Name: 사용 시겔 flexneri 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 배우세요 Shigella flexneri 감염 시 autophagy와 세포 뼈대 상호작용을 연구하는 방법을 Danio rerio 유생을 이용하여. 이 기법은 세포 자율 면역과 세균 제한 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

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SM의 실험실에서 작업은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 연구 경력 개발 원정대 [WT097411MA]에 의해 지원됩니다.

<ol><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li>
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<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li>
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<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li>
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<li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+bacterial+clearance%3A+a+not+so+clear+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autophagy%3A+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li>
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<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Path%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588(2013).</li>
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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

조직 배양 세포를 이용한 시험 관내 및 세포 골격 자식 작용을 모니터링 할 때, 구역 1 및 2에 기재된 프로토콜은 조직 배양 세포 유형의 다양한 적용 할 수있다. 또한, 자식 작용을 따라 (예, ATG8 / LC3가 autophagosomes을했습니다 +)와 세포 골격 (예., 굴지의 꼬리, septin 케이지) 라이브 영상을 사용하여 이질 감염시 실시간으로 역학, 조직 배양 세포가 일시적으로 GFP-를 사용하여 형질 전환 할 수있다, 이전에 같은 RFP- 또는 CFP-태그 구조는 7,8을 설명했다. (. 즉, 시겔 100에서 HeLa 세포 5-30 %에 침입 할 수 있다는 것을 고려 실시간 분석을 위해 일반적으로 바람직 1 MOI) 이질균에 감염된 세포의 백분율을 증가시키는 (OD 직접 시겔 400 μl를 추가하고, 600 = 0.3 -0.6) 2 ㎖의 세포에 MEM (혈청에 굶주린)와 충분한 세균 항목에 대한 최소 1.5 시간 게시물 감염 기다려 phagosome, 복제, AU에서 탈출tophagy 인식과 septin의 caging. 또한, 하나는 어드 AfaE을 표현하고 상피 세포에서 더 높은 침략 능력 M90T 변형 28에 비해 한 시겔 M90T AfaI의 피로를 사용할 수 있습니다. 참고로, M90T AfaI 변형은 아직 제브라 피쉬를 사용하여 생체 내에서 테스트되지 않았습니다. 시겔 식민지의 플레이트 2 ~ 3 일 동안 4 ° C로 유지하고 여러 가지 실험에 사용 할 수 있습니다. 그러나, 시간이 지남에 따라, 또한 콩고 레드를 흡수하고 나타날 수있는 독성 플라스미드를 잃은 시겔의 식민지는 독성 플라스미드를 유지했다합니다. 이러한 이유로 우리는 가능하면 신선한 박테리아 주식을 사용하는 것이 좋습니다. 생체 내에서 감염 세포 생물학을 모니터링 할 때, 프로토콜 부 (3, 4)를 사용 야생형 AB 선 제브라 피쉬에 기재. 시각적으로는 DsRed : GFP 또는 lyz : 시겔 -leukocyte 상호 작용을 모니터링하기 위해 형질 전환 제브라 피쉬 라인은, 예를 들어, 메가 픽셀 사용할 수 있습니다호중구 19,29,30 또는 MPEG1을이지는 : mcherry 식세포 19,31를 시각화 할 수 있습니다. 3.8 절에 설명 된대로 생체 내에서 자식 작용을 시각화하기 위해, GFP-LC3 제브라 피쉬의 유전자 변형 라인 19,24 사용할 수 있습니다. 생체 내에서 자식 작용을 교란하기 위해 효과적인 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드의 투여 량은 성적 접합 또는 단백질의 번역을 억제하는 효율에 기초하여 실험적으로 평가되어야한다. 이는 적정 실험을 수행하고, (스플 라이스 모르 폴리 뉴클레오티드에 대한) RT-PCR에 의해 고갈을 확인하거나 (병진 모르 폴리 뉴클레오티드에 대한) SDS-PAGE (32)에 의해 적당하다. 제브라 피쉬 배아 또는 유충으로부터 분리 RNA는 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출을 이용하여 수행 될 수있다. 제브라 피쉬의 유충 (8-15 유충 / 관)에서 단백질을 추출하려면, 기계적, 0.01 % 옥틸 페놀 산화 에틸렌 condensat 200 μL 용해 버퍼 (1 M 트리스, 5 M의 NaCl, 0.5 M EDTA에서 유를 사용하여 균질화즉, 및 프로테아제 억제제). 15 분 동안 4 ° C에서 19,000 XG에 원심 분리기 튜브와 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 15 분 동안 95 ° C에서 샘플을 Laemmli에 버퍼를 추가하고 가열한다. 