Name: 인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 배우세요 인간 iPS 세포와 유래 망막 색소 상피 세포 및 태아 망막 색소 상피의 마이크로RNA 발현 프로파일을 비교 분석하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 망막 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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여기에 포함 된 의견이나 주장은 저자의 개인 전망이며, 공식 또는 육군의 부 또는 국방부의 의견을 반영하는 것으로 해석되어서는 안됩니다. 저자 휘트니 A. 그린, 알베르토 Muñiz 및 라 메쉬 R. Kaini가 USAISR에 국가 연구위원회 박사 학위 취득 후 연구 Associateship를 개최하면서이 연구를 수행 하였다. 마이크로 어레이 분석은 Greehey 어린이 암 연구소 마이크로 어레이 핵심 시설 및 UT 건강 과학 센터 샌 안토니오에서 생물 정보학 부서에 의해 수행되었다. 이 작품은 미국 육군 임상 재활 의학 연구 프로그램 (CRMRP) 및 군사 운영 의학 연구 프로그램 (MOMRP)에 의해 지원되었다.

문화 시약 및 문화 플레이트 1. 준비 <ol><li> mTeSR1 미디어 : 제조업체의 지시에 따라 mTeSR1 미디어를 준비합니다. 밤새 4 ℃에서 mTeSR1 배 보충 100 ㎖를 해동 mTeSR1 기초 미디어 400 ㎖에 mTeSR1 배 보충의 100 mL를 넣고 잘 섞는다. 이 매체는 최대 2 주 동안 4 ° C에서 6 개월 -20 ° C에서 안정적이다. </li><li> 차별화 미디어 : 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 0.1 ㎜의 β-머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 2.0 밀리미터 L-글루타민, 10 % 녹아웃 혈청 등을 산출하기 DMEM/F12에서 차별화 미디어를 준비합니다. </li><li> IPS-RPE 미디어 : 1X N1 보충, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 250 ㎍ / ㎖의 타우린, 13 NG / ML 트리 요오도-L-티 로닌 나트륨 염, 20 NG / ML의 하이드로 코티손, 5 μg을 산출하는 MEM에서 IPS-RPE 미디어를 준비 / ml의 겐타 마이신, 및 15 % FBS (26). </li><li> 트리 요오도-L-티 로닌 나트륨 염 원액. 스톡 용액을 제조 트리 요오도-L-티 로닌 1.0 MG 녹여온화 소용돌이 1 N 수산화 나트륨 중의 나트륨 염. 다음 트리 요오도-L-티 로닌 나트륨 소금의 20 ㎍ / ㎖의 50.0 ㎖로 만들어베이스 미디어의 49.0 ML을 추가합니다. 분취 량을 준비하고 필요할 때까지 -20 ° C에서 동결. 최종 배양 배지에 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 볼륨을 사용합니다. </li><li> 하이드로 코티손 원액 : 하이드로 주식 솔루션을 준비 부드러운 교반 무수 에탄올 1 ㎖에 하이드로 코티손의 1 밀리그램을 용해합니다. 다음 50 ㎍ / ㎖를 20 ㎖의 하이드로 코티손 원액에 대한 기본 미디어의 19.0 ML을 추가합니다. -20 ° C에서 나누어지는 동결 필요할 때까지. 최종 배양 배지에서 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 볼륨을 사용합니다. </li><li> 태아 RPE 성장 배지. FBS를 제외하고 제조 업체의 지시에 따라, 기초 미디어 RTEGM 키트의 모든 시약을 혼합하여 성장 미디어를 준비합니다. </li><li> 태아 RPE 도금 미디어. 무균 용기로 성장 배지의 소량을 전송함으로써 도금 매체를 준비2 %의 최종 농도 DD 형식 FBS. </li><li> 디스 파제 : DMEM/F12 1 ㎎ / ㎖의 디스 파제의 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 리겔 코팅 플레이트 : 0.08 ㎎ / ㎖로 DMEM/F12에 리겔을 준비합니다. </li><li> 코트 각 마트 리겔 솔루션의 1.0 ML과 6 잘 플레이트 잘. </li><li> 1.0 시간 동안 실온에서 코팅 된 플레이트를 배양한다. </li><li> 1.0 시간 배양 한 후, 초과 DMEM/F12를 대기음. </li><li> 건조를 방지하기 위해 mTeSR1 매체의 0.5 ML을 추가합니다. 