Name: 배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 배우세요 배양된 포유동물 세포에서 siRNA 스크리닝을 통해 유비퀴틴 및 유비퀴틴 유사 시스템의 새로운 조절인자를 확인하는 방법. 이 기술은 HIF1A 매개 저산소 반응 연구에 효율적입니다.

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이 작품은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust), 글락소 스미스 클라인 (GSK)과 세포 신호 전달을위한 스코틀랜드 연구소 (MRC 단백질 인산화 및 Ubiquitylation 단위의 지금 부분)에 의해 지원되었다.

1. 분석 개발 단계 참고 : 이전에 siRNA의 화면을 시작으로, 분석 개발 단계는 기자 셀 라인과 심사에 중요한 매개 변수를 설정하는 것이 중요합니다. 이것이 화면의 미래의 성공을 뒷받침하므로이 단계에서 상당한 노력을 투자하는 것이 필수적입니다. <ol><li> U20S-HRE 기자 세포주의 저산소증 응답의 특성을, 10 % FBS와 보충 이글 중간 (DMEM) 수정 Dulbeccos 80-90 % 년 합류에 2 × 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 성장. </li><li> 기음 셀 중 하나 술병에서 미디어는 10 ㎖의 PBS로 두 번 씻어 2 ML 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 배양하여 세포를 분리. 8 ML의 DMEM 균일 한 세포 현탁액을 만들 수 상하 10 % FBS와 피펫을 Resuspend 세포. </li><li> 피펫 (20) 중복의 셀 카운팅 챔버 정지 μL, 그리고 자동화 된 셀 커플에 실을 삽입NTER. 셀 카운터 소프트웨어의 &quot;디스플레이 이미지&quot;를 클릭하고 세포의 초점이되어 있는지 확인합니다. &quot;횟수&quot;를 클릭하고 셀 밀도를 기록해 둡니다. 다른 중복에 대해이 단계를 반복하고 평균 셀 밀도를 계산합니다. 60000 세포 / ml의 농도로 DMEM 10 % FBS를 가진 세포를 희석. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 같은 세 개의 열 (예 : A5-H5, A6-H6과 A7-H7) 5 멸균 흰색 벽으로 둘러싸인 96 - 웰 분석 플레이트 및 전송로에 희석 된 세포 100 μL (6000 셀)를 추가 밤새 5 % CO 2에서 가습 37 ° C의 배양기. 참고 : 1 시간, 2 시간, 6 시간, 10 시간 및 24 시간 :이 판은 저산소 노출의 범위에 대한 저산소증 의존 루시 페라 제의 출력을 결정하는 데 사용됩니다. </li><li> 다음 하루의 끝에서, 시간을 기록하고 1 %의 산소에 저산소증 워크 스테이션 세트에 24 시간 저산소증 판을 추가합니다. 24 시간 플레이트 FR을 제거 할 예정이다하기 전에 다음과 같은 아침 시간 10 시간, 6 시간, 2 시간을 계산저산소증 워크 스테이션 옴. 이 시간에, 저산소증의 워크 스테이션에 10 시간, 6 시간, 2 시간 플레이트를 추가합니다. </li><li> 16 mM의 MgCl2를, 2 mM의 DTT, 2 % 트리톤 - X-100, 30 % 글리세롤, 1 mM의 ATP, 1 % BSA, 0.25 mM의 2 배 결합 루시퍼 용해 / 분석 완충액 30 ㎖ (50 mM 트리스 인산염 pH가 7.8을 준비 루시페린 8 μM 나 4 P 2 O 7). 참고 : 나열된 순서대로 구성 요소를 추가하고 BSA 적어도 30 분은 루시페린과 나 4 P 2 O 7의 추가 전에 해산 할 수 있습니다. </li><li> 적절한 시간에 저산소증 워크 스테이션에서 모든 플레이트를 제거합니다. 분석 플레이트의 적절한 우물에 배 루시퍼 용해 / 분석 완충액 100 μl를 추가하고 투명 필름 커버. 철저하게 세포를 용해하기 위해 500 rpm에서 10 분 동안 접시 통에 접시를 흔들어. </li><li> 자동화 된 96 웰 플레이트 루미 랙에 플레이트 스택을 전송합니다. &quot;프로토콜&quot;메뉴에서 &quot;복근 595&quot;을 선택하고 모든 아를 강조LS는 &quot;잘 선택&quot;메뉴에서 화면 플레이트지도에서 읽을 수 있습니다. 그럼 각 판의 평균값을 계산 각각의 발광을 측정하기 위해 &quot;실행&quot;을 클릭합니다. 정상 산소 상태 (0 시간 저산소증) 제어 판의 평균값에 의해 각 저산소증 판의 평균 독서를 분할하여 기자 활동의 저산소증 의존 접이식 증가를 계산합니다. 참고 :이 검사에 적합하도록 강력한 저산소증 의존 루시 페라 제의 반응을 관찰하는 것이 필수적입니다. 기자 활동의 5-10 배의 증가가 우수한 것으로 간주됩니다. </li><li> 4 단 제어 (HIF1A의 siRNA)은 복제 (웰스 A1-D1), (FIH1의 siRNA) (웰스 A12-D12) 복제 개의 낮은 컨트롤이 포함 된 마스터 제어 판을 만들어, 네 개의 버퍼는 반복 실험 (우물 E1-H1)를 제어 네 모든 siRNA를 풀이 200 ㎚의 농도에서 아르 비 표적 siRNA를 제어 복제물 (E12-H12). 