Name: 개발의 초기 단계에서의 해부와 얼룩말 핀치 태아의 다운 스트림 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 얼룩말 핀치(Taeniopygia guttata) 초기 태아의 무손상 해부 기법을 통해 형태학 및 유전자 발현 분석을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 발달생물학과 독성학 연구에 필수적인 고품질 RNA 추출과 이미징을 가능하게 합니다.

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저자는 자신의 자금 출처, 윌리엄과 메리의 대학 하워드 휴즈 의학 연구소 학부 과학 교육 프로그램을 감사한다; 보조금 스폰서 : NIH (MSS) 허가 번호 : R15NS067566. 또한 동물 보호에 대한 지원은 예술과 과학의 윌리엄 앤 메리 대학 생물학과 대학에서 지원을 인정합니다.

윤리 문 : 방법은 윌리엄과 메리의 대학에서 사육 식민지에서 길 들여진 얼룩말 핀치와 함께 실시했다. 모든 절차는 RSPCA의 가이드 라인 (23)을 따라 윌리엄과 메리의 OLAW (실험 동물 복지 사무소) 동물 복지 보증 (# 1 A3713-01)의 대학에 의해 승인되었고 (# 2013-06 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을했다 - 02-8721 - dacris). 1. 달걀 수집 및 창업 보육 <ol><li> 어두운주기 : 14시 10분 빛에 얼룩말 핀치 쌍을 설정합니다. 음식, 물, 건초, 그리고 둥지 상자 임의로 공급. 참고 : 얼룩말 핀치에 대한 일반 관리 및 번식이 잘 (23)를 설명하고있다. </li><li> 경사 선반 표준 병아리 부화기를 준비합니다. 참고 : 매일 인큐베이터의 바닥에 물을 첨가하여 95 %의 습도 - - 80와 C ° (1 + / -) 37.5에서 인공 부화기를 유지한다. 인큐베이터 이틀 동안 평형을 허용사용하기 전에. <ol><li> 인큐베이터에서 계란을 저장하기에 적어도 2.5 cm 깊이의 작은 공급 컵 (5 × 7.6 cm)를 선택합니다. 아직도 계란이 쉽게 롤을 허용하면서 선은 바닥 및 종이 타월의 2 개의 층을 가진 컵의 아래 가장자리는 컵, 패딩되도록. 인큐베이터의 경사 선반에이 컵을 놓습니다. 참고 : 너무 많은 패딩 롤링을 억제 할 수 인해 쉘 내부에 배아 접착에 성공적으로 부화를 방지 할 수있다. </li></ol></li><li> 빛주기의 발병 다음 두 시간 동안 계란을 수집합니다. 참고 :이 부모의 배양에 의한 소정의 배양 시간에 대한 개발 단계의 차이를 최소화 할 수 있습니다. <ol><li> 부드럽게 계란의 길이를 따라 팁과 기지에서 엄지와 집게 손가락으로 계란을 선택합니다. 둥지에서 수집 마련 날짜와 시간에 레이블을 둔 부드러운 4B 흑연 연필을 사용합니다. 참고 : 부드러운 4B 연필 깨지기 쉬운 달걀 껍질을 깨는 연필의 위험을 줄일 수 있습니다. </li><li> 각 C의 5 표시된 계란 - 1.3.2) 배치 1인큐베이터에서 계란 자유롭게 쉘의 내부에 배아의 부착을 방지하기 위해 롤백 할 수 있도록 최대. 참고 : 한 잔에 5 개 이상의 계란을 배치하면 개별 계란의 흔들림을 방지하고 태아의 생존 능력을 감소시킬 수있다. </li></ol></li></ol> 난자에서 배아의 2. 제거 <ol><li> , 절개를 준비 다음과 같은 물질 조립하려면 깨끗한 메스, 뾰족한 집게, 두 개의 별도의 뾰족한 집게를. 10 × 10 cm의 절개를 위해 깨끗하고 비 흡수성 표면을 제공하는 해부 범위의 기초에 종이의 무게를 놓습니다. 참고 : 노른자를 쉽게 조작 할 수 있으며 메스 섬세한 막 절단을위한 최고의 표면이기 때문에 무게 용지가 중요합니다. </li><li> 50 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브에 인산염 완충 생리 식염수 (1X PBS)의 분취 량을 준비하고, 적어도 세 가지 전송 피펫와 작은 쓰레기 통을 획득. 배아를 고정하는 경우, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 분취 량을 준비주의 :. PFA 증기는 독성,D PFA와 관련된 모든 단계는 노출을 최소화하는 흄 후드 내부에서 수행되어야한다. 플래시는 배아를 냉동하면, 액체 질소를 획득하고 해부 범위 근처에 보관. 불임이 해부 프로토콜에 대한 문제가되지 않지만 모든 자료가 깨끗한 확인합니다. </li><li> 얼룩말 핀치 준비 가이드 (22)의 설명에 따라 원하는 단계에 필요한 시점에서 인큐베이터에서 계란을 제거합니다. 참고 : 22 12 배아 (그림 3A) 단계를 해부하는 6 단계의 배아 (그림 4A) (22)를 해부하고 배양 56 시간 후 알을 제거하기 위해 배양 36 시간 후 알을 제거합니다. </li><li> 광섬유 조명 램프를 사용하여 내부를 조명하는 계란을 통해 수직 축에 빛나는 빛을 따라 그것을 잡고 계란을 촛불. 