리겔 코팅 된 플레이트를 사용할 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 만능 문화 <ol><li> 유도 만능 줄기 세포 파종하기 전에 모든 튜브, 실내 온도에 따뜻한 mTESR1 미디어, 준비 리겔 코팅 플레이트가 있습니다. </li><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 IMR90-4 iPS 세포를 해동. 그 후 수조에서 cryovial을 제거하고 70 % 에탄올을 이용하여 살균. </li><li> 세포 집합체의 파괴를 최소화하기 위해 2 ㎖ 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 드롭 현명한 주 5 ㎖를 추가RM 부드럽게 mTeSR1의 세포 미디어와 혼합. 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 mTeSR1 미디어 2 ㎖의 세포 집합체를 재현 탁하고 여섯 잘 플레이트 잘 하나에 세포를 씨앗. </li><li> 5 % CO 2, 95 %의 습도가 37 ° C의 배양기와 문화에 접시를 놓습니다. </li><li> 매일 만능 줄기 세포 배양 매체를 변경합니다. 미분화 식민지 5-7 일 파종 한 후 나타납니다. 통로 (조밀 센터와 식민지)에 대한 준비가되어 획일적 인 식민지를 확인합니다. </li></ol> iPS 세포의 3.과 Passaging <ol><li> 종래 통로 처음 IPS 세포가 모두 튜브, 디스 파제 용액 DMEM/F12와 mTERS1 미디어 실온으로 가온하였으며, 마트 리겔은 판이 준비 코팅. </li><li> iPS 세포를 계대하기 전에 지역을 긁고 미디어를 흡입하여 차별화의 영역을 제거합니다. 차별화에 대한 높은 웰의 20 % 미만으로 유지해야한다양질의 문화. 조심스럽게 유도 만능 줄기 세포 함유 아니라 2 ML의 DMEM/F12를 세척하고 각 웰에 1 ㎎ / ㎖ 디스 파제 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 7 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 디스 파제를 대기음 부드럽게 두 번 DMEM/F12 2 ㎖의 세포 식민지를 씻어. </li><li> 세척 한 후, 각 웰에 mTSER1 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 5 ㎖ 피펫을 사용하여 부드럽게 집계를 형성하기 위해 판의 식민지를 다 쳤어요. </li><li> 15 ML 원뿔 관에 분리 된 식민지를 전송합니다. 세포의 다음 구절을 배정하는 충분한 mTeSR1 미디어를 추가합니다. </li></ol> IPS-RPE에 iPS 세포 4. 차별화 <ol><li> mTESR1 미디어에서 새로 코팅 된 플레이트에 iPS 세포를 접시. </li><li> 유도 만능 줄기 세포 식민지 문화에 4 ~ 5 일 확장 할 수 있습니다. </li><li> 4 ML 차별화 미디어 대체 mTeSR1 미디어. 3 일마다 미디어의 절반을 변경합니다. </li><li> 색소 초점은 (40~50일) 수동으로 문화 밖으로 해부 할 수있을만큼 커질 수 있습니다. </li><li> 을 사용하여200 μL 피펫 팁 주변에 잘라 색소 식민지를 들어 올립니다. </li><li> 수집하고 15 ML 원뿔 관에 해부 식민지를 풀. </li><li> 그런 다음 두 번 5 분 300 XG에 풀링 된 RPE 세포와 원심 분리기에 DMEM/F12 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> 0.25 % 트립신 EDTA와 풀링 된 IPS-RPE를 배양하여 단일 세포의 솔루션을 준비합니다. </li><li> IPS-RPE 매체와 IPS-RPE 세포를 씻어에 수집 된 세포를 접시 신선한 리겔 코팅 IPS-RPE 미디어의 4 ㎖에 잘. </li><li> 문화 이전의 통로에 3 주 동안 세포. 3 일마다 미디어를 변경합니다. 실험의 경우, 플레이트 IPS-RPE / ㎠ 100,000 세포에서. 일 17 일에 세포를 수집합니다. 일 0으로 파종의 날을 계산합니다. </li></ol> 5. 시료 채취 <ol><li> 유도 만능 줄기 세포 컬렉션 <ol><li> 문화 iPS 세포 분화 식민지가 중앙에 밀집 것으로 관찰 될 때까지. </li><li> DMEM/F12에 식민지를 씻어. </li><li> accutas를 사용하여 단일 세포로 해리<html> 전자. 5 분 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 세포를 수집합니다. 기음 뜨는. DMEM/F12 2 ㎖에 재현 탁. </li></ol></li><li> 태아 RPE 컬렉션 <ol><li> DMEM/F12와 태아의 망막 색소 상피 세포 배양을 씻어 0.25 % 트립신 EDTA를 사용하여 단일 세포로 해리. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집합니다. 5 분 300 XG에 원심 분리기. 기음 뜨는. DMEM/F12 2 ㎖에 재현 탁. </li></ol></li><li> IPS-RPE 세포 컬렉션 <ol><li> IPS-RPE는 통로 (3)과 통로 (5)에 도달하면 통과 후 17 일째에 세포를 수집합니다. 두 번 PBS에서 IPS-RPE를 씻어 1.0 ㎖를 0.25 % 트립신과 배양하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 차가운 얼음 IPS-RPE 미디어 2 ㎖와 트립신을 중화. </li><li> 5 분 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에있는 세포를 수집합니다. 기음 뜨는. </li><li> 마이크로 비드 키트에서 염색 완충액 3 ml의 세포 현탁액을 재현 탁. </li></ol></li></ol>미분화 세포를 제거하는 IPS-RPE의&gt; 6 ve_title &quot;. 부정적인 선택 <ol><li> 사용할 때까지 4 ° C에서 모든 시약을 유지하지만 얼음에 작동하지 않습니다. 5 분 300 XG에 단계 5.3.4에서 원심 분리기 세포 현탁액. 기음 뜨는. </li><li> 2 × 10 6 세포 당 마이크로 비드 키트에서 염색 버퍼 100 μL의 세포를 Resuspend. </li><li> 2 × 10 6 세포 당 안티-TRA-1-60-PE 항체의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 섞어서 10 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. </li><li> 2 × 10 6 세포 당 버퍼의 1-2 ml의 세포를 씻으십시오. 300 X g에서 10 분 원심 분리기. 기음 뜨는. </li><li> 2 × 10 6 세포 당 염색 버퍼 80 μL의 세포를 Resuspend. 2 × 10 6 세포 당 방지 PE 표지 마이크로 비즈 20 ㎕ (키트)를 추가합니다. 잘 섞는다. 4 ℃에서 15 분 동안 품어 </li><li> 2 × 10 6 세포 당 버퍼를 얼룩의 1-2 ML을 추가합니다. 300 X g에서 10 분 원심 분리기. 기음 뜨는. </li><li> 500 &amp; # 세포를 재현 탁956, 염색 버퍼의 L. </li><li> 자기 세포 분리 : <ol><li> 자기 세포 분류기에 열을 놓습니다. 염색 버퍼의 3 ㎖로 컬럼을 씻어. </li><li> 칼럼에 6.8에서 세포 현탁액을 적용합니다. </li><li> TRA-1-60 음성 세포를 수집하는 부정적인 포트에 튜브를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 7. 총 RNA 추출 <ol><li> 를 Lyse 핵산 minipreps 위해 고안된 시판의 microcentrifuge 균질 소형 스핀 칼럼을 통해 샘플을 실행하여 셀. </li><li> iPS 세포, IPS-RPE, 작은 RNA 분자 (27)를 유지하도록 설계 시판되는 RNA 추출 키트와 태아의 망막 색소 상피에서 총 RNA를 추출합니다. </li><li> Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 총 RNA의 농도를 결정합니다. </li></ol> 8. Bioanalyzer 및 마이크로 어레이 분석 <ol><li> 상업적으로 이용 가능한 RNA 품질 키트와 함께 Bioanalyzer와 RNA의 무결성을 확인합니다. </li><li> 100 NG의를 품어30 분 동안 37 ° C에서 송아지 장 포스와 총 RNA </li><li> 5 분 동안 100 ° C에서 100 % DMSO를 사용하여 RNA를 변성. </li><li> PCP-Cy3에 1 시간 동안 16 ° C에서 배양 T4 리가 아제를 사용하여 함께 샘플을 레이블. </li><li> 8_x_15K 형식 인간 miRNA의 배열에 하이브리드. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 배열을 세척하고 스캐너를 사용하여 5 ㎛의 해상도로 스캔 할 수 있습니다. </li><li> 의 miRNA 마이크로 어레이와 호환 마이크로 어레이 피쳐 추출 소프트웨어를 사용하여 데이터를 획득. </li><li> 각 샘플의 발현의 상대적 수준을 결정하는 miRNA의 신호를 처리한다. </li><li> 샘플 그룹 사이에 각각의 miRNA의 발현 수준을 비교합니다. 추가 분석을 위해 적어도 두 가지 차등 식의 miRNA를 선택합니다. </li><li> 차별적 표현의 miRNA (28)의 시각화를위한 히트 맵을 생성하는 지침에 따라, 데이터 분석을위한 상용 소프트웨어를 사용하여. </li></ol> 9. 