참고 : 높고 낮은 컨트롤이 증가하고 DECR 알려진 경로의 규제에 따라 설립각각 저산소증 반응을 완화. 대안 적으로, 라이브러리의 서브 세트를 사용하여 분석 개발은 적절한 컨트롤을 식별하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 멸균 흰색 벽으로 둘러싸인 분석 플레이트에 각 컨트롤의 siRNA의 10 μl를 전송합니다. 10 μL의 0.1 μL의 형질 전환 시약의 형질 믹스를 준비 감소 혈청 배지 (1:100)도 각 컨트롤에 잘 및 전송 형질 믹스 10 μL 당. 최대 피펫 믹스 다운 간략하게하고, 형질 복합체 형성을 할 수 있도록 20 ~ 60 분 동안 휴식을 판을 둡니다. </li><li> U20S-HRE 셀들의 제 플라스크로 75000 세포 / ml의 세포 현탁액을 준비한다. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 각각의 형질 전환 혼합물에 세포 현탁액 80 μL (6000 세포)를 추가한다. 24 시간 동안 5 % CO 2 가습 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송 한 후 추가로 24 시간 동안 저산소 워크 스테이션에 전송하고 단계에 설명 된대로 루시 페라 제 분석을 수행 1.61.8. </li><li> [3 × (높은 컨트롤 + 저 제어의 표준 편차) / (높은 제어의 의미 - - 낮은 컨트롤의 평균을)] = 1 식 Z를 사용하여 높고 낮은 컨트롤에 대한 Z-계수를 계산한다. 주 : 0.5 ~ 1 사이의 값은 훌륭한 분석을 나타내며위한 노력을해야한다. </li></ol> 2. 기본 화면 주 : 분석 개발 단계에서 이러한 기본 조건이 준비되면, 주 화면은 다음 프로토콜을 이용하여 96 웰 플레이트 포맷 중으로 수행 될 수있다. <ol><li> DMEM 80-90 % 년 합류로 7 × 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 성장 10 %의 V 보충 / V 소 태아 혈청 (FCS). 참고 : 다음은 2.2-2.13은 1 일에 실시해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> 단계 1.9 및 해동 중의 siRNA ubiquitome 리터의 희석 시리즈에 설명 된대로 각 컨트롤의 200 μl를 포함하는 마스터 제어 판을 준비하여 복제 1 시작30 분의 최소 ibrary. 참고 : 각이 잘 컨트롤 비어 열 1 12 17 X 96 - 웰 플레이트에 조립 4 siRNA가 풀을 포함하고 있습니다. </li><li> 층류 후드에서, 라벨 (또는 바코드) 숫자 1-17에서 뚜껑 17 멸균 흰색 벽으로 둘러싸인 분석 플레이트를,의 siRNA 라이브러리 시리즈의 각 판에 해당. </li><li> 마스터 컨트롤 플레이트를 원심 분리기와 siRNA의 모든 siRNA가이 우물의 바닥에 축적하기 위해 라이브러리를 짧게 (2,000 XG에 1 분) ubiquitome. </li><li> 각 플레이트에 대해 동일한 96 웰 팁 스택을 사용하여 17 분석 플레이트에 자동화 된 액체 디스펜서 로봇을 &quot;스탬프&quot;마스터 제어 판에서 각 컨트롤의 10 μl를 사용합니다. </li><li> 17 라이브러리 판의 각각의 신선한 96 웰 팁 스택, 전송 각 10 μl를 사용하여 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 해당 분석 플레이트에의 siRNA를 ubiquitome. </li><li> 비 ES를 사용하여 분석 플레이트 (17)에 대해 40 ㎖ 형질 감염 시약을 준비1.10에 수립 된. 참고 :이 셀 디스펜서에서 &quot;죽은 양&quot;을 설명하기 위해 추가 20 ㎖를 포함한다. &quot;죽은 볼륨은&quot;셀 디스펜서 튜브 네트워크 내에서 지속적으로 존재하는 액체의 양을 의미한다. </li><li> 17 분석 플레이트의 각 웰에 형질 전환 시약의 10 μl를 전송하는 자동화 된 세포의 디스펜서를 사용합니다. 형질 전환 시약 복합체 형성 : 간단히 다음 siRNA를 할 수 있도록 20 ~ 60 분 동안 실온에서 여전히 남겨, siRNA의 형질 전환 및 시약을 완전히 혼합 할 수 있도록 진탕 (500 rpm에서 1 분)에 대한 분석 플레이트를 흔들. </li><li> 10 ㎖ PBS로 두 번 두 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 세척하고 5 분 동안 37 ° C에서 2 ML 트립신-EDTA로 분리합니다. 균질 한 세포 현탁액을 만들 위아래로 각각의 플라스크에 피펫으로 8 ML의 DMEM을 여러 번 10 % FBS를 추가합니다. 