Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

이 절차의 전반적인 목적은 유생의 심실 내 주입을 통해 morphino oligonucleotides를 전달하고 유전자를 억제하여 재생 과정 중의 기능을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유생을 마취시키고 aros 몰드의 홈에 배치합니다. 그다음, 주입 바늘을 심실에 삽입합니다.

그런 다음 morpho solution을 심실에 4~6회 주입하며, 이때 심장이 비워질 수 있도록 펄스 사이에 대기 간격을 둡니다. 마지막으로, 가금류 지느러미를 절단하고 3일 동안 재생되도록 합니다. 최종적으로, Fiji image J 오픈 소스 소프트웨어의 라인 트레이싱 도구를 사용하여 지느러미의 재생 면적을 측정함으로써 지느러미 재생에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

형질전환이나 돌연변이 유발과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 직접 주입이 적합하지 않은 유충 조직에서 morphino를 이용한 유전자 넉다운이 가능하다는 것입니다. 직경 0.75 mm의 유리 모세관을 니들 풀러(needle puller)에 넣고 다음 매개변수로 니들을 뽑아낸 후, 마이크로미터 접안렌즈가 장착된 실체 현미경 하에서 시계 제작용 핀셋을 사용하여 뽑아낸 모세관을 끊어 직경 20 µm의 니들을 만듭니다. 그런 다음 고무 회전휠이 장착된 선반을 사용하여 니들을 날카롭게 갈아 20 µm의 베벨(bevel)을 만듭니다. 동결건조된 Morpholino를 1x PBS에 녹여 최종 농도가 7.5 mM이 되도록 morpholino 스톡을 준비합니다.

Morpho 주입 용액을 조제하기 위해 2.5 µL의 Morpho 스톡 용액과 2.8 µL의 1 mM endo Porter 스톡 용액을 혼합하여, 최종 농도가 3.5 mM morph 및 0.5 mM endo porter가 되도록 합니다. 10 µL 팁이 장착된 마이크로 피펫을 사용하여 베벨 가공된 유리 바늘에 5 µL의 morpho 용액을 로딩합니다. 그런 다음, 공압식 피코 펌프에 연결된 마이크로 매니퓰레이터의 바늘 홀더에 유리 바늘을 삽입합니다.

주입 시 바늘을 한 방향의 평면으로만 이동시키면 되도록 주입 각도를 약 45도로 조정합니다. 다음으로, 마이크로 인젝터 값을 다음과 같이 설정합니다: 유지 압력(hold pressure) 20 pounds per square inch 또는 PSI, 분사 압력(ejection pressure) 15 PSI, 게이팅 범위(range of gating) 100 millisecond, 그리고 10.9 milliseconds에 해당하는 주기(period) 값 1.9로 설정합니다. 1X PBS에 1.5% agarose를 녹여 20 milliliters를 준비한 후, 이를 10 centimeter 페트리 접시에 붓습니다.

그런 다음, 굳어진 젤에 홈을 만들어 유충을 마취시키기 위해 홈이 파인 주입 몰드를 따뜻한 아가로스(agarose)에 배치합니다. 유충을 20 mg/L의 trican이 포함된 100 mL의 수족관 물에 넣습니다. 유충이 촉각에 반응하지 않게 되면, 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 유충의 복측이 홈의 수직 아가로스 벽을 향하도록 젖은 아가로스 몰드의 홈으로 조심스럽게 옮깁니다.

aros 플레이트를 실체 현미경 아래에 배치하여 심실이 주입 바늘의 반대 방향을 향하게 합니다. 다음으로, 바늘을 내려 심실 내부로 약 1~2 µm 정도 삽입합니다. 이때 바늘을 너무 깊게 삽입하지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 3 nL의 Morpho 용액 펄스를 심실에 주입하고, 심장이 비워질 때까지 기다린 후 5회의 펄스를 추가로 더 주입합니다. 바늘을 제거하고 건조를 방지하기 위해 1x PBS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 그 후 E3 배지가 채워진 전송 피펫을 사용하여 유충을 신선한 E3 배지가 담긴 페트리 접시로 조심스럽게 옮겨, 세포 내에서 morpho의 흡수와 유지가 이루어지도록 합니다. 주입 상태를 평가하기 위해 실험 기간 동안 12~24시간마다 주입 과정을 반복합니다.

물고기를 마취시킨 후, 명시야 및 형광 스테레오 현미경으로 촬영하기 전 E three 배지로 덮인 평평하고 젖은 아가로스 플레이트에 배치합니다. Fiji Image J 무료 소프트웨어의 라인 트레이싱 도구를 사용하여 재생성된 성장량을 측정함으로써 재생 성과를 분석합니다. 먼저, 메인 메뉴의 Fiji 메인 창으로 파일을 드래그 앤 드롭하여 이미지를 보정합니다.

드롭다운 메뉴에서 analyze를 클릭하여 모든 이미지의 스케일을 설정하십시오. set scale을 클릭한 다음, 체크박스를 클릭하여 global 옵션을 활성화하십시오. 이제 이미지를 다시 드래그 앤 드롭하여 툴바에서 재생 성장량을 측정하십시오.

자유형 선택 도구(freehand selections tool)를 선택하고 측정할 영역을 원형으로 지정합니다. 마지막으로 Ctrl M을 누릅니다. 그러면 선택한 영역의 값이 제곱 픽셀로 표시되는 새로운 결과 창이 열립니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 주입 후 수 분 이내에 morpho endo porter 용액이 지느러미 접힘(fin fold) 및 뇌와 같은 다양한 조직의 혈관계를 통해 최소 12시간 이상 분포됩니다.

원위부 유생 지느러미 구조의 재생을 평가하기 위해, 지느러미 접힘의 원위부 끝과 척수, 원위부 척색, (여기서는 보이지 않는) 원위부 몸통 근육, 그리고 직접 주입으로 표적화하기 어렵지만 연속적인 뇌실 주입 후 morpho가 통합되는 것으로 보이는 색소 세포를 제거하였습니다. 따라서 이 방법은 개별적으로 표적화하기 어려운 조직에 morpho를 상대적으로 쉽게 전달할 수 있게 하며, 재생되는 지느러미 내 여러 조직의 유전자 기능을 동시에 평가할 수 있게 합니다. 재생에 관여하는 특정 유전자의 중요성을 분석하기 위해, 유생 지느러미를 부분적으로 절단하고 morpho가 통합된 모든 조직을 절제합니다.

시연된 바와 같이, 유생의 지느러미 접힘 구조는 절단 후 수일 내에 재생됩니다. 여기서 재생에 필요한 유전자를 표적으로 하는 morpho는, 주입하지 않은 대조군 및 mismatch morpho 대조군과 비교했을 때 발달 후의 재생 반응을 저해하였습니다. 이 기술은 재생 분야의 연구자들이 제브라피시 지느러미 재생에 관여하는 분자적 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.