Name: Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 zebrafish 유충 심실 주사를 이용한 morpholino 유전자 노크다운 기법으로 조직 재생 과정에서 유전자 기능을 평가하는 방법을. 이 기술은 발달생물학 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 지원되었다, 우리는 기술 지원을 Ayele Tsedeke Taddese을 감사드립니다.

1. 유리 바늘의 준비 (그림 1) <ol><li> 주사 바늘 (그림 1A)를 준비하기 위해 825 ㎜의 유리 모세관을 사용합니다. </li><li> 바늘 풀러에 유리 모세관을 놓고 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 바늘을 당겨 : 난방 사이클 값 : 463; 사이클 값 당기는 : 230; 속도 : 150 밀리 초; 시간 : 150 밀리 초 (그림 1B). </li><li> 마이크로 미터의 접안 렌즈와 입체경에서 20 μm의 직경 바늘을 생산하는 시계 제조 핀셋 뽑아 유리 모세관 휴식. </li><li> 바늘을 날카롭게하고 20 μm의 경사 (그림 1C 및 1D)를 생산하기 위해 젖은 고무 물레와 선반을 사용합니다. 참고 : 샤프 빗면 바늘 뇌실에 삽입의 용이성을 향상시키고, 따라서 조직에 손상을 최소화하고 천공 근육 바늘 (도 1E-G)의 제거 후에 다시 봉인하는 것을 허용한다. </li></ol> 2. Prepar모르 폴리 솔루션의 ATION <ol><li> 7.5 mM의 최종 농도로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에서 동결 건조 된 모르 폴리 용해시켜 모르 폴리 콘텐츠를 준비한다. [자세한 내용은 제조업체의 지침 (재료 표)를 참조]. </li><li> 3.5 MM의 모르 폴리 노 0.5 mM의 엔도 - 포터의 최종 농도 2.8 ㎕의 엔도 - 포터 원액 (1 ㎜) (재료 표 참조) 2.5 μL의 모르 폴리 노 원액 (7.5 mm)를 혼합하여 모르 폴리 노 주입 솔루션을 준비합니다. </li></ol> 3. 모르 폴리 노 주입의 준비 (그림 2) <ol><li> 10 μL microloader 피펫 팁과 마이크로 피펫을 사용하여이 솔루션의 5 μL와 경 사진 유리 바늘을 넣습니다. </li><li> 압축 공기를 넣은 피코 펌프 (그림 2A-C)에 연결된 미세 조작기의 바늘 홀더에 유리 바늘을 삽입합니다. </li><li> 다음 현미경으로 바늘 홀더를 놓고 바늘 만 요구되도록유충 (그림 2A)의 심실에 삽입 한 평면 방향으로 이동합니다. </li><li> 약 45 °에서 주사의 각도를 조정합니다. </li><li> 대기 압력 : 다음과 같이 microinjector 값을 설정 평방 인치 (PSI) 당 20 파운드; 토출 압력 : 15 PSI; 게이트의 100 밀리 초 범위는 1.9의 기간 값 (10.9 밀리 초에 해당). </li><li> 1.5 %의 20 ㎖ (w / v) 겔을 생산하는 표준 마이크로 웨이브를 이용하여 1X PBS에서 융해. 10cm 페트리 접시에 녹은 젤을 붓는다. 일단 경화, 아가로 오스가 진정 유충 (11) (그림 2D 및 2E)을 배치 할 수있는 고랑이되도록 따뜻한 아가로 오스에 홈이 분사 형태를 놓습니다. </li></ol> 4. 주사 (그림 3) <ol><li> 20 ㎎ / L의 tricaine (L-에틸-m-아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트)가 터치 응답을 중지 할 때까지 수족관 물 100 ㎖에 애벌레를 마취. </li><li> 플라스틱 파스퇴르 pipett를 사용복부 측면은 홈 (그림 3A)의 수직 아가 벽에 향하도록 전자 신중하게 젖은 아가로 오스 금형의 홈에 진정 유충을 전송합니다. </li><li> 심실 멀리 주사 바늘 (그림 3A)에서 향하도록 실체 현미경 아가로 오스 플레이트를 놓습니다. </li><li> 심장 심실에 삽입 바늘을 낮 춥니 다. 만 1 ~ 2 μm의 너무 깊이 바늘 (그림 3B 및 3C)를 삽입되지 않도록주의 심실에 바늘을 삽입합니다. </li><li> 바늘이 삽입되면, 하트 (도 3D 및 3E)의 소거를 허용하도록 간격을 기다리고, 4-6 펄스, 용액의 각 전달 3 NL과 심실로 모르 폴리 용액을 주입. </li><li> 주사 후 바늘 (삽입의 평면에 평행)를 제거하고 조심스럽게 E3 매체의 혈중 알코올 농도로 채워진 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 유충을 전송E3 신선한 배지를 포함하는 페트리 접시로 케이. </li><li> 주입 된 유충을 전송할 때 바늘의 건조를 막기 위해, 1X PBS를 함유하는 페트리 접시로 바늘을 배치. </li><li> 반복 4.1-4.6에게 실험 기간 동안 매일 12 ~ 24 시간을 반복합니다. 참고 : 주사를 반복하는 세포의 모르 폴리 노의 흡수 및 유지 보수를 보장합니다. </li></ol> 5. 주사의 분석 (그림 4) <ol><li> 그들은 터치 응답을 중지 할 때까지 20 ㎎ / L의 tricaine과 수족관 물 100 ㎖에 물고기를 마취. </li><li> 평면 젖은 1.5 %에 옆으로 유충을 배치 E3 매체로 덮여 (w / v) 아가로 오스 플레이트. </li><li> 시야 및 형광 이미징과 실체 현미경을 사용하여 이미지의 애벌레. 참고 : 유충이 투명으로, 플루 오레 태그 모르 폴리 노를 직접 주사 후 동물에 걸쳐 혈관에 형광 녹색으로 표시되어야합니다. 이 형광 추가하여 혈관 조직으로 분산됩니다15 분 (도 4A-4C). </li></ol> 재생 파생물의 6. 평가 <ol><li> 피지 이미지 J 무료 소프트웨어 (http://fiji.sc/Fiji)를 사용하여 촬영 한 이미지를 평가합니다. 재생을 조사하는, 제어 및 모르 폴리 주입 유충에 발생한 회생 성장의 양을 결정하기 위해 라인 추적 툴을 사용한다. </li><li> 이미지를 보정하기 위해, 끌어 주 피지 창에 파일을 드롭하여 피지에있는 원본 이미지 파일 중 하나를 엽니 다. </li><li> 다음의 모든 이미지의 배율을 설정하려면 주 메뉴에서 &quot;분석&quot;로 이동합니다. </li><li> &quot;설정 규모&quot;에 대한 메뉴를 클릭 드롭 다운. </li><li> 이 창에서 체크 박스를 클릭하여 &quot;글로벌&quot;옵션을 설정합니다. </li><li> 이제 드래그 앤 드롭 (단계 6.1 참조)에 의해 다시 회생 성장의 양을 측정하기 위해 화상을 연다. </li><li> 도구 모음에서 &quot;프리 핸드 선택&quot;도구를 선택합니다. </li><li> 측정 할 영역 (FI 둘러싸gures 4J-4L). </li><li> Ctrl 키를 누르면 + M. 이 정사각형 픽셀에 둘러싸인 영역의 값을 보여주는 새로운 &quot;결과&quot;창을 엽니 다. </li></ol>