두 플라스크에서 세포를 결합하고 멸균 50 ML 플라스틱 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 피펫으로 세포 농도를 계산20 μL의 셀 카운팅 챔버 중복 된 셀 및 단계 130에 설명 된대로 자동 세포 계수기의 두 판독에서 보통 세포 농도를 산출한다. </li><li> 멸균 플라스틱 용기에 밀리리터 당 75,000 세포의 농도로 DMEM 10 % FBS로 희석하여 세포 현탁액 155 ㎖를 준비. 참고 :이 볼륨은 17 플레이트에 충분하며, 세포 디스펜서 죽은 볼륨에 대한 추가 25 ML을 포함한다. </li><li> 세포의 응집을 제한하는 층류 후드 내부 설정 교반기에 세포 현탁액과 장소에 멸균 자석 교반기를 추가합니다. 세포 현탁액과 자동화 된 세포 디스펜서 평형 잘 당 세포의 80 μL (6000 셀)를 분배하기 위해 설정합니다. </li><li> 자동화 된 세포 디스펜서에, 차례 차례로, 17 판을 각각 배치하고 세포를 분배. 5 그룹의 시간과 스택 플레이트를 기록 한 후 24 시간 동안 5 % CO 2에서 습기가 37 ° C 배양기에서 스택을 배치합니다. 참고 : 최종 농도를siRNA를 풀은 100 ㎕의 총 부피의 20 nm의 것입니다. 참고 : 다음은 2.14-2.15는 2 일에 실시해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> 복제 1 (2.2-2.13)에 대해 1 일에 설명 된 절차에 따라, 2 일에 두 번째 복제를 시작합니다. </li><li> 형질 전환 24 시간 후, 저산소증 워크 스테이션에 무균 환경에서 복제 1에서 전송 플레이트는 1 % 산소로 설정하고 HRE 기자를 유도하기 위해 24 시간 동안 둡니다. 참고 : 다음은 2.16-2.20는 3 일에 실시해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> 복제 1 (2.2-2.13)에 대해 1 일에 설명 된 절차에 따라, 세 번째 복제를 시작합니다. </li><li> 형질 전환 24 시간 후, 저산소증 워크 스테이션에 무균 환경에서 복제 2에서 전송 플레이트는 1 % 산소로 설정하고 HRE 기자를 유도하기 위해 24 시간 동안 둡니다. </li><li> 2 시간 전에, 1 판이 저산소증 워크 스테이션에서 제거하여야한다 복제 1.6에 설명 2X 루시페라아제 용해 / 분석 완충액 200 ㎖를 준비한다. 참고 :이 볼륨에버퍼 저장이 잘 덮여 유지하기 위해 추가로 20 ㎖를 cludes. </li><li> , 24 시간 저산소증 노출과 자동화 된 액체 디스펜서를 사용한 후 저산소증 워크 스테이션에서 1 분석 플레이트를 복제 각 분석 플레이트에 2 배 루시퍼 용해 / 분석 완충액 100 μl를 추가하고 투명 필름 커버 제거합니다. </li><li> 철저 용균 500 rpm으로 10 분 동안 세포 쉐이커에 플레이트를 흔들어. 단계 1.8에 설명 된대로 루미 플레이트 리더 기록 발광에 차례로 각각의 판을 전송합니다. 참고 : 다음은 2.21-2.22는 4 일에 실시해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> 형질 전환 24 시간 후, 저산소증 워크 스테이션에 무균 환경에서 복제 3 전송 플레이트는 1 % 산소로 설정하고 HRE 기자를 유도하기 위해 24 시간 동안 둡니다. </li><li> 복제 1에 사용되는 다음 단계 2.18-2.20하여 복제 2 판을 읽어보십시오. 주 : 다음 단계 2.23는 5 일에 실시한다. </li><li> 다음으로 복제 3 판을 읽고복제 1에 사용 2.18-2.20 단계. </li><li> 기본 화면의 모든 3 개의 반복을 컴파일하고 1.12의 식을 사용하여 각 판의 Z 계수를 계산합니다. 주 : 모든 플레이트는 0.5 미만의 Z 팩터를 가지고있는 경우, 데이터의 품질을 향상시키기 위해이 플레이트를 반복 참고. </li><li> 다음과 같은 수식을 사용하여 높고 낮은 컨트롤에 대한 분산 (CV)의 계수를 계산 컨트롤의 컨트롤 / 평균 100 × 표준 편차. 주 : CV 가능한 한 낮아야, 그것은 15 % 변화를 예상하는 것이 합리적이다. 편차가 상당히 높은 경우에, 플레이트를 반복 참고. </li><li> . × 100 또한, 비 표적을 계산 (NT [- - / (높은 제어의 의미 낮은 컨트롤의 평균) (siRNA의 점수 높은 제어의 의미)] : 다음과 같은 수식을 사용하여 판마다 각각의 siRNA %의 활성화를 계산 식 [NT의 샘플 데이터 / 평균]을 사용하여 각각의 siRNA) 배. %의 활성화 및 NT-방면 모두에 대해, 세 replic의 평균을 계산ATES와 값을 컴파일합니다. </li><li> 원시 데이터를 사용하여, 세 개의 복제에 플레이트 식을 이용하여 상관 관계를 결정하는 방법에 밀접 스피어의 순위 상관 계수 (SRCC)를 계산한다 : <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51572/51572eq1.jpg" width="120" /> 여기서, R = SRCC; D = 각 계급 쌍의 데이터 쌍의 N = 수의 두 숫자의 차이. 