계란 뒤에 빛의 끝을 놓고 노른자와 배아를 찾습니다. <ol><li> 노른자 반대 측면에 메스를 위치에 끝에서 계란을 따라 절단희미한 압력 기본. </li></ol></li><li> 조심스럽게 엄지 손가락과 집게 손가락으로 계란의 팁과 기초에 압력을가하거나, 부드럽게 집게로 잘라 함께 껍질을 따로 올리하여 계란의 내용을 제거합니다. 노른자가 부드럽게 구르고 있도록 직접 무게 종이 위의 계란을 엽니 다. </li><li> 배아 발달을 둘러싸고있는 희미한 흰색 링으로 볼 수 있으며 태아가 중앙에 위치하도록 여분의 벌금을 사용하여 노른자 집게를 기울 방향 접합의 흰색 영역의 노른자를 검사합니다. 참고 : 노른자의 표면에 희미한 흰색 원이 관찰되지 않는 경우, 미세 집게을 부드럽게 배아는 노른자 위에 때까지 노른자위를 통해 롤. 참고 : 단계의 경우 1 - 9 (22), 배아 디스크는 직경이 6 mm 미만이며, 노른자의 표면에 희미한 약간 불투명 디스크로 볼 수 있습니다 - 참조 그림 1을 참조하십시오. 단 10 세 이상 22, 혈액 풀을 향상 V에게 허용배아의 isibility하지만,이 어려운 배아의 위치를​​ 만들면서, 난황을 천공하지 않도록주의하십시오. </li></ol> 여분의 배아 조직에서 배아의 3. 분리 <ol><li> 압력 (그림 1B)를 해소하기 위해 노른자의 가장자리에 구멍을, 그리고 배아 디스크와 함께 노른자 지름의 길이에 걸쳐 하나의 상처를 확인합니다. 배아를 포함하는 노른자의 섹션이 성공적으로 (그림 1B)로 구분 될 때까지이 대각선 라인을 만드는 반복합니다. 주의 :이 단계는 난황 질량이 본래대로 할 수 있지만 배아 구조물의 손상을 방지 배아 주위 절단시 노른자의 표면에 감압 더 정밀도 허용한다. </li><li> 전송 피펫으로 노른자의 가장자리를 제거합니다. 가능한 한 많은 노른자를 제거하지만 배아 무게 종이와 눈물의 건조한 표면에 부착되지 않도록 소량을 남겨 참고. </li><li> 도포를하여 배아 디스크를 세척배의 바닥을 향해 45도 각도로 1X PBS를 주입. 다음에이 아니라 위에서 배아 디스크 전송 피펫의 팁을 놓으십시오. 추가 노른자 요구 사항이 제거 될 경우, 페트리 접시에 배아를 전송하기 전에 무게를 종이에 메스 어떤 노른자를 분리합니다. 참고 :이 방법은 무게 종이의 표면에서 배아를 제거합니다. </li><li> 작은 플라스틱 배양 접시에 1X PBS의 최소한의 볼륨과 함께 전송 피펫을 사용하여 배아를 전송합니다. 배아에 직접하지 페트리 접시에 더 많은 1X PBS를 추가하고 근처 1X PBS 떨어지는, 그러나에 의해 배아를 씻으십시오. 페트리 접시 전송 피펫으로 폐기물 1X PBS를 씻어 제거 잔류 노른자, 페트리 접시를 기울하고 제거하는 소용돌이 친다. NOTE : 1X PBS를 제거하면 플라스틱 표면이 잔류 1X PBS와 함께 미끄러 때문에, 배아 일반적 배양 접시의 바닥에 부착하지 않는다. 배아 접시 붙어 그러나 더 1X PBS를 첨가 할 수있다. 만약 고정 t그는 배아 단계 3.5 및 3.6을 따릅니다. 플래시 배아를 냉동 경우, 즉시 3.8 단계로 이동합니다. </li><li> 현장 하이브리드 화에 대한 배아를 고정하는 경우, 즉시 배아를 잠수함 페트리 접시에 4 % PFA를 추가합니다. 평평하게하기 위해 배아의 상단에 직접 4 % PFA 드립; 이 컬링에서 배아를 방지 할 수 있습니다. 12 시간 동안 4 ° C에서 4 % PFA의 배아를 수정. <ol><li> 고정 후, 등급 메탄올 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 (메탄올) 솔루션과 저장소에있는 배아를 탈수. </li></ol></li><li> 배아 단계 1 사이에 있으면 - 8 22 배에 부착 된 난황 막 제거합니다. 주의 :이 단계는 정착 동안 또는 후에 수행 될 수있다. 그들은 난황 막에 부착하기 때문에 스테이지 (8) 22 세 미만의 태아는 쉽게 그림 2A에서 볼 수있는 것처럼 키 구조를 모호하게 가시화되지 않습니다. <ol><li> 그립 여분의 미세 집게와 접합의 영역을 넘어 확장 멤브레인의 가장자리. Carefully 잔류 난황 과립을 씻어하고 난황 막에 배아 디스크의 준수를 느슨하게 여러 번에 배아를 플립. 참고 :이 배아 구조를 손상시킬 수로, 배아의 중심을 만지지 마십시오. </li><li> 간격이 접합의 영역과 난황 막 사이에 나타나지 않는 경우, 부드럽게 여분의 벌금 접합 영역이 난황 막에서 느슨하게 집게를 밀고 스크래치. 그립 여분의 벌금 난황 막 집게를 스쳐 부드럽게 떨어져 배아에서 당깁니다. 필요한 경우, 부드럽게 접합의 영역에서 배아 디스크의 주연을 그립에 의해 멀리 난황 막에서 배아를 잡아 당깁니다. </li><li> 제거 후 생물 1 폐기물 (바이오 안전성 레벨 1)에서 난황 막 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 병아리 배아 (24, 25)에 대한 표준 전체 마운트 ISH 프로토콜을 따라야하지만, 다음과 같은 제안을 고려, 젊은 배아 단계에 ISH 분석을 실시합니다. <ol&gt; <li> , ISH의 절차를 수행하는 동안 태아의 손상을 줄이고 각각​​의 배아에 대한 스크류 캡으로 한 5 ㎖ 유리 병을 사용하십시오. 