해물은 필요할 때까지 -80 ° C에 저장 될 수 있으며, 2.3 절에 설명 된대로 웨스턴 블로 팅에 의해 평가 될 수있다. 제브라 피쉬는 생체 내 약물 응용 프로그램을위한 훌륭한 모델입니다. 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 분석 자식 작용 (예를 들어, 라파 마이신 및 bafilomycin)를 조작하기 위해 설립 약물 보완 할 수 있습니다. 감염되지 않은 및 / 또는 감염 유충은 라파 마이신 (1.5 μM) 또는 bafilomycin (80nm의) E2로 희석하고, 25,33에 설명 된대로 autophagic 플럭스가 웨스턴 블 롯팅에 의해 평가 될 수로 처리 할 수있다. 섹션 3.5에 기재된 바와 같이 감염된 애벌레의 감염 및 생존의 결과에 자식 작용 조작의 결과는 평가 될 수있다. 숙주 세포를 연구 외에생체 외 및 생체 내 프로토콜의 결정은, 예를 들면., 시겔 ΔicsA이 (이질 단백질 ICSA는 N-WASP를 모집하고 Arp2 / 3, 차동 자식 작용에 의해 인식되는 박테리아의 돌연변이 균주를 사용하여 자식 작용 인식에 필요한 세균 결정을 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다 그것의 부재에서, 그것의 휴무에 더 굴지의 꼬리, 아니 septin 케이지)와 ShigellaΔicsB (시겔은 ICSA에 자식 작용 기계의 채용을 방지 세균 이펙터 단백질 IcsB 통해 autophagic 응답을 피할 수있을 수 없다, 굴지의 꼬리와 septin 케이지 형성 더 septin 케이지, 더 많은 자식 작용) 7,8있을 수 있습니다. 시겔은 제브라 피쉬의 자연 병원체하지 않고 37 ℃에서 최적 성장한다. 그러나 작품은 싸이의 탐식 액포 및 복제에서 탈출, 시겔 침공에 요구되는 독성 요인을 보여 주었다tosol 표현 및 28 ° C 19에 제브라 피쉬의 유충에서 기능적 할 수 있습니다. 28 ° C 정상적인 제브라 피쉬의 개발 (23)을 보장하기 위해 제브라 피쉬의 양육 및 표준 온도에 가장 일반적으로 사용되는 온도이다. 놀랍게도 인간에서 세균성 이질로 이어질 주요 병원성 이벤트 (상피 세포 내에서 즉, 대식 세포의 죽음, 침략과 곱셈, 세포 간 확산, 호스트 상피 세포의 염증 파괴) 충실하게 시겔 라 감염의 제브라 피쉬 모델에서 재현 19. 자식 작용 및 세포 골격 재하 유전자 발현과 생물학적 기능의 넓은 범위가된다. 마우스 연구 5 배아 치명적인 필수적인 자식 작용 26 또는 septin 유전자의 넉 아웃을 도시 한, 그리고 이러한 문제는 제브라 피쉬 여러 가지고 있다는 사실에 의해 감소 될 수 있지만 이들 유전자 중 일부는 (지브라 피쉬 개발에 필수적 일 것이라는 가능성paralogous 유전자 33). 그렇다면 morpholinos 아래로 적정 수 (II) 자식 작용 및 세포 골격을 조절하는 (ⅰ) 약리학 적 시약의 사용을 포함하여 이런 문제를 극복하기 위해 여러 가지 대안이있는 유전자의 (ⅲ) 녹아웃는 특정 셀에 대해 설계 될 수있다 유형 및 / 또는 (IV) 동물 개발에 필수적인 없습니다 autophagic 인식에 관여하는 유전자 (예., P62)을 대상으로 할 수 있습니다. 제브라 피쉬는 자식 작용과 이질 감염시의 세포 골격을 조사 할 수있는 이상적인 모델 시스템이지만, 분자 도구는 현재 부족하다. 필드는 새로운 툴과 관심 단백질의 구동 셀 특정 식을 생성 할 필요가있다. 자식 작용 / 세포 골격 유전자의 발현을 녹아웃하기 위해, 새로운 시퀀스 모르가 필요하고, 유전체 공학을위한 신규 한 방법 (예를 들면, TALEN는 CRISPR / Cas9)도 사용될 수있다. 한편, 몇 가지 도구는 이전에 인간 또는 마우스 연구에 대해 생성똑같이 제브라 피쉬를 위해 작동하지 않을 수 있습니다. 세포 내 박테리아 S. flexneri는 면역 체계의 1, 2에 의해 인식되는 박테리아의 기능을 포함하여 생물학의 핵심 문제를 해결하기 위해 뛰어난 모델 생물로 떠오르고있다. 숙주 세포의 S. 운동성을 제한 septins을 채용 flexneri와 자식 작용으로, 대상 셀 자율 면역 7,8의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 관찰은 자식 작용 (autophagy)과 세포질 박테리아를 분해 할 수있는 능력을 연구하기위한 새로운 분자 프레임 워크를 제안한다. 주요 문제는 완전히 기본 분자 세포 사건을 해독하고, 중요한 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 세균 감염 동안 시험 관내 분석 이러한 이벤트를 확인하는 지금이다. 이를 위해, 제브라 피쉬는 S.의 분석을위한 유용한 새로운 호스트로 설정 한 내용 flexneri 감염 19. 박테리아 숙주 세포 사이의 상호 작용은 고해상도 영상화 할 수 있고,제브라 피쉬 모델 생체 내에서 시겔 감염 세포 생물학을 이해하는데 유용한다. 제브라 피쉬 유충 숙주 방어 세균 자식 작용의 역할을 조사하기 위해 사용될 수 있으며, 작업의 자식 작용 섭동 악영향 이질균 감염 19에 응답하여 호스트의 생존에 영향을 미칠 수 있다는 것을 보여 주었다. 관찰은 호스트 방어를 이해하는 근본적인 진보를 제공 할 수있는 제브라 피쉬의 유충을 사용하여 조직 배양 세포와 생체 내에서를 사용하여 시험 관내에서 caging와 자식 작용을 septin, 시겔의 연구에서 생성 된. 또한 감염성 질환을 퇴치 겨냥한 새로운 전략의 개발을 제안 할 수있다. 이 보고서의 주요 목적은 체외에서 분석 분자 및 세포 사건의 의미를 확인하는 것입니다 (즉, 자식 작용, 굴지의 꼬리, caging septin) 엔트의 맥락에서 생체 내에서 세균 감염시를제브라 피쉬의 유충을 사용하여 분노 생물. 제브라 피쉬의 생물학 및 취급 익숙하지 않으면, 하나는 적절한 제브라 피쉬 사육 (23)과 제브라 피쉬 감염 19,35의 생체 분석에 깊이 프로토콜에서 참조 할 수 있습니다.