참고 :. 하나의 복제가 다른 2 판에 대해 낮은 SRCC가 표시되면 판은 복제 사이의 상관 관계는 1 가까운 값을 줄 것이다, 더 조사하고 그 판을 반복하는 것이 좋습니다. </li><li> (80까지) 2 차 심사에 충분한 관심이되는 siRNA를 결정합니다. (예를 들어, 5 % 미만의 이상 95 % %의 활성화, 이하 0.5 NT 배 또는 1.5 이상 NT 배를 보여주는 모든 siRNA를 선택) 사용자 정의 컷 오프를 사용하거나 클러스터를 검색하는 생물 정보학 또는 지식 기반 추론을 적용 같은 UBL 경로에서 떨어지는 안타. 참고 :일반적으로, 이러한 접근 방식의 조합의 siRNA가 차 심사에 촬영을 결정합니다. </li></ol> 3. 보조 화면 참고 : 확실한 보조 화면이 기본 화면에서 관심의 80 siRNA를 최대 기준으로 수행합니다. 이 숫자는 편리하게 기본 화면에 따라 전체 컨트롤과 하나의 96 웰 플레이트에 도금 각 복제 (2.2 참조)로 수행 할 수 있습니다. 그것은 기본 화면에서 식별 된 규제 재현성 같은 표현형을 유도하고,이 최종 차 / 디컨 볼 루션 화면을 통해 수행되어야한다 명중되는 환자 분류 결정을 정제에 도움이되는지 확인하는 것이 매우 유용하다. <ol><li> 10 % FBS와 DMEM 80-90 % 년 합류에 1 개의 x 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 성장. </li><li> 판 번호와 기본 화면 히트 위치를 확인하고, 열 1을 떠나, 보조 스크린 체리 마스터 플레이트를 포착에 새 위치를 계획D 컨트롤에 대한 무료 12. 1.9에서와 같이하지만, 50 μL의 각 컨트롤의 전체 볼륨 제어 마스터 판을 준비합니다. </li><li> 최소 30 분의 ubiquitome 라이브러리의 두 번째 희석 시리즈 (체리 따기 개인의 siRNA 풀에 따로) 해동. 판 짧게 (2,000 XG에 1 분)을 원심 분리 한 후 체리에 새로운 판 위치에 보조 화면 siRNA를 50 μl를 추가 마스터 플레이트를 들었다. </li><li> 다음 수정을 기본 화면에 대한 설명 동일한 기본 프로토콜을 사용하여 보조 화면을 수행한다 : (a) 복제 당 하나의 분석 플레이트에서 같은 날에 세 개의 반복을 실행하고 (b)에 따라 시약의 볼륨을 조정합니다. </li></ol> 4. 차 / 디컨 볼 루션 화면 참고 : 차 또는 컨볼 루션 검사가 보조 화면에서 20 siRNA를 최대에서 수행됩니다. 이 단계는 일본어 똥에서 각각의 siRNA를 이용하여 넉다운의 효과를 조사하는 것이다네 L. 일반적으로, 각 풀에서 적어도 두 개의 개별 siRNA의 이중 가닥 관찰 된 표현형은 siRNA를 표적 이탈 효과로 인해이 아니라고 확신의 합리적인 학위를 가지고 동일한 표현형을 이끌어 낼 것이다. 또이 단계에서 신뢰성을 높이기 위해, 문제의 유전자를 표적으로 추가적인 개별의 siRNA 이중 가닥을 설계하고 관련 표현형을 유도하는 능력에 대해 시험 할 수있다. 이 실험의 결과는 H는 = 0.6 이상 (즉, 5 개인 siRNA를 중 적어도 3 표현형을 유도 곳이) 6 허용 간주되는 H 점수를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. <ol><li> 10 % FBS와 DMEM 80-90 % 년 합류 한 75cm에게 U20S-HRE 세포의 2 플라스크를 성장. </li><li> 컨트롤에 대한 무료 열 1과 12를 떠나, 차 화면 마스터 접시에 명중 된 각각의 네 개의 개별 siRNA의 이중 가닥의 위치를​​ 계획하여 차 화면 접시지도를 만듭니다. 1.9으로 만 총 컨트롤 마스터 플레이트를 준비합니다50 μL의 각 컨트롤의 볼륨. </li><li> 디컨 볼 루션 / 개인 siRNA의 판을 해동 세 × 10 μL의 복제하고 편안한 20 ㎕의 초과를 허용하는 판지도 (4.2)에 따라 차 화면 마스터 플레이트의 각 웰에 각각의 siRNA를 (200 NM)의 50 μl를 추가 . </li><li> () 복제 당 하나의 분석 플레이트에서 같은 날에 세 개의 반복을 실행하고 (b)에 따라 시약의 볼륨을 조정 : 다음 수정을 기본 화면에 대한 설명 동일한 기본 프로토콜을 사용하여 차 화면을 수행 </li></ol> 참고 : 이상적으로 개인의 siRNA 이중 가닥에 대한 임계 값이 같은 엄격한 설정해야 차단 풀로. 그러나, 적어도 하나의 다른 양면은 설정된 임계 값 내에 특히 여기서 개별적인 siRNA가 10-20 %의 임계 값을 완화하도록 허용 될 수있다. 그것은 siRNA를의 개별 효과는보다 적은 수 있다는 것을 염두에두고 가치 베어링입니다반대로 수영장, 일부의 경우 개별 된 siRNA는 (농도를 차지하더라도) 풀에 존재하는 경우에 비해 분리의 세포 표현형에 강한 효과를 표시 할 수 있습니다.