배아가 완전히 침수되는 것을 보장 용액 3 ㎖ - 만 2 병을 채우십시오. Nutate 병 수직 스티로폼 랙 (또는 보안 튜브를 유지합니다 어떤 랙)에 5 ㎖의 유리 병을 배치하여 nutator에 고정된다. 참고 :이주의 사항은 수평 장동 동안 유리 병의 뚜껑에 접촉 할 때 발생할 수있는, 찢어진되는 배아를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 배아 단계를 0 - 6 22, 실온에서 5 분 1X PTW 5 ㎍ / ㎖의 단백질 분해 효소 K로 처리. 배경 염색을 줄이기 위해 37 ° C에서 10 분 동안 1X PTW 12 22 10와 ㎍ / ㎖의 단백질 분해 효소 K를 - 배아는 7 단계적 치료. </li><li> 12 시간 동안 10 ㎍ / ml의 프로브 농도로 배양, 10 (22) - 1 단계에서 유전자 발현의 낮은 수준을 검출하기 위해 충분한 발색 반응을 생성한다. 이전 단계의 경우, 1 &amp; #로 배양956, 60 ℃에서 g / ㎖ 프로브 농도 </li></ol></li><li> 해부 다음 페트리 접시에 3 ㎖의 1X PBS와 난황 과립에서 배아를 분리 배양 접시를 기울 - 플래시 냉동 배아는 빠르게 2를 추가합니다. 액체를 제거하고 2 반복 - 모든 노른자를 제거하기 위해 3 번. 잘 사용하면 C. -80 ° 저장하기 전에 미리 표시 microcentrifuge 관과 액체 질소에 플래시 동결 포셉, 전송 배아를 기울 </li></ol> 4. 에듀 세포 증식 분석. 법인 설립 및 얼룩말 핀치 배아 에듀 감지. <ol><li> 배아 또는 노른자를 찾기 위해 광섬유 조명 램프를 사용하여 계란을 촛불. </li><li> 배아 미세 주입 공정 중에 손상되지 않도록 난자 내의 배아 또는 난황의 위치를​​ 알 반대측의면을 표시한다. </li><li> 라인 원하는 방향으로 계란을 보유하는 그릇 모양의 점토와 곰팡이를 가진 60mm 플라스틱 접시. 표시된 지점이 있어야한다미세 조작기를 사용하여 마이크로 인젝션 용 바늘의 삽입을 허용하도록 지향. 참고 : 점토가 미세 주입하는 동안 단계 4.11에서 배양을 통해 계란을 안정됩니다. </li><li> 두 개의 유리 모세관 미세 주사 바늘을 빼냅니다. 표시된 지점에 달걀에 구멍을 찌를 하나의 바늘을 무디게. 미네랄 오일로 backloading 및 microinjector에 삽입하여 주입 제 마이크로 인젝션 용 바늘을 준비한다. </li><li> microinjector에 59.8 NL에 주입 당 발표 솔루션의 볼륨을 설정합니다. </li><li> 10 mM의 주식 에듀 솔루션을 미세 주사 바늘을 넣습니다. </li><li> 쉘을 무너 뜨리거나 달걀 공동으로 쉘의 조각을 드롭하지 않도록주의하면서 무딘 유리 모세관로 표시된 자리에서 껍질에 구멍을 만듭니다. 구멍이 미세 주사 바늘이 노른자 또는 태아에 구멍을 통해 직접 삽입 할 수 있도록 45도 각도가되도록 계란의 방향. </li><li> 미세 조작기를 사용하여 삽입약 1.0 cm 구멍으로 바늘을로드. </li><li> 직접 개발 배아 또는 노른자위에 에듀 솔루션의 원하는 양을 주입. 참고 : EDU 478 NL의 최대 배아 사망을 초래하지 않고 주입 할 수있다. </li><li> 즉시 계란 부화하는 동안 태아의 탈수를 방지하기 위해 접시를 커버하는 플라스틱 포장의 여러 계층과 계란과 점토 홀더를 포장. 플라스틱 테이프 가장자리가 배양 중에 풀기에서 플라스틱을 방지하기 위해 접시의 바닥에 포장. 참고 : 플라스틱 포장은 해부하기 전에 즉시 제거해야합니다. </li><li> 원하는 단계에 도달 할 때까지 새로 증식하는 세포가 37 ° C에서 알을 배양하여 에듀를 통합 할 수 있습니다. 주사 후, 인큐베이터에있는 선반을 기울이기로 계란을 반환하지 않습니다. 인큐베이터 안에 안정된 표면에 플라스틱 포장 점토 늘어선 접시를 놓습니다. </li><li> 플라스틱 포장을 제거하고 상기 프로토콜 다음 배아를 해부하다.4 % PFA의 배아를 수정하고 상술 한 바와 같이 4 ° C에서 12 시간을 배양한다. 고정 후, 추가 분석 할 때까지 -20 ° C에서 신선한 100 % EtOH로 5 분 및 저장을위한 100 % 에탄올 (EtOH로)로 세척. </li></ol> 5. 에듀 반응 프로토콜을 &quot;클릭&quot; 다음 단계는 모든 유리 병에서 수행됩니다. <ol><li> 다음의 연속 5 분 세척과 배아를 재수 : </li><li> EtOH로 75 % EtOH로 25 % 살균 탈은 25 % EtOH로 75 % 1X PTW, 100 % 1X PTW (SDD) 물, 50 % EtOH로 50 %의 SDD의 증류수 </li><li> 10 분마다 100 % 1X PTW에 세 번 씻으십시오. </li><li> 구 부분 10X 콘텐츠 버퍼 용액 (10 μL)의 한 부분을 결합하여 반응 완충액 첨가제 (키트 부품 F)를 희석하여, 물 (90 μL)을 SDD. </li><li> 혼합하여 별도의 관에서의 반응 믹스를 준비 다음 100 ㎕의 희석 반응 버퍼 첨가제 875 μL 1X PBS 20 μL CuSO 4, 5 ㎕의 아 지드를.