시겔 flexneri, 그람 음성 침략 장내 유해 세균은 세포질에 phagosomes에서 탈출하고, 세포질 면역 반응을 회피하고 세포 내 및 세포 간 이동 1, 2를 홍보하기 위해 호스트 액틴 세포 골격을 중합 할 수 있습니다. 체외 3,4에서 액틴 기반 운동의 이해에도 불구하고, 생체 내에서 세균의 확산을 제한하는 메커니즘은 완전히 정의되지 않았습니다. 이 선천성 면역 (innate immunity) 및 호스트 방어의보다 완전한 이해에 매우 중요합니다. Septins, 후생 동물 중 단백질의 높은 보존 가족, 헤테로 올리고머 단지에 조립하고 세포막과 세포 골격 5,6와 연관 비극성 필라멘트를 형성하는 단백질을 -binding 구아노 신 삼인산 (GTP)입니다. 최근 연구는 감염된 숙주 세포가 autoph를 목표로 구획화 박테리아에 의해 시겔 액틴을 기반으로 운동을 방지 할 수 있음을 발견했다액틴 기반 운동 7,8 중화 첫번째 세포 메커니즘을 공개 AGY 내부 &#39;septin 케이지&#39;. 조사 활짝 열려 필드는 이제 &#39;septin 생물학 및 감염&#39;에있다. 병원균의 다양한 의해 유도 Septin 조립, (예를 들어, 리스테리아 7,9,10, 마이 코박 테 리움 marinum 7, 8, 칸디다 알비 칸스 11), 호스트 방어 5,12의 핵심 이슈로 등장 할 수있다. 자식 작용, 고도로 보존 된 세포 내 분해 과정 때문에 리소좀 13,14 박테리아 세포질에 전달하는 능력의 자율 면역 세포의 핵심 요소로 간주된다. 그러나, 생체 내에서 세균 자식 작용의 역할은 제한하거나 저조한 15, 16를 이해 남아 세균의 복제를 촉진. 이 광학적으로 액세스 할 수 있기 때문에 제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 감염의 연구를위한 척추 동물 모델로 등장했다애벌레 단계에서 선천성 면역 시스템은 이미 17, 18 작동 할 때. 최근 연구는 S.에 제브라 피쉬 유충의 감수성을 특징으로하고있다 flexneri, 세균 자식 작용 (15)에 대한 패러다임은, 생체 (19)에 항균 치료를위한 자식 작용 (autophagy)의 조작을 연구하는 시겔 -zebrafish 감염 모델을 사용하고있다. 이 보고서는 새로운 도구와 S.을 연구 분석을 제공합니다 자식 작용과 세포 골격과 flexneri의 상호 작용. 제 1 단계에서, 프로토콜은 자식 작용-세포 골격 상호 작용은 인간 상피 세포주 HeLa 세포의 감염 시겔를 사용하여 설명된다 모니터링한다. 체외 이질균 감염 과정에 자식 작용 - 골격 상호 작용의 역할을 평가하기 위해, 방법이 제공된다를 자식 작용 및 (또는 약리학 적 siRNA를 이용하여 시약) 세포 골격 성분을 조작한다. 새로운 작품은 이질균 감염 O를 사용하여 해당을 보여 주었다F 지브라 피쉬 유충은 유사한 분석이 생체 내에서 감염 세포 생물학 연구에 적용될 수있다. 프로토콜 준비하고 제브라 피쉬의 유충이 자세히 설명되어 감염 및 생체 내에서 이질 감염에 대한 호스트 응답을 평가하기 위해, 프로토콜은 호스트의 생존과 감염된 유충의 세균 부담이 제공됩니다 결정합니다. (방법 (고정 또는 생활 제브라 피쉬의 유충을 사용하여) 시겔에 septin와 자식 작용 (autophagy) 마커의 채용을 모니터링 및 방법은 [모르 폴리 노의 (1-4 세포 단계의 배아에 주입) 올리고 뉴클레오티드 또는 약물 시약을 사용하여 생체 내에서 이러한 프로세스의 역할을 테스트 제브라 피쉬 목욕 물에 직접 추가)]에 대해서도 설명합니다. 작업이 프로그램은 세포질 숙주 반응에 의한 감염의 제어에 필요한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것으로 기대된다.