경로 분석 <ol><li> 엑셀 형식으로 8.9 선택의 miRNAs의 데이터를 저장합니다. </li><li> 온라인 RNA 경로 분석 프로그램에 로그인합니다. Excel 파일을 업로드 할 수 있습니다. 파일 형식에 대한 &quot;유연한 포맷&quot;을 선택하고 식별자 유형 드롭 다운 목록에서 &quot;애질런트&quot;를 선택합니다. </li><li> 원시 데이터의 제목 아래, ID 열을 조사하는 &quot;ID&quot;를 지정하고 &quot;관측 1&quot;을 지정하고 로그 배급 열에 &quot;비율을 기록&quot;. 다른 모든 열은 &quot;무시&quot;를 선택합니다. </li><li> 다음과 같은 분석을위한 매개 변수를 선택 : 신뢰 : 실험적으로 만 관찰; 직접 및 간접 관계를 포함한다; 내인성 화학 물질을 포함한다; 기준 세트로 독창성 기술 자료를 선택합니다. 모든 종에서 데이터, 모든 세포주 및 조직, 모든 돌연변이를 포함 참조 분자의 데이터베이스를 선택. </li><li> 실행 네트워크와 경로 분석. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

결론적으로,이 보고서는 문화 iPS 세포를 사용하는 방법, IPS-RPE, 태아 RPE에 대해 설명합니다. 만능 줄기에서 파생 된 RPE는 형태 학적 및 기능적으로 태아의 망막 색소 상피와 비슷합니다. IPS-RPE는 RPE65, CRALBP, PEDF 및 LRAT 16 등의 특성 RPE 유전자를 표현한다. 추가로 이들 세포를 특성화하기 위해, RNA를 추출하고 차분 miRNA의 발현을 확인하기 위해 마이크로 어레이 분석을 수행하는 데 사용되었다. 신호 강도의 분석은 차별적 표현의 miRNA의 가장 큰 수는 IPS-RPE는 더 성숙 될 수 있습니다 제안, IPS-RPE 비교 대 태아 RPE에서 검출 된 것으로 나타났다. 미래 연구는 RT-PCR 이러한 결과의 유효성을 검사 할 예정이다. 신중하게 정확한 데이터의 분석 및 취득의 성공을 보장하기 위해 수행해야하는이 실험을하는 동안 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 iPS 세포의 배양 ...

줄기 세포는 한계 및 체세포 형태로 분화 할 가능성없이 복제하는 능력이있다. 개인 조직 재생의 출현은 수평선 1에 그대로 만능 줄기 세포로 체세포를 재 프로그램하는 기술의 개발, 지역 사회 연구와 임상의 사이에 큰 흥분을 유발하고있다. 줄이고 ESCs와 관련된 윤리적 딜레마를 회피하면서 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (ES) 세포 배아 줄기으로 무제한 증식하는 잠재력과 능성의 동일한 기능을 나타낸다. 또, 환자 유래의 줄기 세포는 매우 성공적인 치료 응용 2-3의 확률을 증가, 면역 반응을 자극하지 않을 것이다. 특정 배양 조건에서, iPS 세포는 심근, 신경 세포, 췌장 베타 세포, 간세포, 망막 색소 상피 세포 (RP 등의 체외에서 여러 가지 다른 종류의 세포로 분화하는 것으로 나타났다E) 4-12. RPE는 생산 전문 같은 감광체 외측 세그먼트 미광, 식균의 흡수와 같은 카메라 기능과 건강에 필수적인 여러 가지 기능을 수행 망막의 뒤쪽에 위치하고 색소 상피 세포의 층 및 레티노이드 가공 발색단의. 연령 관련 황반 변성 (AMD), 스타 르가 르트 병, 및 망막 색소 상피 변성증 (RP)와 같은 기본 RPE 병리의 결과 눈부신 질병에 의해 입증 손상 또는 질병에 RPE의 장애 뿌리깊은 광 수용체의 건강과 시각 기능에 영향을 미치는 13. 비전을 복원 할 수 있습니다 참으로 효과적인 치료법이 달성되지 않은, 건강한 RPE와 병에 걸린 RPE의 교체는 비전 14-15의 손실을 방지하는 가장 좋은 옵션이 될 수 있습니다. 의 IPS (IPS-RPE)에서 파생 된 RPE는 손상된 RPE를 대체하는 세포의 가능한 소스입니다. IPS-RPE는 비슷한 특징을 표현TIC RPE 단백질 LRAT, CRALBP, PEDF 및 RPE65; 고전 높은 색칠 육각 RPE의 형태를 표시합니다; CIS 망막 5,16 -와 같은 식균 작용, 레티노이드 처리, 및도 11의 분비와 같은 RPE 기능을 수행한다. IPS-RPE는 치료를 사용하기 전에 그러나, IPS-RPE 철저을 특징으로합니다. RPE의 분화를 제어하는​​ 요인을 이해하는 것은 임상 응용에 사용되는 세포의 수율 및 순도를 향상시킬 필요가있다. 세포 분화는 고도로 조절 유전자 발현의 결과이다. 전사 인자의 게놈과 조정의 성적인 리모델링은 차별화 및 개발 (17) 중에 발생하는 세포의 운명 결정에 필요합니다. 마이크로 RNA (miRNA의)에 의해 메시지 RNA (mRNA의) 번역의 규정은 세포의 운명 1에 영향을 미치는 규제의 또 다른 레벨을 제공합니다. 