인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

본 절차의 전반적인 목표는 유도만능줄기세포, 유도만능줄기세포 유래 망막색소상피세포 및 태아 망막색소상피세포에서의 micro RNA 발현을 비교하는 것입니다. 이는 먼저 IPS 세포와 태아 RPE를 배양하고 증식함으로써 수행됩니다.

두 번째 단계는 IPS 세포를 RPE로 분화시키는 것입니다. 다음으로, IPS 세포, I-P-S-R-P-E 세포 및 태아 RPE 세포에서 RNA를 추출합니다. 마지막 단계는 RNA 샘플에 대해 마이크로 RNA 마이크로어레이 분석을 수행하고 데이터를 분석하는 것입니다.

최종적으로, 경로 및 네트워크 분석은 증식 및 세포 주기 진행을 포함하여 여러 세포 네트워크에 관여하는 차등 발현 microRNA를 식별하는 데 사용됩니다. 이 방법은 성숙한 RPE 세포 주기 진행, 증식 및 노화로의 분화를 조절하는 micro RNA의 역할과 같이 시각 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 줄기세포 유래 망막 색소 상피를 이용하여 질환이나 손상된 RPE를 대체하는 치료법으로 확장되는데, 이는 치료에 사용되는 세포의 최적 계대 배수(passage number)를 결정할 수 있기 때문입니다.

본 방법은 IPS로부터 RRP의 분화를 조절하는 요인들에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 TC 특이적 세포 유형의 IPS 분화와 같이 다른 장기 시스템에도 적용 가능합니다. 이 절차를 시작하려면, 새로 코팅된 플레이트에 유도만능줄기세포를 웰당 약 350개의 세포 콜로니 밀도로 M tester one 배지에서 분주하고, IPSL 콜로니가 배양액 내에서 4~5일 동안 확장되도록 합니다.

그 후 3일마다 M tesser one 배지를 4 mL의 분화 배지로 교체하고, 배지의 절반을 신선한 분화 배지로 갈아줍니다. 색소가 침착된 포커스가 배양 접시에서 수동으로 분리해낼 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 배양하며, 여기에는 약 40~50일이 소요됩니다. 그런 다음 200 µL 피펫 팁을 사용하여 색소가 침착된 콜로니 주변을 잘라 들어 올립니다.

분리한 콜로니를 수집하여 15 milliliter 원심분리 튜브에 모읍니다. 모은 RPE 세포에 DMMF 12 배지 5 milliliters를 가하고 300 GS에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 배지를 제거하고 세포 펠릿을 5 milliliters의 배지에 재현탁한 후 원심분리를 반복합니다.

세포 펠릿에서 배지를 제거합니다. 그 다음, 세포 덩어리가 단일 세포로 해리될 때까지 37°C에서 pooled I-P-S-R-P-E를 0.25% TRIPSIN EDTA와 함께 5~10분 동안 배양하여 단일 세포 용액을 준비합니다. I-P-S-R-P-E 세포를 I-P-S-R-P-E 배지로 세척한 후, 수집된 세포를 4mL의 I-P-S-R-P-E 배지가 담긴 새로운 matrigel 코팅 플레이트에 분주합니다. 계대 배양 전 3주 동안 세포를 배양하며, 실험을 위해 3일마다 새로운 I-P-S-R-P-E 배지로 교체합니다.

I-P-S-R-P-E 세포를 cm²당 100,000 cells 밀도로 파종한 후, 미분화 IPS 세포를 수집하기 위해 파종 17일 후에 세포를 수집하십시오. 미분화 콜로니의 중심부가 조밀해질 때까지 세포를 배양합니다. 이 상태가 관찰되면, D-M-E-M-F 12 배지로 콜로니를 헹군 다음 Accutane을 사용하여 IPS 세포를 단일 세포로 해리하십시오.

세포를 15 milliliter 원심분리관에 모으고 300 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠렛을 2 milliliter의 D-M-E-M-F 12 배지에 재현탁합니다. 태아 RPE를 수집하기 위해 먼저 태아 RPE 세포 배양물을 D-M-E-M-F 12로 세척합니다. 그 후 37 degrees Celsius에서 0.25%TRIPSIN EDTA를 사용하여 5~10분 동안 세포 배양물을 단일 세포로 해리시킵니다.

태아 RPE 세포를 15 milliliter 원추형 튜브에 수집하고 300 GS에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 상층액을 흡입 제거하고, 2 milliliter의 D-M-E-M-F 12 배지에서 세포 펠렛을 재부유시킵니다.

17일 차에 I-P-S-R-P-E 세포를 수집합니다. 계대 배양 3회 및 5회 후, I-P-S-R-P-E 세포를 PBS로 2회 헹구고 37 °C에서 0.25% trypsin 1 mL와 함께 5~10분 동안 배양하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 그 후 ice cold I-P-S-R-P-E 배지 2 mL로 trypsin을 중화시키고 15 mL 원심 분리 튜브에 세포를 수집합니다.