<ol><li>Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6, 2011 (1998).</li>
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</ol>

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뇌 실내 주입은 배아 발생 동안 유전자 기능에 영향을주지 않고 전개 또는 신체 항상성의 나중 단계에서 유전자 기능을 테스트하기위한 신속하고 신뢰성있는 평가 방법을 제공한다. 이 기술의 성공을 보장하기 위해, 하나는 네 가지 중요한 점을 알고 있어야합니다 바늘의 중 1) 바늘 크기, 2) 건조, 3) 양을 최소화하고, 진정 솔루션 4) 최소한의 노출 시간. 너무 큰 바늘 심실 손상과 과다 출혈의 원인이됩니다 동안 너무 작은 바늘은 자주 막히게됩니다. 20 μm의 권장하지만, 바늘 이상 5 분의 1 심실 챔버의 크기 않을 것입니다. 두 번째 중요한 점은 건조하고 막히는 바늘을 유지하는 것입니다. 진정, 전송 및 위치 유충에 바늘과 피할 수없는 자주 일시 정지의 작은 크기는 바늘 끝에서 모르가 건조하고 바늘을 방해 할 수있는 충분한 시간을 제공 할 수 있습니다. 방지하기 위해이것은, 하나의 1X PBS의 페트리 접시에 바늘 젖어있다. 세 번째 중요한 점은 볼륨이 너무 높은 의해 심실의 팽만감을 최소화하는 것입니다. 투약은 바늘의 크...