의 miRNAs는 짧은 ~ 22 NT, 뉴클레오티드의 길이가 억제 번역에 의해 하나의 mRNA의 3 &#39;UTR에 결합 또는 변형의 mRNA를 표적으로한다. 의 miRNAs는 거의 모든 조직에서 검출 된 현재까지 2,000 개 이상의 독특한 인간 마이크로 RNA는 miRBase 데이터베이스에 등록되었습니다. 즉, 하나의 mRNA는 여러 가지의 miRNA 대상이 될 수있는 miRNA 대상의 mRNA에 결합하는 부분적인 보완을 요구하기 때문에, 하나의 miRNA의 가능성이 수십 또는 수백 개의 대상, 그 반대에 바인딩 할 수 있습니다. 이러한 무차별 결합 특성이 극적으로 규제의 복잡성 수준뿐만 아니라 개인의 miRNAs의 기능을 결정 난이도와 역할 세포 기능 18-21에서 각 플레이를 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 연구의 miRNA는 DNA 메틸화 상태 (17)에 영향을 미치는로 분화시 유전자 발현을 정련하는 것으로 나타났습니다. RPE에 대한보다 구체적인 연구에서 miR-204/211은 RPE (22)의 상피 표현형을 촉진하기 위해 표시했다. 다른 그룹은 miRNA의 프로파일을 분석RPE의 ES 세포로부터 분화시와의 miRNA의 독특한 세트를 밝혔다는 분화 과정 23시 표현된다. 사실, miRNA의 프로파일은 명확 ES 세포, 전구 세포, 그리고 말단 분화 세포 24,25 포함한 세포 유형을 구분할 수있다. 250의 miRNAs는 망막로 표현된다. 이러한 연구에 기초하여, 우리의 miRNA가 IP의 망막 색소 상피의 분화 과정에 중요한 역할을한다는 가설을 세웠다. 이 보고서의 목적은 IMR90-4 IP의 RPE의 차별화를위한 프로토콜을 설명하는 것입니다 세포, 마이크로 어레이로 분석 RNA의 수집 및 차동 세 종류의 세포 사이에 표현의 miRNAs, iPS 세포를 식별하는 마이크로 어레이 데이터의 분석 , IPS-RPE 및 태아 RPE. 전체 RNA는 각 세포 유형의 배양으로부터 추출하고 1,205 인간의 miRNAs 144 바이러스의 miRNAs 특정 프로브를 함유하는 miRNA의 마이크로 어레이에 혼성화시켰다. 마이크로 어레이 결과를 비교 하​​였다의 miRNA가 차별적으로 다른 종류의 세포들로 표현 된 결정 D. 2 배 또는 식의 큰 배 변화의 miRNAs는 추가 분석을 위해 선택되었다. miRNA의 분석 소프트웨어 프로그램은 차등 발현 된 miRNAs의 잠재적 표적을 식별하고 선택의 miRNAs 의해 규제 셀룰러 네트워크를 생성하기 위해 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 미디어 + 5X 보충제</td><td>줄기세포 기술</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-&베타;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 교체</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>MEM 미디어</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 보충제</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-l-thyronine 나트륨 염</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>태아 RPE 매체 RTEGM 키트</td><td>Life Technologies</td><td>195406</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate 완충 식염수</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec 세척 완충액</td><td>StemGent</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec 헹굼 완충액</td><td>StemGent</td><td>130-092-222</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 마이크로비드 키트</td><td>StemGent</td><td>130-095-816</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec 세포 분류기 컬럼</td><td>StemGent</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 마이크로 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr>, <tr><td>QIA 슈레더</td><td>, Qiagen</td>, <td>79654</td><td></td></tr>, <tr><td>RNA 6000, Pico LabChip 키트</td><td>, 애질런트</td><td>G2938-90046</td><td></td></tr>, <tr><td>인간 miRNA 마이크로어레이 v16</td>, <td>애질런트</td><td>G4471A</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 ips 세포의 마이크로 rna 발현 프로파일, ip의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