참고 : 반응 혼합물의 부피가 축소 될 수있다. 배아가 완전히 반응 혼합물에 포함되는 경우 반응이 작동합니다. 사용 직전에 희석 된 반응 버퍼 첨가제 (단계 5.3)를 추가합니다. 이후의 모든 단계는 어둠 속에서 수행됩니다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 배아를 커버. </li><li> 알루미늄 호일로 바이알을 커버하고 nutator 부속 스티로폼 랙에 배치하여 2 시간 동안 실온에서 세로로 배양한다. </li><li> 10 분마다 신선한 1X PBS에서 배아를 3 회 반복한다. </li><li> 4 ℃에서 하룻밤 신선한 4 % PFA의 배아를 품어 </li><li> 4 ° C에서 신선한 1X PBS에서 10 분 각각의 저장소에 대한 1X PBS로 3 회 세척 추가 분석을 할 때까지 호일로 배아를 커버. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

배아 준비 가이드 (22)와 게놈 주석의 최근 발전은 얼룩말 핀치 개발 연구를위한 바람직한 모델 생물합니다. 그러나, 단계 1에서 3-7밀리미터 범위 얼룩말 핀치 배아의 작은 크기와 취약성 - 10 22, 11, 14 해부 어렵게 만들 수 있습니다. 위치과 청결 노른자의 표면에서 배아를 제거하는 것은 도전이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 절차를 수행하기 위해 충분한 세부 사항을 제공한다. 이 프로토콜은 성공적으로 절개를 보장하기 위해 일반적으로 알려져 있지 않습니다 만, 필요한 중요한 단계를 보여줍니다. 예를 들어, 배아 및 나와 배제 용지의 무게의 시트 사이 노른자의 작은 층을 남겨두기 위하여 필수적이다. 배아의 식별 및 제거 모두 어려울 수 있습니다. 이 후 난황의 표면에 배아를 식별 해결하기 위해, 직접 노른자 위에 빛을계란에서 제거하고 배아를 찾기 위해 45 ° 각도로 노른자보고되었습니다. 배아가 위치한되면, 배아를 찢어지지주의하면서 종이의 무게에 노른자를 잘라. 구조의 더 나은 시각화를 위해 8 22 - 추가 응용 프로그램은 해부학 현장 하이브리드의 차이, 또는 세포 증식 시험 법에 대한 이미지를 포함하는 경우는 1 단계에서 난황 막 제거하는 것이 중요합니다. 초기 단계에서 노른자 또는 난황 막 제거 할 때 문제가 발생하는 경우, 배아 취약성을 줄이기 위해 1X PBS로 세척하기 전에 4 % PFA의 배아를 수정. 설명 된대로 첫 해부 동안 난황 막을 제거함으로써, 구조 현장 하이브리드의를 수행 한 후 명확하게 얼룩말 핀치 배아에 보이는 그대로입니다. EDU의 한계는 배아 사망에 478 NL 리드에 투여 볼륨의 관리입니다. 그러나 광대 한 복용량 범위는 varyin 수 있습니다증식 세포 태그의 g 수준. 이 키트에 사용되는 &quot;클릭&quot;반응은 구리 (I) - 촉매 - 알킨 - 아 지드 - 사이클로 (구리 (I) AAC)입니다. 이러한 특정 반응에서, 알킨 함유 티미 딘 아날로그 분자 (EDU)가 적극적으로 셀을 분할하여 통합된다. 듀의 알킨 그룹 DNA의 나선 구조로부터 돌출 한 자유 알킨 그룹에 바인딩 녹색 형광 분자에 접합 지드 분자에 노출에 의해 검출된다. 녹색 형광 배아에서 새로 증식하는 세포를 보여줍니다. 이러한 반응 종은 생물에 자연적으로 존재하지 않기 때문에 아 지드의 바이오 직교성과 알킨 그룹이 아닌 특정 얼룩을 방지 할 수 있습니다. DNA가 발생하는 반응의 순서 변성 할 필요가 없으므로, 상기 DNA 의존성 분석은 쉽게 27을 행할 수있다. 이 방법의 고유 제한은 작은 크기와 파편입니다얼룩말 핀치 배아의 ility. 주의 수행이되지 않을 경우 15 22 손상 배아 구조가 발생할 수 있습니다 - 배아의 난황 막 제거 1 단계입니다. 그러나이 프로토콜은 조사자 이전 깊이 연구되지 ​​않은 구조적 기형 및 유전자 발현을 조사하는 초기 배아 단계를 사용할 수 있도록 절개 방법을 단순화한다. 이 프로토콜은 수사관 성인 표현형의 발달 기원을 확인 할 수 세포 분자 분석의 과다에 대한 방법을 엽니 다. 예를 들어, 유전자 발현은 다양한 환경 조건에서 보컬 학습에 연루 또는 개발 28, 29,30,31의 초기 단계에서 약물 치료를 다음 검사 할 수있을 것이다. 이 글에서 설명하지 않지만,이 방법은 잠재적으로 얼룩말 핀치 조직 섹션과 일렉트로 / OV에 대한 현장 하이브리드의 방사성 등의 절차를 허용O 수술 32, 33, 34. 얼룩말 핀치 문학의 광대 한 본문 내에서 중요한 모델 생물로 설립 된 것을 감안할 때, 이러한 연구는 성인 생리학과 행동 발달 메커니즘을 연결 언어 7, 9의 특히 발전에 숨은 기회를 제공합니다.