장기와 부속의 재생은 생존과 피트니스에 대한 근본적으로 중요하다 그러나, 사람 등 여러 가지 척추 동물은 재생 능력을 제한했다. 여러 동물 모델은 광범위한 재생 능력을 가지고 존재하지만, 기관 및 부속 기관 재생하는 동안 유전자 기능을 평가하기 위해 유전자 기술을 반전은 매우 제한적이거나 존재하지 않는 남아 있습니다. 따라서 새로운 접근 방식은 이러한 모델 생물에서 중생의 분자 생물학을 해부하는 데 필요합니다. 제브라 피쉬는 여러 유전자 ​​변형 물고기 라인이 세포를 추적하기 위해 존재하기 때문에 셀 때문에 중요한 여러 장기, 조직 및 부속을 다시 생성 할 수있는 능력뿐만 아니라,의뿐만 아니라 기관 및 부속 기관 재생 1, 분자 생물학을 이해하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다 유전자를 과발현하는 것은 2, 3를 구성한다. 그러나, 유생 지브라 피쉬의 유전자 억제는 주로 overexpre에 한정누구의 유전자 제품 유전자의 내인성 활성을 반영하지 않습니다 이득의 기능 효과를 얻을 수있는 모든 관심의 유전자 또는 사용할 수없는 지배적 인 음성 구조의 (투약) 소지. 따라서, 구체적으로 녹아웃 또는 넉다운하여 유전자 발현을 제거하는 다른 방법은 이러한 문제를 극복하기 위해 필요하다. TALENS은 유전자 기능을 녹아웃 역방향 유전자 수단으로서 존재하여 표적 유전자 특이; 유전자의 초기 요구 사항이 배아 발달의 추가 진행을 방지하기 때문에,이 녹아웃 전략은 매우 자주 초기 배 발생 중에 기능 평가로 제한됩니다. 따라서, 이러한 TALENS를 사용하여 개발 한 후 재생 또는 기관의 항상성 등의 이상 현상을 연구하는 5 4를 배제한다. 따라서 대체 유전자 제거 전략은 완전히 형성 장기 및 구조 유전자 요건을 평가하는 초기 현상 후 유전자 기능을 대상으로하는 필요가있다. </P&gt; 모르 폴리 노를 주사 몇 성인 장기에 유전자를 대상으로하고, 성인이 핀 6-8의 재생에 효과를 볼되었습니다, 그러나이 방법은 전기 충격이 필요하고 많은 내부 장기로 인해 자신의 위치 나 때문에 전기에 대한 민감성에 하나 electroporate하기 어려운 중단. 직접 분사가 구조적 무결성을 방해 할 수 있기 때문에 또는 크기가 제한되어 있기 때문에 또한, 유충의 일부 조직에 직접 주사하기가 어렵습니다. finfold에 직접 분사 할 수 없기 때문에 유충의 꼬리 지느러미는 하나의 구조입니다. 따라서, 전기 천공 및 직접 분사에 대한 대안은 어느 주입 너무 작아서 또는 일렉트로 수없는 조직에서의 유전자를 표적으로 필요했다. 유생 꼬리 지느러미 재생시 특정 유전자의 기능을 대상으로 억제하기 위해, 우리는 모르 폴리 있도록 기존 기술을 수정 한늦은 무대 애벌레 꼬리 지느러미 재생하는 동안 유전자 기능의 ssessment. 이 방법은 함께 엔도 - 포터의 형질 전환 시약 (10)과 형광 태그가 morpholinos와의 심실 전달 9를 사용한다. 일단 심실에, 모르 폴리 노 - 엔도 - 포터 혼합물을 신속하게 혈관을 통해 유충에 걸쳐 퍼져 대상으로 이전에 불가능했을 조직을 입력합니다. 이 주입법은 특정 조직에서의 유전자를 표적으로하도록 변경 될 수 있으며, 아마도 현재의 유전자의 기능을 억제하는 역 유전 방법 부족한 다른 동물 모델에 적용 할 수있다. 따라서, 즉시 유충 단계에서 일반적으로 기관의 항상성 및 재생하는 동안 유전자의 기능을 연구하는 넓은 범위의 사용 가능성이있는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>3&acute를 가진 Morpholino; 플루오레세인 태그</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>맞춤형</td><td>추가 정보 www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene Tools Inc.</td><td></td><td>www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Serva</td><td>120623</td><td>주사 중 물고기를 놓기 위한 주입 플레이트를 붓고</td></tr><tr><td>트리카인(L-에틸-m-아미노-벤제이트-메탄 설포네이트)</td>을 촬영하기 위해 <td>Applichem</td><td></td><td>마취용</td></tr><tr><td>E3 배지(5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl<>sub2; 0.33 mM MgSO4)</td><td></td><td></td><td>를</td> 참조하십시오.</tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td>주사 중 물고기를 배치하고 이미징</td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-3</td><td>주사 바늘 준비용</td></tr><tr><td>Microloader 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5,242,956,003</td><td>바늘 로딩용</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 (3 ml/1 ml)</td><td>브랜드</td><td>747760/ 74775</td><td>유충 이송용</td></tr><tr><td>Flaming/Brown needle puller</td><td>Sutter</td><td></td><td>www.sutter.com</td></tr><tr><td>Watchmaker (Dumont) 핀셋 (크기 5)</td><td>World Precision 인스트루먼트, Inc.</td><td>501985</td><td>날카롭게하기 전에 바늘을 제동하려면</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>올림푸스, 라이카, 자이스</td><td>제조업체에 따라 다름</td><td>전체 주입 설정의 일부</td></tr><tr><td>형광 카메라</td><td>올림푸스, 라이카, 자이스</td><td>제조업체에 따라 다름</td><td>injeciton</td></tr><tr><td>PicoNozzle 키트 (마이크로 인젝터 홀더)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>용 미세주입</td></tr><tr><td>공압 PicoPump (microinjector)</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>미세주입용</td></tr></tbody></table>

zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

제브라 피쉬는 세포와 기관 및 부속 기관 재생의 분자 생물학을 이해하는 중요한 모델입니다. 그러나, 역 유전학을 사용하는 분자 전략은 아직 충분히 제브라 피쉬 배아 후 유생 단계 동안 재생 또는 조직의 항상성의 유전자 기능을 평가하기 위해 개발되지 않은, 그리고 제브라 피쉬의 유충 내에서 여러 조직을 대상으로하기 어렵다. 유전자 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사는 유 전적으로 이러한 단계에서 일시적으로 통제 된 방식으로 zebrafish의 유전자를 표적으로하는 현재의 무능력에 대한 대체 방법을 제공합니다. 이 방법은 이전과 같은 유생의 꼬리 지느러미, 종종 비 침습적 조직 재생을 연구하는 데 사용되는 구조에서와 도달하기 불가능했던 구조 등 신체 전반에 걸쳐 다양한 조직에 완전 분산 모르 폴리 노의 연속 편입 할 수 있습니다. 애벌레 finfold 재생하는 동안 활성화 몇 가지 유전자는 프리젠됩니다성인 척추 조직의 재생에 t, 그래서 애벌레는 성인의 재생을 이해하는 데 유용한 모델입니다. 이 모르 폴리 노 분산 방법은 애벌레 조직의 재생뿐만 아니라 배아 후 조직의 항상성을 조절하는 다른 생리 현상에 필요한 유전자를 빠르고 쉽게 식별 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 전달 방법은 배아 발생 후의 유전자 기능의 평가에 시간적 제어에 대한 현재 필요한 전략을 제공한다.

(그림 3A) 등쪽으로 접근하면 날카로운, 경 주사 바늘을 ​​쉽게 제브라 피쉬의 유충의 심장 심실에 배치됩니다. 마음은 바늘 (그림 3B 및 3C)의 존재에도 불구하고 펌핑을 계속하고 혈액의 흐름이 유지됩니다. 조심 주사는 심장 (그림 3E)에 모르 폴리 노의 분사에도 불구하고 심실 또는 심장 수축 (그림 3D)의 형태를 방해하지 않습니다. 분 이내, 모르 폴리 노 - 엔도 - 포터 솔루션은 혈관 (그림 4a 및도 4b)를 통해 몸 전체에 배포합니다. 모르가 다음과 같은 최소 12 시간 또는 형광 (그림 4C)에서 관찰 더의 finfold 뇌와 같은 다른 조직으로 혈관에서 배포됩니다. 이 방법에서는, 우리는 일의 ...

이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법.

Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

이 절차의 전반적인 목적은 유생의 심실 내 주입을 통해 morphino oligonucleotides를 전달하고 유전자를 억제하여 재생 과정 중의 기능을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유생을 마취시키고 aros 몰드의 홈에 배치합니다. 그다음, 주입 바늘을 심실에 삽입합니다.그런 다음 morpho solution을 심실에 4~6회 주입하며, 이때 심장이 비워질 수 있도록 펄스 사이에 대기 간격을 둡니다. 마지막으로, 가금류 지느러미를 절단하고 3일 동안 재생되도록 합니다. 최종적으로, Fiji image J 오픈 소스 소프트웨어의 라인 트레이싱 도구를 사용하여 지느러미의 재생 면적을 측정함으로써 지느러미 재생에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.형질전환이나 돌연변이 유발과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 직접 주입이 적합하지 않은 유충 조직에서 morphino를 이용한 유전자 넉다운이 가능하다는 것입니다. 직경 0.75 mm의 유리 모세관을 니들 풀러(needle puller)에 넣고 다음 매개변수로 니들을 뽑아낸 후, 마이크로미터 접안렌즈가 장착된 실체 현미경 하에서 시계 제작용 핀셋을 사용하여 뽑아낸 모세관을 끊어 직경 20 µm의 니들을 만듭니다. 그런 다음 고무 회전휠이 장착된 선반을 사용하여 니들을 날카롭게 갈아 20 µm의 베벨(bevel)을 만듭니다. 동결건조된 Morpholino를 1x PBS에 녹여 최종 농도가 7.5 mM이 되도록 morpholino 스톡을 준비합니다.Morpho 주입 용액을 조제하기 위해 2.5 µL의 Morpho 스톡 용액과 2.8 µL의 1 mM endo Porter 스톡 용액을 혼합하여, 최종 농도가 3.5 mM morph 및 0.5 mM endo porter가 되도록 합니다. 10 µL 팁이 장착된 마이크로 피펫을 사용하여 베벨 가공된 유리 바늘에 5 µL의 morpho 용액을 로딩합니다. 그런 다음, 공압식 피코 펌프에 연결된 마이크로 매니퓰레이터의 바늘 홀더에 유리 바늘을 삽입합니다.주입 시 바늘을 한 방향의 평면으로만 이동시키면 되도록 주입 각도를 약 45도로 조정합니다. 다음으로, 마이크로 인젝터 값을 다음과 같이 설정합니다: 유지 압력(hold pressure) 20 pounds per square inch 또는 PSI, 분사 압력(ejection pressure) 15 PSI, 게이팅 범위(range of gating) 100 millisecond, 그리고 10.9 milliseconds에 해당하는 주기(period) 값 1.9로 설정합니다. 1X PBS에 1.5% agarose를 녹여 20 milliliters를 준비한 후, 이를 10 centimeter 페트리 접시에 붓습니다.그런 다음, 굳어진 젤에 홈을 만들어 유충을 마취시키기 위해 홈이 파인 주입 몰드를 따뜻한 아가로스(agarose)에 배치합니다. 유충을 20 mg/L의 trican이 포함된 100 mL의 수족관 물에 넣습니다. 유충이 촉각에 반응하지 않게 되면, 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 유충의 복측이 홈의 수직 아가로스 벽을 향하도록 젖은 아가로스 몰드의 홈으로 조심스럽게 옮깁니다.aros 플레이트를 실체 현미경 아래에 배치하여 심실이 주입 바늘의 반대 방향을 향하게 합니다. 다음으로, 바늘을 내려 심실 내부로 약 1~2 µm 정도 삽입합니다. 이때 바늘을 너무 깊게 삽입하지 않도록 주의하십시오.그런 다음 3 nL의 Morpho 용액 펄스를 심실에 주입하고, 심장이 비워질 때까지 기다린 후 5회의 펄스를 추가로 더 주입합니다. 바늘을 제거하고 건조를 방지하기 위해 1x PBS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 그 후 E3 배지가 채워진 전송 피펫을 사용하여 유충을 신선한 E3 배지가 담긴 페트리 접시로 조심스럽게 옮겨, 세포 내에서 morpho의 흡수와 유지가 이루어지도록 합니다. 주입 상태를 평가하기 위해 실험 기간 동안 12~24시간마다 주입 과정을 반복합니다.물고기를 마취시킨 후, 명시야 및 형광 스테레오 현미경으로 촬영하기 전 E three 배지로 덮인 평평하고 젖은 아가로스 플레이트에 배치합니다. Fiji Image J 무료 소프트웨어의 라인 트레이싱 도구를 사용하여 재생성된 성장량을 측정함으로써 재생 성과를 분석합니다. 먼저, 메인 메뉴의 Fiji 메인 창으로 파일을 드래그 앤 드롭하여 이미지를 보정합니다.드롭다운 메뉴에서 analyze를 클릭하여 모든 이미지의 스케일을 설정하십시오. set scale을 클릭한 다음, 체크박스를 클릭하여 global 옵션을 활성화하십시오. 이제 이미지를 다시 드래그 앤 드롭하여 툴바에서 재생 성장량을 측정하십시오.자유형 선택 도구(freehand selections tool)를 선택하고 측정할 영역을 원형으로 지정합니다. 마지막으로 Ctrl M을 누릅니다. 그러면 선택한 영역의 값이 제곱 픽셀로 표시되는 새로운 결과 창이 열립니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 주입 후 수 분 이내에 morpho endo porter 용액이 지느러미 접힘(fin fold) 및 뇌와 같은 다양한 조직의 혈관계를 통해 최소 12시간 이상 분포됩니다.원위부 유생 지느러미 구조의 재생을 평가하기 위해, 지느러미 접힘의 원위부 끝과 척수, 원위부 척색, (여기서는 보이지 않는) 원위부 몸통 근육, 그리고 직접 주입으로 표적화하기 어렵지만 연속적인 뇌실 주입 후 morpho가 통합되는 것으로 보이는 색소 세포를 제거하였습니다. 따라서 이 방법은 개별적으로 표적화하기 어려운 조직에 morpho를 상대적으로 쉽게 전달할 수 있게 하며, 재생되는 지느러미 내 여러 조직의 유전자 기능을 동시에 평가할 수 있게 합니다. 재생에 관여하는 특정 유전자의 중요성을 분석하기 위해, 유생 지느러미를 부분적으로 절단하고 morpho가 통합된 모든 조직을 절제합니다.시연된 바와 같이, 유생의 지느러미 접힘 구조는 절단 후 수일 내에 재생됩니다. 여기서 재생에 필요한 유전자를 표적으로 하는 morpho는, 주입하지 않은 대조군 및 mismatch morpho 대조군과 비교했을 때 발달 후의 재생 반응을 저해하였습니다. 이 기술은 재생 분야의 연구자들이 제브라피시 지느러미 재생에 관여하는 분자적 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

