 프로토콜을 위해, 쇄빙 위에 놓인 FFPE GI 생검 조직 블록을 준비하십시오. 먼저 마이크로톰에서 각 조직 블록의 식별 번호를 기입하여 샘플 블록당 하나의 마이크로 원심분리관에 라벨을 부착하십시오.핸드휠이 잠겼는지 확인하고 조직 블록을 카세트 클램프에 고정하십시오. 검체 간의 교차 오염을 방지하기 위해 새 칼날을 사용하고 있는지 확인하십시오. 첫 번째 검체에는 반드시 사용하지 않은 새 칼날을 사용하는 것이 중요합니다.검체 사이에 다른 칼날로 교체하고, 검체 사이에 마이크로톰을 오염 제거하십시오. 다음으로, 블록을 칼날 각도에 맞게 정렬하고 절편 두께를 10 microns로 조정합니다. 이제 핸드 휠의 잠금을 해제하고 블록을 칼날 쪽으로 전진시키십시오.블록을 10 micron 간격으로 다섯 번 절단하여 각 절편이 조직 스크롤 형태로 말리게 합니다. 각 스크롤에 원하는 생검 조직이 충분히 포함되어 있는지 확인하십시오. 다섯 개의 스크롤 절단이 완료되면 핸드 휠을 고정합니다.다섯 개의 스크롤을 표시된 원심분리 튜브로 옮길 때, 포셉이 조직이 아닌 파라핀에만 닿도록 신속하게 처리하십시오. 튜브 캡을 닫은 후, 카세트 클램프에서 블록을 제거하여 다음 샘플의 스크롤을 수집하십시오. 먼저, 블레이드를 제거하여 폐기하십시오.새로운 미사용 블레이드를 장착하기 전에, 이전 시료와 접촉했을 가능성이 있는 모든 표면을 오염 제거하십시오. 시료는 추가 공정을 진행하기 전까지 실온에서 보관할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 FFPE 조직 DNA 추출 키트를 바탕으로 수정되었습니다.진행하기 전에 반드시 물질안전보건자료(MSDS)를 확인하십시오. 먼저 각 시료 튜브에 xylene 1 mL를 넣고 10초 동안 격렬하게 볼텍싱합니다. 그다음, 제조사의 지침을 따르되 다음과 같이 수정하여 진행하십시오.먼저, 각 튜브에 내부 대조군 6 µL를 넣습니다. 둘째, 56 °C에서 1시간 동안 진행한 A TL proteinase K 용해 배양 단계 이후에, 샘플을 90 °C에서 1시간 동안 배양하는 대신 99 °C에서 30분 동안 배양합니다.셋째, 용출 단계를 수행할 때 TE 버퍼 대신 DNase 및 RNase 제거 증류수 50 µL를 용출 컬럼 멤브레인의 중앙에 조심스럽게 분주합니다. 마지막으로, 모든 원심분리 단계는 상온에서 수행해야 합니다. 키트의 증폭 산물 오염물이 없는 깨끗한 후드 내에서 반응을 준비하십시오.샘플과 5개의 대조군에 사용할 충분한 양의 마스터 바이알과 마그네슘 용액을 꺼냅니다. 각 마스터 바이알에는 12회 테스트 분량의 시약이 들어 있습니다. 해동 후, 마스터 바이알을 볼텍싱하고 최대 속도로 짧게 원심 분리하여 액체를 가라앉힙니다.다음으로, PCR 워크시트에 따라 마그네슘 용액과 마스터 믹스를 혼합합니다. 냉각 블록에 놓인 상태에서 피펫팅을 통해 용액을 부드럽게 섞어줍니다. 5번 위치를 제외하고, 냉각 블록 내의 테스트 모세관에 혼합액 15 µL를 첨가합니다.이 모세관은 정량 표준물질용으로 따로 둡니다. 모세관과 마그네슘이 포함된 마스터 믹스가 들어 있는 냉각 블록을 클린 후드에서 별도의 처리용 후드로 옮깁니다. 여기서 남은 30 µL의 마스터 믹스에 내부 대조군 2 µL를 첨가합니다.피펫팅으로 용액을 혼합한 후, 이 혼합물 15 µL를 5번 위치의 모세관에 넣습니다. 그런 다음, 적절한 위치에 대조군 DNA 또는 샘플 DNA 10 µL의 물을 추가합니다. 로딩이 완료되면 모세관 원심분리기에서 캡핑 툴을 사용하여 모세관을 닫습니다.모세관을 냉각 블록에서 회전 랙의 해당 위치로 옮깁니다. 그런 다음 회전 랙을 원심분리기에 넣고 원심분리 사이클을 실행합니다. 분석 단계에서 회전 랙을 실시간 PCR 기기로 옮겨 반응을 진행합니다.절대 정량을 사용하여 데이터를 확인하여 정량 분석을 위한 곡선을 사용할 수 있는지 확인합니다. 총 228개의 조직 블록을 QPCR로 테스트하였습니다. 조직학 및 양성 면역조직화학 검사를 바탕으로 91개의 블록이 CMV 양성 사례로 확인되었습니다.18개의 블록에서 C-M-V-I-H-C 결과가 불분명하게 나타났습니다. 나머지 79개는 음성 대조군이었습니다. CMV 양성 사례가 입증되었습니다.전형적인 CMV 바이러스 봉입체와 양성 IHC 염색, 또는 이 두 가지 중 적어도 하나가 관찰되었습니다. 모호한 사례에서는 드문 비전형적 염색 패턴이 나타난 반면, 음성 대조군에서는 CMV 양성 반응을 보인 88개의 조직 중 91개 조직에서 의심스러운 조직학적 소견이나 IHC 염색이 나타나지 않았습니다. 71개의 음성 대조군 중 1개는 QPCR 검사에서 CMV 양성으로 판정되었습니다.A. 모호한 C-M-V-I-H-C 염색 결과의 생검 조직에 대한 논의는 텍스트 프로토콜에 제공되어 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE)된 위장관(GI) 생검 조직에서 DNA를 추출하고, 이어서 실시간 PCR을 통해 거대세포바이러스(cytomegalovirus) DNA를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