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포유 동물 세포의 게놈 전체의 siRNA 스크린의 사용은 별개의 생물 학적 경로의 새로운 규제를 식별하는 매우 가치있는 것으로 입증되었습니다. 여기서, 우리는 저산소증 HIF1A - 매개 세포 반응의 레귤레이터를 식별하기 위해 타겟 ubiquitome의 siRNA를 화면의 사용을 설명했다. 그들은 일반적으로 저렴 빠르고, 쉽게 관리 할 수 만 수사관 7, 10, 11, 관심있는 통로의 구성 요소에 대한 보고서입니다 타겟이 화면은 점점 매력이되고있다. 그것은 기본 셀 기자가 심사에 적합한 지 확인하기 위해 분석 개발 단계에 큰 노력을하는 것이 중요합니다, 그 재현성과 낮은 변동성을 달성 할 수있다. 이 라이브러리 규제 가을되는 내 분리의 창을 만들 강력한 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 선택하는 것이 중요하다. 또, 이들은 각각의 분석 플레이트에 내부 제어 역할개인 접시에 문제의 신속한 식별을 허용 화면. 높은...

유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 분자 (UBLs)와 단백질의 변형은 다양한 생물 학적 경로와 스트레스 반응을 조절하는 광대 한 생화학 시스템을 나타냅니다. 타겟 단백질에 UBLs의 공유 결합은 안정성, 현지화, 기능 또는 기판 (1)의 interactome를 조절하는 다양한 결과를 가질 수 있습니다. UBL 수정의 기초가되는 효소 단계는 첫 번째 유비퀴틴 설립, 지금 SUMO, NEDD8, ISG15 및 FAT10를 포함한 대부분의 UBLs와 수정을위한 패러다임의 역할을 하였다. 수정이 발생하는 경우, UBL의 diglycine 모티프의 카르 복실 그룹은 제 E2 컨쥬 효소의 활성 사이트에 전송된다 시스테인 고 에너지 티올을 형성하기 위해 E1 활성화 효소에 의해 활성화된다. E2는 (보통) 측쇄 (isopeptide)을 생성 대상 라이신 잔기가 결합이 상 UBL의 이동을 중재하는 기판 - 결합 E3 리가 아제와 상호 작용. 수정의 연속 라운드 선형 유비퀴틴 체인을 만들 유비퀴틴을위한 일곱 라이신의를 통해 발생할 수있는 기판 상에 또는 N-말단 메티오닌을 통해 isopeptide 체인을 구축하기 위해 발생할 수 있습니다. 이러한 수정은 이전의 전문 단백질 분해 효소에 의해 UBL 제거에 새로운 상호 작용 모티브를 생성하고 분해를 위해 단백질을 대상으로 다양한 목적으로 별도의 토폴로지를 형성한다. 유비퀴틴의 경우 두 개의 E1 효소, 30 ~ 40 E2 활용시키는 효소, 적어도 600 E3 ligase라는 약 100 deubiquitylating 효소 (더빙)가있다. 경로가 다른 10 정도 UBLs 덜 팽창 동안, 전반적인 ubiquitome 복잡성은 특정 UBL 개질 생물학적 결과에 큰 다양성을 제공한다. UBL 생물학의 주요 발전하였으나 그러나, 이러한 ubiquitome 구성 요소의 대부분의 정확한 세포의 역할은 잘 알려져 있지 않은 상태이다. 짧은 INT의 사용erfering 리보 핵산 (siRNA를)은 개별 유전자의 역할은 다른 생물 학적 맥락 3에서 조사 할 수 있도록 구체적으로 인해 파괴 세포의 mRNA를 표적으로하는 siRNA를의 능력에 역 유전학의 강력한 도구로 떠오르고있다. 전체 게놈 화면은 많은 세포 과정의 새로운 규제를 확인하고 유효성을 검사하는 데 사용되었으며, 넓은 과학 사회에 접근 할 유용한 데이터의 재산을 만들었습니다. 전체 게놈 스크린은 매우 유용 입증하면서 그러나, 대상 화면들이 저렴 점점 인기를 끌고있다, 빨리 만 조사가 가장 관심있는 게놈의 구성원에 더 적은 데이터 관리 및보고를 포함한다. 따라서, 더 나은 세포 프로세스 UBL 가족 구성 요소에 관여하는 이해하기 위해, 우리는 모든 알려진 ubiquitome의 구성 요소를 예측을 대상으로하는 인간의 siRNA 라이브러리를 컴파일합니다. 이것은 UBLs, E1 활성화 효소, E2의 공액을 포함효소, E3의 리가 제, 유비퀴틴 결합 도메인 (UBD) 함유 단백질과 더빙. 이 라이브러리는 그러므로 이러한 경로를 지배하는 신규 UBL 성분의 공정한 식별을 허용 별개 생물학적 문제 리포터 세포주의 넓은 범위에 대하여 스크린 할 수있다. 다음 프로토콜은 엄격한 대상의 siRNA에게 저산소증에 HIF1A 의존 반응의 새로운 규제를 식별 할 수 ubiquitome 화면을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 정상 산소 분압에서 HIF1A는 폰 Hippel 린다 우 (VHL) E3 리가 단지 4 인식하고 분해 대상이됩니다 프 롤릴 수산화이 적용됩니다. 저산소증은 HIF1A의 안정화로 이어지는 프 롤릴 하이드 록을 억제하고 그 이후의 저산소증 반응 요소 (HRES)에 결합하는 유전자 발현을 구동 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 안정적 하이록 세 탠덤 복사본 제어 하에서 반딧불 루시퍼 라제를 발현 U20S 골육종 세포를 사용하여 화면을 설명poxia 응답 요소 (HRE U20S-세포) 5. 리포터 활성의 강력한 판독이 달성 적절한 양성 및 음성 대조군으로 결합 할 수있는 경우이 프로토콜은 모든 생물학적 경로에 대해 적응 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>자동 액체 디스펜서</td><td>Fluid-X</td><td>XPP-721</td><td>http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td></tr><tr><td>화이트 월 분석 플레이트</td><td>Greiner Bio</td><td>One 655083</td><td>http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td></tr> <tr><td>Clear Plate Film</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-461</td><td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td></tr><tr><td>siRNA 라이브러리</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>On-Target Plus</td><td>, http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td></tr> <tr><td>트랜스펙션 시약</td><td>, Invitrogen</td><td>Lipofectamine, RNAimax</td><td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td></tr><tr><td>저감 혈청 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>Optimem</td><td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41965-039</td><td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td></tr><tr><td>tryspin-EDTA</td><td>인비트로젠</td><td>25300-054</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td></tr></tbody></table>