reverse-genetic-morpholino-approach-using-cardiac-ventricular

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

다른 유전자에 의해 보상이있다면 유전자 기능이 손실의 기능 실험에 드러나지 수 있습니다. zebrafish 모델은 생활 배아에서 이러한 기능 중복을 나타내기 위해 상대적으로 높은 처리량 방법을 제공합니다.

Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

조건부 성인 zebrafish의 망막에서 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법은 intravitreally 안티 센스 morpholinos를 주입하여 망막에 그들을 electroporating 포함하는, 설명되어 있습니다. 그 결과 단백질은 재생이나 그대로 망막에있는 단백질의 역할을 테스트 수 며칠에 대한 무너뜨렸다입니다.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

이 프로토콜은 꼬리에 모르폴리노 주입에 의한 제브라피쉬의 유전자 발현의 표적 녹다운을 설명합니다.

Morpholino 주입: 제브라피쉬의 기능을 연구하기 위해 표적 유전자 발현을 knockdown하는 방법

여기, 우리는 개발을위한 체계적인 접근 방법을 제시 생리 학적 관련성이 민감하고...

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

이 문서에서는, 우리는 안티센스 모르의 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 성인 제브라 피쉬 telencephalon의 심실 세포에서 유전자 발현을 조작하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성인 척추 뇌 기능 연구에 사용할 수있는 효율적이고 빠른 프로토콜로이 방법을 제시한다.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

신경 튜브 형성 후, neuroepithelium은 수축과 튜브가 배아 두뇌 심실을 형성하기 위해 배아 뇌척수 (eCSF)로 채우고 동안 주름. 우리는 더 나은 라이브 배아에서 neuroepithelial 모양 대조적으로 액체 채워진 공간을 시각화이 뇌실 주입 기술을 개발했습니다.

Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

여기 우리는 성인 zebrafish에서 역전사 궤도 주사를하는 방법을 보여줍니다.

성인 Zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사

학습하세요 zebrafish 유충 심실 주사를 이용한 morpholino 유전자 노크다운 기법으로 조직 재생 과정에서 유전자 기능을 평가하는 방법을. 이 기술은 발달생물학 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

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