이 보고서의 목적은 마이크로 RNA (miRNA의) 인간 iPS 세포 (IPS-RPE)에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE) 태아 RPE의 프로파일을 비교하기위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 프로토콜은 마이크로 어레이로 분석 RNA의 수집 및 차동 세 종류의 세포 사이에 표현의 miRNAs를 확인하는 마이크로 어레이 데이터의 분석을 포함한다. iPS 세포와 태아의 망막 색소 상피의 문화에 대한 방법이 설명되어 있습니다. 인간의 IPS에서 RPE의 차별화를 위해 사용되는 프로토콜은 설명한다. 우리가 설명 RNA 추출 기술은 miRNA의 마이크로 어레이에 사용하기위한 매우 작은 RNA의 최대 복구를 허용하도록 선택되었다. 마지막으로, 셀룰러 통로 및 마이크로 어레이 데이터의 네트워크 분석을 설명한다. 이러한 기술은 세 가지 서로 다른 유형의 세포의 miRNA 프로파일의 비교를 용이하게 할 것이다.

iPS 세포 (그림 1A)는 IPS-RPE 세포로 분화를 유도하는 분화 조건에서 성장했다. IPS-RPE는 육각형의 색소 세포 형태 태아 RPE (그림 1C)과 유사 (그림 1B)의 고전 RPE 표현형을 나타내었다. 나은의 miRNA는 IP의 IPS-RPE로 분화하는 과정 중에 재생할 수 역할을 이해하기 위해서는, miRNA의 발현 마이크로 어레이 분석을 실시 하였다. 총 RNA는 iPS 세포, 태아 RPE, 작은 RNA를의 최대 보존을 보장하기 위해 mirVana miRNA의 분리 키트를 사용하여 IPS-RPE에서 수집되었다. RNA는 마이크로 어레이 labchip에 하이브리드 전에 정량 및 순도 시험 하였다. 1205, 144 인간 바이러스의 miRNAs를 나타내는 프로브는 각 샘플 세트로부터 miRNA의 발현을 분석하기 위해 사용되었다. 신호는 각각의 샘플에서의 각각의 miRNA의...

마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하​​였다.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

본 절차의 전반적인 목표는 유도만능줄기세포, 유도만능줄기세포 유래 망막색소상피세포 및 태아 망막색소상피세포에서의 micro RNA 발현을 비교하는 것입니다. 이는 먼저 IPS 세포와 태아 RPE를 배양하고 증식함으로써 수행됩니다.두 번째 단계는 IPS 세포를 RPE로 분화시키는 것입니다. 다음으로, IPS 세포, I-P-S-R-P-E 세포 및 태아 RPE 세포에서 RNA를 추출합니다. 마지막 단계는 RNA 샘플에 대해 마이크로 RNA 마이크로어레이 분석을 수행하고 데이터를 분석하는 것입니다.최종적으로, 경로 및 네트워크 분석은 증식 및 세포 주기 진행을 포함하여 여러 세포 네트워크에 관여하는 차등 발현 microRNA를 식별하는 데 사용됩니다. 이 방법은 성숙한 RPE 세포 주기 진행, 증식 및 노화로의 분화를 조절하는 micro RNA의 역할과 같이 시각 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 줄기세포 유래 망막 색소 상피를 이용하여 질환이나 손상된 RPE를 대체하는 치료법으로 확장되는데, 이는 치료에 사용되는 세포의 최적 계대 배수(passage number)를 결정할 수 있기 때문입니다.본 방법은 IPS로부터 RRP의 분화를 조절하는 요인들에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 TC 특이적 세포 유형의 IPS 분화와 같이 다른 장기 시스템에도 적용 가능합니다. 이 절차를 시작하려면, 새로 코팅된 플레이트에 유도만능줄기세포를 웰당 약 350개의 세포 콜로니 밀도로 M tester one 배지에서 분주하고, IPSL 콜로니가 배양액 내에서 4~5일 동안 확장되도록 합니다.그 후 3일마다 M tesser one 배지를 4 mL의 분화 배지로 교체하고, 배지의 절반을 신선한 분화 배지로 갈아줍니다. 