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 sirna를 상영

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 분자 (UBLs)와 단백질의 번역 후 변형은 저산소증 응답, proteostasis, DNA 손상 반응 및 전사 등 다양한 생물 학적 경로를 조절하는 동적 인 세포 신호 전달 네트워크로 부상하고있다. 더 나은 UBLs이 인간의 질병에 관련된 경로를 조절하는 방법을 이해하기 위해, 우리는 인간의 siRNA를 컴파일 &quot;ubiquitome&quot;모든 알려진 UBL 시스템 경로의 구성 요소를 예측을 대상으로 1,186 siRNA의 이중 풀로 구성된 라이브러리입니다. 이 라이브러리는 UBL 성분은 당해 통로의 포지티브 또는 네거티브 레귤레이터 역할 결정하는 다양한 생물학적 경로의 기자 발현 세포주의 범위에 대해 스크리닝 할 수있다. 여기에서, 우리는 전사 기반의 루시 페라 제 기자를 사용하여 저산소증에 HIF1A - 매개 세포 반응의 ubiquitome - 레귤레이터를 식별하기 위해이 라이브러리를 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 초기 분석 개발 단계1 차, 2 차 및 3 차 / 컨볼 루션 스크리닝 : 세 단계로 화면을 수행하기 전에 세포주의 선별 적합한 매개 변수를 설정하기 위해 수행된다. 그것은 단지 조사가 가장 관심있는 통로의 구성원에 대한보고의 이점을 제공으로 전체 게놈의 siRNA 라이브러리를 통해 대상의 사용은 점점 더 인기를 끌고있다. siRNA의 심사의 본질적인 한계에도 불구하고, 특히 가양는 siRNA를 표적 이탈 효과로 인한 문제의 경로의 진정한 새로운 규제의 식별은주의 깊게 수행 제어 일련의 실험을 수행함으로써 극복 할 수있다 이러한 단점을보다 큽니다.

이전 검사에, U20S-HRE 세포의 저산소증 응답이 설정됩니다. U20S-HRE 세포는 하류 저산소증에 노출 (그림 1A)에 HIF1A/HIF1B의 이종 구속 된 저산소증 응답 요소의 세 가지 직렬 사본의 융합 반딧불 루시 페라로 구성된 기자의 구조를 표현한다. 세포를 저산소 노출 스크리닝을위한 가장 효율적인 반응을 생성하는 확립 배의 범위 저산소증 워크 스테이션에 배치된다. U20S 세포는 따라서 루시 페라 제 수치가 저산소증 매개 HIF1A 안정화 7에 크게 의존하고, HIF2A의 낮은 수준을 표현한다. 0 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간과 루시 페라 제 활동의 저산소증 의존 유도 (그림 1B)에서 24 시간의 결과 저산소증에 U20S-HRE 세포의 노출. 활동의 ~ 10 배 유도 (그림 1B)에서 24 시간의 결과 저산소증에 U20S-HRE 세포의 노출, 따라서 이것은을 나타냅니다N의 s​​iRNA 검사에...