이 기술의 전반적인 목표는 개발 연구의 넓은 범위에서 사용하기위한 배아의 초기 단계에서 얼룩말 핀치 (Taeniopygia의 guttata) 배아를 획득하는 것입니다. 얼룩말 핀치 주된 송 버드 모델 생물이되었으며 독성 1, 2, 문제 3, 메모리, 4,5,6, 7,8 비교 신경 해부학을 배우고, 언어 발달 9,10 등 다양한 분야에서 광범위하게 사용되어왔다 . 시퀀스 게놈을 가진 유일한 가수로, 얼룩말 핀치 알려진 조류 11, 12, 13의 50 % 이상을 나타내는 Passeriformes 순서의 분자 유전 연구를 할 수 있습니다. 필드의 다양한 배열의 성인 및 청소년 얼룩말 핀치의 사용에도 불구하고, 몇 가지 연구는 특히 개발 초기 단계에서, 얼룩말 핀치 배아에서 수행되었다. 이것은 그들의 계란의 작은 크기에 기인 할 수있다차 배아, 그리고 닭고기가 (갈 루스 루스 인 domesticus) 이전에 지배적 인 모델 시스템 17,18,19,20,21로 사용하는 연구를위한 모델 생물의 14,15,16 그들의 새로운 상태. 그러나, 비 보컬 학습자로, 닭 보컬 학습, 보컬 학습, 유전, 동작 및 모터 (10)를 학습에 관련된 대뇌 피질 - 기저핵 회로의 개발의 유전 적 기초를 공부에 적합한 모델 시스템이 아닙니다. 그것은 얼룩말 핀치 배아 훨씬 더 섬세하고 더 쉽게 손상 해부 및 분자 과정에서 병아리 배아보다하는 것이 중요합니다. 얼룩말 핀치 배아 permeabilization 단계를 수행 할 때 특히 더주의가 필요합니다. 병아리 배아를 해치지 않을 것이다 강한 세제​​ 효소는 얼룩말 핀치 배아를 손상시킬 수 있습니다. 일반 배려의 측면에서, 그것은 인큐베이터에 배치하기 전에 작은 컵에 얼룩말 핀치 달걀을 넣어하는 것이 필요하다회전 할 때 배양 중에 파손되는 것을 방지하기 위해. 얼룩말 핀치 쉽고 다산 포로 연중 번식, 행동 연구에 순종하고, 보컬 학습자입니다. 이러한 특성은 얼룩말 핀치의 사용은 발전, 유전학 및 언어의 행동 양상을 통합 모델 생물을위한 필요성을 해결하는 것을 허용한다. 얼룩말 핀치 (22)에 특정 최근에 개발 준비 가이드와 함께 아래에 자세히 해부 방법은, 얼룩말 핀치 점점 유용 표준화 된 개발 모델 생물합니다. 그러나, 초기 단계에서 배아를 획득하는 것은 어려운하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구자가 쉽게 초기 단계의 배아를 얻을 수 있습니다. 얼룩말 핀치의 복잡한 행동, 또는 다른 작은 개발에 독성 영향의 초기 개발 및 분자 개발 기초 조사 연구, 연작 조류이 절개 방법이 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>닭 알 인큐베이터</td><td></td><td></td><td>우리는 Picture Window Hova-Bator 인큐베이터, 순환 공기 모델을 사용합니다&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>세포 증식 감지.&nbsp;</td></tr><tr><td>해부 현미경&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>우리는 Nanoject II 인젝터</td><td>Drummond</td><td>3-00-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II microinjector</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋 #55</td><td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml 팔콘 튜브(폴리프로필렌)</td><td>Fisher에 Olympus SZ61 7'' Drummond 모세관을 사용합니다. 사이언티픽</td><td>06-443-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Lysis Matrix H tubes</td><td>MP biomedicals</td><td>6917-100</td><td>RNA 추출에 사용되며, 배아를 균질화하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>광섬유 조명기 램프 (고강도 조명기)</td><td>Dolan-Jenner Industries&nbsp;</td><td>파이버-라이트 MI-150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>스크류 캡이 있는 유리병(DEPC 처리)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338A</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 에페 튜브(1.5ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8410</td><td></td></tr><tr><td>모델링 클레이</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Narshige PB-7 니들 풀러</td><td>Narshige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omni Bead RNA 추출에 사용되는 Ruptor Homogenizer</td><td>OMNI International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드(4% PFA): 20ml 8% PFA(32g 파라포름알데히드, 350ml sdd H2O, pH 7.6, 400ml sdd H2O), 20ml 2x PBS</td><td>배아 고정으로 조정. 주의, 유해하므로 흡입하지 마십시오.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(1x PBS): 200ml 10x PBS, 1,800ml Barnstead H2O, pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td>로 조정</tr><tr><td>인산염 완충 식염수(10x PBS): 800ml Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 이염기성, 200 ml Barnstead H2O, pH 6.5</td><td></td><td></td><td></td>로 조정</tr><tr><td>0.1% Tween-20(1x PTw)으로 인산염 완충 식염수: 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, pH를 7.4로 조정, 2 ml Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 ml 플라스틱 페트리 접시&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 랩</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Prepease RNA Spin Kit</td><td>PrepEase, Affymetrix</td><td>78766 1 KT</td><td>RNA 추출에 사용되며, 배아를 균질화하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 반응 믹스: 875 &mu; l 1xPBS, 100 mM 20 & l CuSO4 (키트 구성 요소 E), 5 &mu; l Alexa Fluor 488 azide (키트 구성 요소 B), 100 &mu; l 묽게 된 반응 완충액 추가 물질 (장비 성분 F)</td> <td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>세포 증식 탐지.&nbsp;</td></tr><tr><td>sdd H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>씨드 컵&nbsp;</td><td></td><td></td><td>우리는 알을 품을 때 용기로 사용합니다.</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 메스&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>표준 둥지 상자</td><td></td><td></td><td>우리는 Abba 플라스틱 핀치 둥지 상자</td></tr><tr><td>4 ml, 테플론 라인 캡, 유리 바이알을</td> 사용합니다. <td>Fisher Scientific</td><td>02-912-352</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫 (폴리에틸렌)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4 x 4 계량 용지</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

개발의 초기 단계에서의 해부와 얼룩말 핀치 태아의 다운 스트림 분석

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

얼룩말 핀치 (Taeniopygia의 guttata)는 독성 1, 2, 문제 3, 메모리를 포함하고 4,5,6 학습 연구의 많은 분야에서 점점 더 중요한 모델 생물이되고있다. 시퀀스 게놈을 가진 유일한 가수로, 얼룩말 핀치 발달 연구에 사용하기 위해 큰 잠재력을 가지고; 그러나, 얼룩말 핀치 개발의 초기 단계는 잘 연구되지 ​​않았습니다. 얼룩말 핀치 개발에 연구의 부족은 작은 계란과 배아를 해부의 어려움에 기인 할 수있다. 다음 해부 방법은 배아 발달의 모든 단계에서 형태와 유전자 발현의 조사를 허용 배아 조직의 손상을 최소화 할 수 있습니다. 이것은 시야를 모두 허용하고 배아의 형광 품질의 영상은, 같은 현장 하이브리드 (ISH), 세포 증식 분석, 이러한 양적 정말이에요 정량적 분석을위한 RNA 추출에서와 같이 분자 절차에 사용L 타임 PCR (qtRT-PCR)를.이 기술은 연구자가 접근하기 이전에 어려웠다 개발의 초기 단계를 연구 할 수 있습니다.