색소가 침착된 포커스가 배양 접시에서 수동으로 분리해낼 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 배양하며, 여기에는 약 40~50일이 소요됩니다. 그런 다음 200 µL 피펫 팁을 사용하여 색소가 침착된 콜로니 주변을 잘라 들어 올립니다.분리한 콜로니를 수집하여 15 milliliter 원심분리 튜브에 모읍니다. 모은 RPE 세포에 DMMF 12 배지 5 milliliters를 가하고 300 GS에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 배지를 제거하고 세포 펠릿을 5 milliliters의 배지에 재현탁한 후 원심분리를 반복합니다.세포 펠릿에서 배지를 제거합니다. 그 다음, 세포 덩어리가 단일 세포로 해리될 때까지 37°C에서 pooled I-P-S-R-P-E를 0.25% TRIPSIN EDTA와 함께 5~10분 동안 배양하여 단일 세포 용액을 준비합니다. I-P-S-R-P-E 세포를 I-P-S-R-P-E 배지로 세척한 후, 수집된 세포를 4mL의 I-P-S-R-P-E 배지가 담긴 새로운 matrigel 코팅 플레이트에 분주합니다. 계대 배양 전 3주 동안 세포를 배양하며, 실험을 위해 3일마다 새로운 I-P-S-R-P-E 배지로 교체합니다.I-P-S-R-P-E 세포를 cm²당 100,000 cells 밀도로 파종한 후, 미분화 IPS 세포를 수집하기 위해 파종 17일 후에 세포를 수집하십시오. 미분화 콜로니의 중심부가 조밀해질 때까지 세포를 배양합니다. 이 상태가 관찰되면, D-M-E-M-F 12 배지로 콜로니를 헹군 다음 Accutane을 사용하여 IPS 세포를 단일 세포로 해리하십시오.세포를 15 milliliter 원심분리관에 모으고 300 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠렛을 2 milliliter의 D-M-E-M-F 12 배지에 재현탁합니다. 태아 RPE를 수집하기 위해 먼저 태아 RPE 세포 배양물을 D-M-E-M-F 12로 세척합니다. 그 후 37 degrees Celsius에서 0.25%TRIPSIN EDTA를 사용하여 5~10분 동안 세포 배양물을 단일 세포로 해리시킵니다.태아 RPE 세포를 15 milliliter 원추형 튜브에 수집하고 300 GS에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 상층액을 흡입 제거하고, 2 milliliter의 D-M-E-M-F 12 배지에서 세포 펠렛을 재부유시킵니다.17일 차에 I-P-S-R-P-E 세포를 수집합니다. 계대 배양 3회 및 5회 후, I-P-S-R-P-E 세포를 PBS로 2회 헹구고 37 °C에서 0.25% trypsin 1 mL와 함께 5~10분 동안 배양하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 그 후 ice cold I-P-S-R-P-E 배지 2 mL로 trypsin을 중화시키고 15 mL 원심 분리 튜브에 세포를 수집합니다.튜브를 300 Gs에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 마이크로비드 키트의 염색 버퍼 3 mL에 세포 펠렛을 다시 현탁합니다. 염색 버퍼 내의 I-P-S-R-P-E 세포 현탁액을 300 GS에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 흡입하여 제거하고 다시 현탁합니다.마이크로비드 키트에 포함된 염색 버퍼를 사용하여 세포 펠렛을 100 µL당 2 × 10⁶ cells 농도로 현탁합니다. 2 × 10⁶ cells당 10 µL의 anti TRA1-60 PE 항체를 첨가합니다. 잘 혼합한 후 4 °C에서 10분 동안 배양합니다.세포 2 × 10⁶개당 1 mL의 염색 완충액으로 세포를 세척합니다. 그 다음, 세포 현탁액을 300 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 이어서 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠릿을 세포 2 × 10⁶개당 80 µL의 염색 완충액에 재현탁합니다.그런 다음 세포 2 × 10⁶개당 anti-PE 표지 마이크로비드 20 µL를 추가합니다. 잘 섞어 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 세포 2 × 10⁶개당 염색 버퍼 1 mL를 추가하고 300 ×g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.그런 다음 세포 펠릿을 500 µL의 염색 버퍼에 다시 현탁하고, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자기 세포 분리기를 사용하여 TRA one 60 음성 세포를 분리합니다. 