여기, 우리는 저산소증에 HIF1A - 매개 세포 반응의 새로운 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 규제를 식별 할 수있는 대상의 siRNA &quot;ubiquitome&quot;화면을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기자 활동 중 강력한 읽기가 사용할 수있는 모든 생물학적 경로에 적용 할 수 있습니다.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

이 절차의 전반적인 목표는 HF 1 알파 의존성 저산소증 반응을 예로 들어 생물학적 경로에서 유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 변형 시스템의 새로운 구성 요소가 관여하는지 확인하는 것입니다. 이는 먼저 환경 자극 저산소증에 대한 리포터 세포주의 반응을 최적화하여 이루어지므로 스크리닝에 적합합니다. 절차의 두 번째 단계는 스크리닝에 적합한 Z 팩터를 제공하기 위해 높음 및 낮음 컨트롤을 설정하는 것입니다.매개변수가 설정되면 1차 irna screen이 3회에 걸쳐 수행되며, 그 후 2차 및 3차 deconvolution screen에 의해 hits가 확인됩니다. 궁극적으로, 그 결과는 새로운 유비퀴틴(ubiquitin)과 유비퀴틴(ubiquitin)이 문제의 생물학적 경로의 시스템 조절자(system regulators)와 같다는 것을 밝혀낼 수 있다. 전체 게놈 Irna 스크리닝과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 표적 스크리닝이 더 빠르고, 수행하기 쉽고, 비용이 저렴하고, 연구자가 특성화하는 데 가장 관심이 있는 생화학적 경로의 구성원에 대해서만 보고한다는 것입니다.U2 O-S-H-R-E 리포터 세포주의 저산소증 반응성은 10% FBS를 가진 DMM에 있는 세포의 2개의 75 센티미터 평방 플라스크를 준비되어 있습니다. 세포가 80-90%에 있을 때Confluence는 하나의 플라스크에서 배지를 흡인하고 10ml의 PBS로 해당 세포를 두 번 세척합니다. Tryps는 세포를 아니리로 하고 10%FBS를 가진 DMM의 8 밀리리터에서 그(것)들을 다시 중단한다 피펫으로 세포를 균질하게 하고 2개의 세포 조사의 평균을 얻고, 그 후에 60, 밀리리터 당 000에 세포를 묽게 한다.다음으로, 다채널 피펫을 사용하여 5개의 흰색 벽으로 된 96 Well 분석 플레이트의 3개 열에 6, 000개의 세포를 추가하여 가장자리 효과를 극복하기 위해 배양하는 동안 하룻밤 동안 5개의 플레이트를 배양합니다. 접시 바닥에 젖은 티슈 페이퍼를 놓고 다음 날이 끝날 때 접시 더미 위에 뻣뻣하고 투명한 비닐 봉지를 놓습니다. 시간을 기록하고 한 플레이트를 1% 산소로 설정된 저산소증 워크스테이션으로 옮깁니다.그런 다음 배양 시작 후 14시간, 18시간 및 22시간에 플레이트를 저산소증 워크스테이션으로 이동합니다. 다음으로, 30ml의 루시페라제 용해 완충액을 구성합니다. 루시퍼와 피로인산나트륨을 첨가하기 전에 BSA가 완충액에서 최소 30분 동안 용해되도록 하십시오.첫 번째 플레이트 에디션 후 24시간 후에 저산소증 워크스테이션을 언로드하고 준비된 완충액 100마이크로리터를 각 분석 플레이트의 로드된 웰에 추가하여 세포를 철저히 이가 되도록 합니다. 접시를 투명 필름으로 덮고 10분 동안 흔듭니다. 이제 500RPM에서 스택의 플레이트를 소프트웨어의 자동 플레이트 리더로 옮깁니다.프로토콜 메뉴를 선택하고 BS 5 95를 선택합니다. 그런 다음 웰 선택 메뉴에서 읽을 모든 웰을 강조 표시합니다. run 함수를 클릭하고 플레이트당 평균 Reporter 활동을 계산합니다.그런 다음 저산소증 처리 없이 플레이트의 판독값으로 데이터를 정규화합니다. 저산소증에 대한 강력한 반응은 분석에 필수적이며 보고 활동이 10배 증가한 것은 훌륭합니다. 컨트롤을 설정하고 Z 계수를 계산하여 진행합니다.산 개발 단계는 스크리닝 절차에서 가장 중요한 부분입니다. 세포주의 강력한 표현형 반응을 갖는 것이 중요하며, 이는 우수한 high-end low control과 결합됩니다. 이렇게 하면 IRNA 스크리닝이 성공할 수 있습니다.96웰 형식을 사용하여 기본 화면을 세 번 수행합니다. 7개의 세포가 합류하는 플라스크로 충분합니다. 후드 아래에서 최소 30분 동안 SI RNA 유비퀴틴 라이브러리의 희석 시리즈를 해동하는 것으로 시작합니다.다음으로, 200 나노 몰 SI의 200 마이크로리터 반복 4회가 있는 마스터 제어판을 만듭니다. RNA를 입력합니다. 높은 대조군으로 4개의 well, 낮은 대조군으로 4개의 well, 완충 전용 대조군으로 4개의 well, 비표적 IRNA 대조군으로 4개의 well을 로드합니다. 다음 라벨, 대조군 컬럼 사이에 있는 17개의 흰색 벽 분석 플레이트.각 웰에는 동일한 mRNA를 표적으로 하는 4개의 siRNA 풀이 로드됩니다. 마스터 컨트롤 플레이트와 라이브러리 플레이트의 용액이 각각의 바닥에 모이도록 하려면 2000gs에서 1분 동안 플레이트를 잘 회전시킵니다. 그런 다음 자동 디스펜서를 사용하여 마스터 플레이트에 있는 각 제어 웰 10마이크로리터를 레이블이 지정된 17개의 플레이트 각각으로 옮깁니다.다음으로, 자동 디스펜서를 사용하여 라이브러리 플레이트에서 각 SI RNA 풀의 10마이크로리터를 분석 플레이트로 이동합니다. 