난황 막 (A)에 부착 노른자 (B)에서 배아를 분리하는 적절한 방법을 설명하면서 그림 1에 도시 된 단계는 배아의 모양을 나타냅니다. 태아는 난황 막에 비해 훨씬 가볍고 접합의 영역을 식별 할 수 있습니다. 노른자는 버려야 될 때까지 배아 자체는 구별하기 어려운 경우가 많습니다. 배아는 난자에서 해부되면, 고정 할 수 있습니다 또는 플래시는 나중에 사용하기 위해 냉동. 현장 하이브리드의가 해부 배아에 계획되어있는 경우,이 접합의 영역을 통해 태아에 부착 난황 막 제거 할 필요가있다.이 막은 (C) 제거되면 2 배의 향상된 가시성을 보여줍니다 그림, 그리고 난황 막 (A, B)를 벗겨하는 적절한 방법. 해부 및 고정 후, 전체 현장 하이브리드에 탑재 그림 3 (A, A &#39;, B, B에서와 같이 실시 하였다&#39;) 및 그림 4 (A, A&#39;, B, B &#39;)와 그림 5 (A, B, C) ​​orthodenticle의 호 메오 박스 (homeobox) 2 발달 메틸 수은의 낮은 복용량에 노출 된 배아 (의 Otx2) 발현의 차이를 감지하기 위해. 5는 그림 센스 조사 결과, 배경의 시연 부족. 제어 배아는 6 22 (A, 무대 위해 개발하는 동안 그림 4, 같은 시점에서 알 해부에도 불구하고, 발달 메틸 수은 (메틸 수은)에 노출 된 태아는 5 단계 22 (B, B &#39;)으로 진행 &#39;). 해부 그림 4와 같이 배아의 그룹은 둥지에서 수집하고 같은 시간에 인큐베이터에서 촬영했다. 일부 천연 변이는 개발에 존재하더라도, 이전의 해부 된 데이터에 근거하여, 인큐베이터에서 온도 변동은 2.4 ppm으로 메틸 배아가 develo의 원인이 될 것 같지는 않다pmentally 지연. 단계에서의 차이는 발달 메틸 수은에 노출 된 배아에서 세포 증식의 변화를 나타냅니다. 해부하기 전에, EDU는 하루 2 알에 주입하고 밤새 배양시켰다. 스테이지 (16) (22) 태아의 해부 및 고정 후, EDU는 그림 6 (A, B, C)에서와 같이 증식하는 세포의 검출을 허용, 화학을 &quot;클릭&quot;을 사용하여 시각화 하였다. 그것은 개발 진행을 방해 할 수 메틸 수은에 노출로, 인큐베이터 및 해부하는 동안 계란을 배치하거나 EDU 분석을 수행 할 때주의 깊게 시점을 모니터링하는 것이 중요합니다. 초기 주입 단계 1.3에 지정된 컬렉션의 날이었다 0 일에 실시 하였다. 이 배아는 약 38 시간 후 (7 단 22) 해부했다. 생존율만큼 분사량 478 NL 하에서되면서 약 90 % (대조군의 배아와 같은 비율)로 밝혀졌다. 22 배아를 해부 한 후, RNA 추출은 그림 7에서 볼 수있는 것처럼, 더 최적화가 필요로 제조 업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. 난황 막의 제거는 RNA 추출 및 저장 QRT-PCR의 응용 프로그램에 대한 필요했다. 참고 : 전방 및 후방 지역은 각각 이미지의 상단과 하단에 있도록 모든 배아 수치가 지향하고 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> 그림 1. 얼룩말 핀치 배아를 찾기 및 해부 절차는 1-10 22 스테이지. 희미한 흰색 디스크 (A) 알 수있을 때까지 부드럽게 노른자를 압연하여 배아를 찾습니다. 일단배아는 노른자의 중심에 위치하고 있으며, 노른자는 첫 번째 컷 (1) 이후의 인하 (2) 인 접합 (ZJ)의 영역을 국경 난황 막 압력을 완화 단계적으로 (B)의 해부 난황 막에 부착. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> 난황 막과 배아 구조의 가시성의 그림 2. 제거. 4 % PFA를 포함하는 페트리 접시에 노른자에서 배아의 제거, 장소 배아 다음과 같습니다. 동일계 하이브리드 화를 수행 할 필요가있는 경우, 배아 구조의 시인성이 필수적이며 난황 막 (A)를 제거함으로써 달성 될 수있다. 그립 여분의 벌금 난황 막 집게를 밀고하고 필요한 경우 부드럽게, 바깥 쪽 가장자리에 직접적으로 배아를 처리하여 멀리 배아를 벗겨(B). 난황 막 제거는 배아 구조의 선명도를 증가하고, 배아는 현장 하이브리드 (C)에 몇 군데 나 처리 할 수 있습니다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> 그림 3. 전체 마운트 현장 하이브리드에이 발달 orthodenticle의 호 메오 박스 (homeobox) 2 (의 Otx2)의 메틸 수은. 발현 패턴에 노출 얼룩말 핀치 배아에서 수행은 0.0 ppm으로 메틸 수은 (A, A &#39;)와 2.4 ppm으로 메틸 수은 (B, B에 노출 된 배아를 특징으로했다 &#39;) 부모의 다이어트를 통해. 할 일rsal (A)과의 Otx2의 복측 (A &#39;) 표현은 치료 그룹의 배아가 동일한 시점에서 해부 하였다. 스테이지 (12) (22) 중에 중뇌 및 광섬유 소체 전체에 표시되지만 발달 (B) 등쪽에서 본 지연된 무대 11 22 약어의 특징 인 헤드 구조의 복부 (B &#39;)보기 :. MB, 중뇌; 영업 이익, 눈 소포. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> 그림 4. 전체 마운트 &#160; 원래의 장소에 &#160; 하이브리드가 발달 orthodenticle의 호 메오 박스 (homeobox) 2 (의 Otx2)의 메틸 수은. 발현 패턴에 노출 얼룩말 핀치 배아에서 수행은 6 단계 22 엠브리 특징으로했다<html> OS는 0.0 ppm으로 메틸 수은 (A, A &#39;)와 단계 2.4 ppm으로 메틸 수은 (B, B에 노출 5 22 배아&#39;부모의 다이어트를 통해)에 노출. 약어 : 오전, 중배엽의 전연; 아니, 척색, 척색 중배엽; PO, proamnion, 전방 blastopore; PS, 원시 행진 22. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> 그림 5. 전체가 현장에서 마운트 &#160; 하이브리드가 감지 프로브를 사용하여 얼룩말 핀치 배아에서 수행. (A) 5 단계 22 배아. (B) 초기 단계 6 22 배. (C) 단계 11에서 22 배. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 6 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; 그림 6. 에듀 설립 얼룩말 핀치 배아 드 tection. 에듀 화학이 스테이지 (16) 22 배아 (A, B, C)에서 증식하는 세포를 감지하는 데 사용했다 &quot;클릭&quot;. EDU는 티미 딘 (26, 27)의 위치에 DNA에 통합되고, 클릭 화학 (27)를 사용하여 감지됩니다. 대량 살상 무기 확산은 somites의 측면 모서리 및 tailbud에서 명확하게 볼 수 있습니다. 패널 A는 태아의 후방에 독점적으로 발생 확산을 보여주고 개별 증식 세포를 보여줍니다. 패널 B는 전체 배아의 증식 위치를 보여줍니다. 패널 C는 전방 지역을 보여주고, 더 자세히에서 높은 증식 telencephalon (TE)를 보여줍니다. 요약 : AF, 양수 배; FLB, 앞다리 봉오리; HLB, 뒷다리 봉오리; 르, 렌즈 소포; MS, 중뇌; MT, metencephalon; OPC, 눈 컵; PA, 인두 아치; SM, 체절 중배엽; 결핵, tailbud; 테, telencephalon. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> 해부 얼룩말 핀치 배아. 제어 (0.0 ppm)를 1.2 ppm으로 메틸 수은의 배아에서 추출한 RNA의 그림 7. 품질은 해부 단계 3.8의 설명에 따라 플래시가 동결되었다. 각 레인은 각 치료 그룹에서 두 균질화 된 배아에서 추출한 RNA를 보여줍니다.

얼룩말 핀치새(Taeniopygiaguttata)는 가치 있는 모델 유기체입니다. 그러나 얼룩말 핀치새의 발달 초기 단계는 광범위하게 연구되지 않았습니다. 이 프로토콜은 발달 및 분자 응용을 위해 초기 배아를 해부하는 방법을 설명합니다.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

이 절차의 전반적인 목표는 이후의 발달 및 분자 생물학적 응용을 위해 매우 초기 배아 단계의 온전한 금화조 배아를 분리해내는 것입니다. 이를 위해 먼저 알껍데기를 세로 방향으로 절단하고 알 내부 물질을 WHE 페이퍼 위로 조심스럽게 쏟아냅니다. 그다음, 접합 구역(zone of junction)을 찾아 주변의 난황을 잘라내어 배아를 온전하게 남깁니다.그 후 배아를 페트리 접시에 옮기고 세척한 다음, 추후 분석을 위해 고정하거나 급속 냉동합니다. 마지막으로, 배아 구조의 가시성을 높이기 위해 고정된 배아에서 난막을 제거합니다. 최종적으로 C에서는 두 가지 하이브리드화 및 EDU 처리를 통해 메틸수은 처리에 반응한 금화조 초기 배아 단계의 유전자 발현과 증식 세포를 각각 보여줍니다.이 기술의 주요 장점은 배아 조직의 손상을 최소화한다는 것입니다. 이를 통해 모든 발달 단계에 걸쳐 형태학 및 유전자 발현을 조사할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 독성 물질이 발달 초기 단계에 미치는 영향과 같이, 비교 발생 생물학과 독성학의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.초기 배아 구조는 취약하고 관찰하기 어렵기 때문에, 박리 과정 중 zno 접합부를 찾고 vilin 막을 제거하는 것이 어려울 수 있으므로 이 기술에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 금강조 알을 수집하고 배양한 후, 박리를 위해 다음 재료를 준비하십시오. 깨끗한 메스, 미세 팁 포셉, 초미세 팁 포셉 2개, 전송 피펫 3개, XPBS 및 4% para formaldehyde.배아를 고정할 예정이라면, 해부 현미경 바닥에 10 by 10 cm 크기의 웨이브 페이퍼를 배치하여 해부를 위한 깨끗하고 비흡수성인 표면을 마련하십시오. 제브라 핀치 가이드에 따라 결정된 원하는 시간대에 인큐베이터에서 알을 꺼냅니다. 다음으로, 광섬유 조명 램프를 사용하여 알을 수직축을 따라 잡고 빛을 투과시켜 내부를 비추는 캔들링(candling)을 수행하십시오.광원의 끝부분을 알 뒤쪽에 배치하여 노른자와 발달 중인 배아의 위치를 확인합니다. 그런 다음 노른자 반대편에 메스를 놓고 가벼운 압력을 가해 알의 끝에서 기저부까지 따라 절개합니다. 엄지와 검지로 알의 끝부분 기저부에 조심스럽게 압력을 가하거나, 핀셋을 사용하여 절개선을 따라 껍질을 부드럽게 벌려 알 내부의 내용물을 제거합니다.희미한 흰색 고리 모양으로 보이는 난황의 백색 접합 구역(white zone of junction)을 확인하십시오. 발달 중인 배아를 둘러싸고 있으며, 끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 배아가 중심에 위치하도록 난황의 방향을 조절함으로써 배아를 배외 조직으로부터 분리하십시오. 압력을 낮추기 위해 난황의 가장자리를 찌르고, 배아盘(embryonic disc)을 따라 난황 직경의 길이에 맞게 단일 절개를 수행하십시오.배아가 포함된 난황 부분이 성공적으로 분리될 때까지 대각선으로 절개하는 과정을 계속합니다. 트랜스퍼 피펫을 사용하여 난황의 가장자리를 제거하되, 배아가 이동 중 종이에 의해 찢어지는 것을 방지하기 위해 배아를 윤활할 수 있는 소량의 난황은 남겨 둡니다. 1X PBS가 담긴 트랜스퍼 피펫의 팁을 배아 바닥을 향해 45도 각도로 배치하고, 소량의 1X PBS를 분주하여 배아반을 세척합니다.배아를 작은 플라스틱 페트리 접시에 옮깁니다. 접시에 PBS를 더 추가하고 배아 근처에 PBS를 떨어뜨려 배아를 세척합니다. 