핵산 미니 프렙용으로 설계된 상용 마이크로 원심분리 균질기 미니 스핀 컬럼에 각 샘플을 통과시켜 세포를 용해합니다. 그 후, 소형 RNA 분자를 보존하도록 설계된 상용 RNA 추출 키트를 사용하여 IPS 세포, I-P-S-R-P-E 및 태아 RPE에서 총 RNA를 추출합니다.NanoDrop 분광광도계를 사용하여 총 RNA 농도를 결정하고, 샘플 그룹 간에 발현 수준이 최소 2배 이상 차이 나는 것으로 확인된 microRNA 목록이 포함된 Excel 파일을 작성합니다. 그런 다음 온라인 RNA 경로 분석 프로그램에 로그인하여 해당 Excel 파일을 업로드합니다. 파일 형식으로는 flexible format을 선택하고, 식별자(identifier) 드롭다운 목록에서 Agilent를 선택합니다.raw data 헤딩 아래에 입력하십시오. probe ID 열에는 ID를 할당하고, log ratio 열에는 observation one 및 log ratio를 할당하십시오. 그 외 모든 열은 ignore를 선택하십시오.분석 파라미터를 다음과 같이 선택하십시오. 신뢰 수준은 'experimentally observed only'로 설정하고, 직접 및 간접 관계를 모두 포함하며, 내인성 화학 물질(endogenous chemicals)을 포함합니다. 참조 세트로 ingenuity knowledge base를 선택하십시오. 그런 다음 참조 분자 데이터베이스를 선택하십시오.여기에는 모든 종, 모든 세포주 및 조직, 그리고 모든 돌연변이의 데이터가 포함됩니다. 모든 파라미터를 선택한 후, 네트워크를 선택하여 네트워크 분석을 실행하십시오. 그런 다음 중첩 네트워크를 선택하고, 관심 있는 네트워크를 클릭하여 결과를 확인하십시오.I-P-S-R-P-E 세포로 분화된 IPS 세포는 태아 RPE 세포와 유사한 육각형의 색소 침착 세포 형태라는 전형적인 RPE 표현형을 나타냈습니다. 분화되지 않은 IPS 세포와 I-P-S-R-P-E 세포의 micro RNA 발현 프로파일을 비교한 결과, 47개의 microRNA는 발현이 증가하고 36개는 감소한 것으로 나타났습니다. 반면, 태아 RPE 세포는 I-P-S-R-P-E 세포와 비교했을 때 61개의 microRNA 발현이 증가하고 49개가 감소했습니다. Ingenuity IPA 소프트웨어를 이용한 경로 분석 결과, 차등 발현된 microRNA의 표적 유전자들이 세포 발달, 성장 및 세포 주기를 포함한 세포 프로세스에 관여하는 것으로 나타났습니다. 또한 이 분석을 통해 생체 내 안구 조직에서 발현되는 microRNA가 IPS 세포에 비해 I-P-S-R-P-E 및 태아 RPE에서 풍부하게 나타남을 확인하였습니다. 본 절차를 수행할 때, 이후 단계에서 RNA 샘플의 오염 및 분해를 방지하는 것이 중요하다는 점을 유의하십시오.분화 후 각 세포 유형의 micro RNA 발현 수준을 확인하기 위해 RT-PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 시각 연구 분야의 연구자들이 RPE의 분화 및 세포 주기 진행에서 micro RNA의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 iPS로부터 RPE를 유도하는 방법과 iPS-RPE의 microRNA 발현 프로파일을 iPS 세포 및 태아 RPE와 비교하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

microrna-expression-profiles-human-ips-cells-retinal-pigment

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 형태, 생리, 극성, 그리고 성인 기본 조직의 단백질과 유전자 발현 패턴을 전시 인간 태아의 망막 색소 상피 세포 (hfRPE) 세포의 culturing 합류 monolayers에 대한 재현성 방법을 제공합니다. 이 작품은 여러 가지 안과 질환의 동물 모델로 확장되었습니다.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템

이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

배우세요 인간 iPS 세포와 유래 망막 색소 상피 세포 및 태아 망막 색소 상피의 마이크로RNA 발현 프로파일을 비교 분석하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 망막 질환 치료 연구에 활용됩니다.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

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