디스펜서를 사용하여 미리 결정된 비율로 40ml의 transfection 시약을 준비합니다.10마이크로리터를 17개의 분석 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 40밀리리터는 디스펜서 시스템에 충분한 데드 볼륨을 제공합니다.transfection 시약을 로딩한 후 500RPM으로 1분 동안 플레이트를 흔듭니다. 그런 다음 S-I-R-N-A 형질주입 시약 복합체를 형성하기 위해 20-60분 동안 배양합니다. 이제 U2 O-S-H-R-E 셀의 75cm 정사각형 플라스크 2개를 각각 10ml의 PBS로 세척합니다.그런 다음 트립은 세포를 마개하고 FBS와 함께 8ml의 DM EM으로 세포를 재현탁시키고 50ml의 플라스틱 튜브에 두 세포 컬렉션을 결합합니다. 그런 다음 이전과 같이 셀 밀도를 계산합니다. 75, 밀리리터 당 000에 세포의 155 밀리리터 현탁액을 준비하기 위하여 가치를 이용하십시오.이 부피는 플레이트를 적재하고 후드 아래에 있는 디스펜서의 데드 볼륨을 채우기에 충분합니다. 자기 교반으로 세포를 계속 교반하십시오. 자동 디스펜서를 사용하여 80마이크로리터의 셀을 반응 플레이트의 각 웰에 로드합니다.각각이 준비된 반응. 이제 20 나노 어금니에서 SI RNA와 함께 100 마이크로 리터가 포함되어 있습니다. 시간을 기록하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 5개씩 그룹으로 쌓습니다.다음 이틀 동안 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 이 17개의 반응 플레이트의 두 복제를 시작합니다. transfection 이동 후에 24 시간, 저산소증 워크스테이션에 반응 판.저산소증 기간이 끝나기 2시간 전인 다음날 기자를 유도하기 위해 1% 산소 아래에서 플레이트를 24시간 동안 배양합니다. 이전과 같이 새로운 루시퍼라제 용해 분석 완충액을 준비합니다.200ml는 17개의 플레이트에 충분합니다. 저산소 환경에서 플레이트를 제거한 후 자동 디스펜서를 사용하여 각 웰에 100마이크로리터의 분석 버퍼를 로드합니다.그런 다음 각 플레이트를 투명 필름으로 덮고 500RPM으로 10분 동안 흔들면서 셰이커에 넣습니다. 세포는 완전히 용해됩니다. 이제 이전에 자세히 설명한대로 판을 읽는 작업을 진행하십시오.수집된 데이터를 3회씩 분석하고 후속 스크리닝을 위해 관심 있는 irna를 식별합니다. Greens U2 O-S-H-R-E 세포에는 저산소증 반응 요소의 3개의 다운스트림 사본에 융합된 반딧불이 루시페라제 리포터가 포함되어 있습니다. 이러한 원소는 저산소증 동안 풍부한 HIF 1 알파 HIF 1 베타 이형이량체에 의해 결합됩니다.이들 세포의 저산소증 반응성은 개략적인 프로토콜을 사용하여 I a 라이브러리로 스크리닝하기 전에 결정되었습니다. 24시간의 저산소증은 기준선 대비 루시페라제 발현의 10배 증가를 유도했습니다. Hi F1 alpha 및 FIH one I a를 Low 및 High Controls 세포로 선택했습니다.이러한 대조군으로 형질주입된 결과 저산소증 24시간 후 기준선 루시페라아제 신호의 10% 또는 170%가 나타났습니다. 다음으로, 세포를 유비퀴틴 IRNA 라이브러리로 형질주입하고 24시간 동안 1%산소에 노출시켰습니다. 반응 플레이트를 분석함에 있어서, 각 플레이트에 대해 0.5 이상의 바람직한 Z 인자를 얻었다.각 플레이트의 값은 산점도를 사용하여 표시되었으며, 기본 화면은 높음 컨트롤과 낮음 컨트롤 사이에 값을 등록했습니다. 예상한 바와 같이, IRNA 조절인자의 양성 및 음성 IRNA 조절인자는 거의 동일한 수였으며, 대부분은 보고자에게 유의한 영향을 미치지 않았으며, 2차 및 3차 선별검사는 텍스트 프로토콜에 제공된 세부 사항에 대한 연구를 계속했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 특정 관심 생물학적 경로를 조절하는 유비퀴틴 및 유비퀴틴 호수 시스템의 구성 요소를 식별하기 위해 표적 irna 스크리닝을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.따라서 추가 조사를 위한 출발점을 제공합니다.

sirna-screening-to-identify-ubiquitin-ubiquitin-like-system

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜...

단백질 Ubiquitination의 감지

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

여기에 사용된 실험은 중국 전통 의학의 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 프로브 기술과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.

분자 도킹 및 탈유비퀴틴 효소 프로브 기술을 기반으로 UCHL3 활성을 억제하기 위한 전통 한의학 화합물 스크리닝

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

배우세요 배양된 포유동물 세포에서 siRNA 스크리닝을 통해 유비퀴틴 및 유비퀴틴 유사 시스템의 새로운 조절인자를 확인하는 방법. 이 기술은 HIF1A 매개 저산소 반응 연구에 효율적입니다.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

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