접시를 가볍게 흔들어 세척하고 잔류 난황을 제거합니다.그런 다음 디쉬를 기울여 폐버퍼를 흡입합니다. 인 시튜(in situ) 하이브리다이제이션을 위해 배아를 고정하는 경우, 즉시 4% PFA를 추가하여 배아를 잠기게 한 다음, PFA를 배아 위에 직접 떨어뜨려 배아가 말리는 것을 방지하고 평평하게 폅니다. 메탄올 시리즈로 배아를 탈수시킨 후 4°C에서 12시간 동안 배양합니다.배아가 1단계에서 8단계 사이인 경우, 접합대(zone of junction) 너머로 뻗어 나온 막의 가장자리를 초미세 핀셋(extra fine forceps)으로 잡아 배아에 부착된 난황막(vitel membrane)을 제거합니다. 배아를 여러 번 조심스럽게 뒤집어 잔여 난황 과립을 씻어내고 배아 원반(embryonic disc)을 난황막에서 분리합니다. 접합대와 난황막 사이에 틈이 생기지 않으면, 초미세 팁 핀셋(extra fine tipped forceps)을 사용하여 접합대를 살살 긁어 막에서 분리합니다.그다음 밸 막(viel membrane)과 접합 부위의 배아반 주변부를 잡고, 밸 막을 배아로부터 조심스럽게 떼어냅니다. 박리 후 배아를 급속 냉동하는 경우, 페트리 접시에 1X PBS 2~3mL를 빠르게 넣고 페트리 접시를 기울여 배아를 OK 과립으로부터 분리합니다. 액체를 제거하고 세척 과정을 2~3회 반복한 후, 끝이 가는 핀셋을 사용하여 배아를 미리 라벨링된 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 액체 질소에 급속 냉동시킨 뒤 -80°C에서 보관합니다.광섬유 조명 램프, 양초 및 계란을 사용하여 EDU 세포 증식 분석을 수행합니다. 배아 또는 난황의 위치를 찾은 뒤, 미세주입 과정에서 배아가 손상되지 않도록 배아 또는 난황의 반대편 계란 표면에 표시합니다. 그다음, 60 millimeter 플라스틱 접시에 모델링 클레이를 그릇 모양으로 빚어 계란을 원하는 방향으로 고정할 수 있도록 배치합니다.미세주입 바늘을 삽입할 수 있도록 표시된 지점의 방향을 조정합니다. 유리 모세관 바늘 두 개를 뭉툭하게 만든 후, 하나는 난자에 구멍을 뚫는 용도로 사용하고 미네랄 오일로 충전하며, 두 번째 바늘은 용액을 충전하여 미세주입기에 장착합니다. 미세주입기에서 1회 주입당 용량을 59.8 nanoliters로 설정하고, 10 millimolar 스톡 EDU 용액을 미세주입 바늘에 충전합니다. 뭉툭하게 만든 유리 모세관을 사용하여 표시된 지점의 껍질에 조심스럽게 구멍을 뚫되, 껍질이 깨지거나 파편이 난강 내부로 들어가지 않도록 주의합니다.삽입할 미세주입 바늘과 일직선이 되도록 알의 구멍을 45도 각도로 맞춥니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 충전된 바늘을 강내로 약 1cm 정도 삽입하고, 원하는 양의 EDU 용액을 난황이나 배아에 주입합니다. 즉시 여러 겹의 플라스틱 랩으로 알과 점토 홀더를 감싸고, 랩의 가장자리를 접시 바닥에 테이프로 고정하여 배양 중 수분 증발을 방지합니다.플라스틱 랩을 제거하고 텍스트 프로토콜에 따라 배아를 해부하기 전, 원하는 단계에 도달할 때까지 안정을 유지한 표면에서 알을 37 °C로 배양하십시오. 이 그림은 저용량의 메틸 수은에 노출되어 해부 및 고정된 배아에서 ortho identical homeo box의 발현을 검출하기 위해 수행한 NC 두 하이브리다이제이션(hybridization) 결과를 보여줍니다. 머리 구조의 배측 및 복측 뷰에서 볼 수 있듯이, 처리된 배아는 처리되지 않은 배아와 비교했을 때 stage 11에서 발달 지연이 나타났습니다. stage 12의 경우, 왼쪽에 표시된 4개의 배아 그룹은 동일한 시간 동안 배양되었습니다.하지만 왼쪽 상단의 처리하지 않은 배아 두 개는 6단계까지 발달한 반면, 왼쪽 하단의 수은 처리된 배아 두 개는 5단계까지만 발달했습니다. 이 배아들은 배경 염색이 없음을 보여주기 위해 sense probe로 처리되었으며, 여기에 표시된 것은 EDU를 주입한 후 하룻밤 동안 배양한 2일 차 배아의 증식 세포입니다. 클릭 화학법(Click chemistry)을 통해 체절의 외측 가장자리와 꼬리 싹, 그리고 머리 부분에서 세포 증식이 일어남을 확인할 수 있습니다.이 겔은 처리하지 않았거나 1.2 ppm의 메틸 수은을 처리한 해부된 16단계 제브라 핀치 배아에서 추출한 RNA 샘플을 포함하고 있으며, 이는 본 영상에서 시연한 해부 방법을 숙달하면 고품질의 RNA를 추출할 수 있음을 나타냅니다. 적절하게 수행한다면 해부는 1분 이내에 완료될 수 있습니다. 초기 배아는 관찰하기 어려울 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 각도를 조절하여 난황에서 배아의 위치를 찾는 것이 중요합니다.발달 및 독성학 연구에서 추가적인 질문에 답하기 위해 인시투(in situ) 하이브리다이제이션, 세포 증식 분석, 정성 분석을 위한 RNA 추출과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

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이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

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여기서, 우리는 척추 동물 분할의 라이브 연구를 가능하게, 제브라피시 후방 체축의 3-D 조직 배양에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 각성 모델은 축 신장, 형태항원 변형, 세포외 분해능 조직 수준 라이브 이미징에 대한 제어를 제공합니다.

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