튜브를 300 Gs에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 마이크로비드 키트의 염색 버퍼 3 mL에 세포 펠렛을 다시 현탁합니다. 염색 버퍼 내의 I-P-S-R-P-E 세포 현탁액을 300 GS에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 흡입하여 제거하고 다시 현탁합니다.

마이크로비드 키트에 포함된 염색 버퍼를 사용하여 세포 펠렛을 100 µL당 2 × 10⁶ cells 농도로 현탁합니다. 2 × 10⁶ cells당 10 µL의 anti TRA1-60 PE 항체를 첨가합니다. 잘 혼합한 후 4 °C에서 10분 동안 배양합니다.

세포 2 × 10⁶개당 1 mL의 염색 완충액으로 세포를 세척합니다. 그 다음, 세포 현탁액을 300 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 이어서 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠릿을 세포 2 × 10⁶개당 80 µL의 염색 완충액에 재현탁합니다.

그런 다음 세포 2 × 10⁶개당 anti-PE 표지 마이크로비드 20 µL를 추가합니다. 잘 섞어 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 세포 2 × 10⁶개당 염색 버퍼 1 mL를 추가하고 300 ×g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.

그런 다음 세포 펠릿을 500 µL의 염색 버퍼에 다시 현탁하고, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자기 세포 분리기를 사용하여 TRA one 60 음성 세포를 분리합니다. 핵산 미니 프렙용으로 설계된 상용 마이크로 원심분리 균질기 미니 스핀 컬럼에 각 샘플을 통과시켜 세포를 용해합니다. 그 후, 소형 RNA 분자를 보존하도록 설계된 상용 RNA 추출 키트를 사용하여 IPS 세포, I-P-S-R-P-E 및 태아 RPE에서 총 RNA를 추출합니다.

NanoDrop 분광광도계를 사용하여 총 RNA 농도를 결정하고, 샘플 그룹 간에 발현 수준이 최소 2배 이상 차이 나는 것으로 확인된 microRNA 목록이 포함된 Excel 파일을 작성합니다. 그런 다음 온라인 RNA 경로 분석 프로그램에 로그인하여 해당 Excel 파일을 업로드합니다. 파일 형식으로는 flexible format을 선택하고, 식별자(identifier) 드롭다운 목록에서 Agilent를 선택합니다.

raw data 헤딩 아래에 입력하십시오. probe ID 열에는 ID를 할당하고, log ratio 열에는 observation one 및 log ratio를 할당하십시오. 그 외 모든 열은 ignore를 선택하십시오.

분석 파라미터를 다음과 같이 선택하십시오. 신뢰 수준은 'experimentally observed only'로 설정하고, 직접 및 간접 관계를 모두 포함하며, 내인성 화학 물질(endogenous chemicals)을 포함합니다. 참조 세트로 ingenuity knowledge base를 선택하십시오. 그런 다음 참조 분자 데이터베이스를 선택하십시오.

여기에는 모든 종, 모든 세포주 및 조직, 그리고 모든 돌연변이의 데이터가 포함됩니다. 모든 파라미터를 선택한 후, 네트워크를 선택하여 네트워크 분석을 실행하십시오. 그런 다음 중첩 네트워크를 선택하고, 관심 있는 네트워크를 클릭하여 결과를 확인하십시오.

I-P-S-R-P-E 세포로 분화된 IPS 세포는 태아 RPE 세포와 유사한 육각형의 색소 침착 세포 형태라는 전형적인 RPE 표현형을 나타냈습니다. 분화되지 않은 IPS 세포와 I-P-S-R-P-E 세포의 micro RNA 발현 프로파일을 비교한 결과, 47개의 microRNA는 발현이 증가하고 36개는 감소한 것으로 나타났습니다. 반면, 태아 RPE 세포는 I-P-S-R-P-E 세포와 비교했을 때 61개의 microRNA 발현이 증가하고 49개가 감소했습니다. Ingenuity IPA 소프트웨어를 이용한 경로 분석 결과, 차등 발현된 microRNA의 표적 유전자들이 세포 발달, 성장 및 세포 주기를 포함한 세포 프로세스에 관여하는 것으로 나타났습니다. 또한 이 분석을 통해 생체 내 안구 조직에서 발현되는 microRNA가 IPS 세포에 비해 I-P-S-R-P-E 및 태아 RPE에서 풍부하게 나타남을 확인하였습니다. 본 절차를 수행할 때, 이후 단계에서 RNA 샘플의 오염 및 분해를 방지하는 것이 중요하다는 점을 유의하십시오.

분화 후 각 세포 유형의 micro RNA 발현 수준을 확인하기 위해 RT-PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 시각 연구 분야의 연구자들이 RPE의 분화 및 세포 주기 진행에서 micro RNA의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 iPS로부터 RPE를 유도하는 방법과 iPS-RPE의 microRNA 발현 프로파일을 iPS 세포 및 태아 RPE와 비교하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.