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연구

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생물학

우리는 사전 microRNA의 설정 및 분석 서비스를 선보일 예정 써모 과학 매트릭스 멀티채널 피펫과 수작업으로뿐만 아니라 로봇을 사용하여 QPCR위한 96 잘 배열.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

이 비디오에서는 MCPyV 비리온에 감염된 세포를 현장 혼성화 연쇄 반응을 통해 MCPyV 특이적 게놈을 검출했습니다. 또한 DNA-HCR 기술을 FISH와 결합하여 감염된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 시각화했습니다.

HCR-DNA FISH: 감염된 세포에서 바이러스 DNA를 검출하기 위한 형광 현장 혼성화 기술

Provided는 열 순환기 또는 현미경 및 스테이지 히터를 사용하여 DNA 샘플의 초기 농도를 정량화하기 위한 실시간 재조합효소 중합효소 증폭 분석을 개발하기 위한 프로토콜입니다. 또한 내부 양성 대조군의 개발도 설명되어 있습니다. 원시 실시간 형광 데이터를 처리하기 위한 스크립트가 제공됩니다.

내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

Synthetic Yeast Genome 프로젝트인 Sc2.0의 디자이너 염색체는 존재/부재 종말점이 있는 PCRTagging이라는 PCR 기반 유전형 분석 분석을 사용하여 네이티브 염색체와 구별할 수 있습니다. 여기에서는 PCRTag 유전형 분석을 위한 고처리량 Real-Time PCR 검출 방법에 대해 설명합니다.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

이 비디오의 목적은 임상에서 드문 돌연변이를 검출하는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인과 디지털 방울 PCR (ddPCR) 분석 자동화 된 DNA 추출을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. FFPE 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것은 FFPE 샘플에서 ddPCR의 임상 적 유용성을 보여줍니다.

디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

원고는 칩 기반 디지털 PCR 분석 결과를 신선한 냉동 정상에 드문 CDH1 사본 이체 (CDH1a) 및 위 암 환자에서 얻은 종양 조직 검출을 설명 합니다.

칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

반전 녹음 방송 (실시간 정량)와 함께 하는 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 분석은 RNA 바이러스 감염의 수준을 측정 하 널리 사용 되었습니다. 여기는 직접 실시간 정량 분석 결과, 뎅기열 바이러스를 포함 하 여 여러 RNA 바이러스의 정량화에 대 한 개발 하는 RNA 정화 단계를 필요 하지 않는 선물이.

실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 뎅 그 열 바이러스 RNA를 측정

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

후성 유전학 마커는 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 백혈구 (WBC) 과형을 위해 사용됩니다. 이 프로토콜은 WBC 차동 수의 정밀하고 멀티플렉스 메틸화 특이적 표적 정량화를 허용하는 방울 생성을 위한 열가소성 탄성동체(TPE) 기반 미세 유체 장치를 사용하여 멀티플렉스 액적 폴리머(mdPCR) 방법을 제시한다.

혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR

근육 손상을 기본 메커니즘의 확인이 중요합니다. 여기 파라핀 - 임베디드 및 Drosophila 흉부 근육의 부분을 냉동을 준비 histological 기술을 제시한다. 이것은 근육 형태학 및 단백질 및 기타 근육 세포 구성 요소의 로컬 리 제이션의 분석이 가능합니다.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

배우세요 포르말린 고정 파라핀 임베디드 위장 생검 조직에서 qPCR을 이용한 거대세포바이러스 DNA 검출 방법을. 이 기술은 기존 염색법으로 판정이 모호한 경우에도 높은 민감도로 바이러스를 검출하여 임상 진단의 정확성을 향상시킵니다.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

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