<table><tbody><tr><td>바필로마이신 A1</td><td>시그마-알드리치</td><td>B1793&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>보로실리케이트 유리 마이크로캐필러&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30038</td><td></td></tr><tr><td>거친 수동 조작기&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine tweezers</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forchlorfeneuron&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32974</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG (H+L) 항체</td><td>분자 프로브</td><td>N/A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>염소개미-토끼 IgG (H+L) 항체</td><td>분자 프로브</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>JetPEI 형질주입 시약</td><td>Polyplus 형질주입</td><td>101-01N</td><td></td></tr><tr><td>라트룬쿨린 B</td><td>시그마-알드리치</td><td>L5288</td><td></td></tr><tr><td>LC3 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>MatTek 유리 바닥 접시</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM 플러스 L-알라닐-L-글루타민&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>41090028</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 솔루션</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러 장치&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato,</td> <td>P-87&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항튜불린, 아세틸화 항체&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>노코다졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>N-페닐티오우레아&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>팔로이딘&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 용액</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>로슈</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>p62 / SQSTM1 항체</td><td>Cliniscience</td><td>PM045</td><td></td></tr><tr><td>라파 마이신</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>R8781</td><td></td></tr><tr><td>피루브 산 나트륨</td><td>GIBCO</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Transfection 시약</td><td>Life Technologies</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 하드 세트 마운팅 미디어는 DAPI&nbsp를 포함하고 있습니다.</td><td>벡터 연구소</td><td>H-1500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

시겔 flexneri는 세포질에 도달 phagosomes에서 탈출, 그 운동성 및 보급을 촉진하기 위해 세포 골격을하는 걸 호스트를 중합 할 수있는 세포 내 병원균이다. 새로운 작품은 액틴 기반의 운동에 관여하는 단백질이 또한 자식 작용, 세포 자율 면역에 중요한 세포 내 분해 과정에 연결되어 있음을 보여 주었다. 놀랍게도, 숙주 세포의 S. 액틴 기반 운동성 못할 수도 박테리아 내부의 &#39;septin 케이지&#39;를 구획화와 자식 작용에를 대상으로 flexneri. 이러한 관찰은 septins의보다 완전한 이해, 사상 GTP 결합 단백질의 가족, 자식 작용의 과정에 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다 나타냅니다. 이 보고서는 S.에 의한 자식 작용 - 세포 골격의 상호 작용을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다 flexneri 시험 관내 조직 배양 세포를 사용하여 생체 내에서 지브라 피쉬의 유충을 사용. 이러한 프로토콜은 세포 내 메커니즘 정보의 조사를 가능하게분자 세포 및 전체 유기체 수준에서 세균의 확산을 제어 MS.

시험관, S.에서 조직 배양 세포의 감염시 flexneri는 phagosome를 종료하고 세포질에 침입 할 수 있습니다. 세포질에서, 숙주 세포는 septin 케이지 (그림 1A) 내부에 박테리아를 구획화하여 시겔의 액틴 기반의 운동성을 방지 할 수 있습니다. septin 새장에 갇힌 박테리아는 자식 작용 마커 P62 (그림 1B)와 LC3 (그림 1C)로 표시 할 수 있습니다. 이러한 관찰은 침입 병원균의 확산을 제한 호스트 방어의 새로운 메커니즘을 강조하고, 또한 자식 작용과 세포 골격 사이에 새로운 링크를 알 수있다. 놀랍게도, 자식 작용 마커의 고갈은 크게 박테리아 (그림 2A)의 septin의 caging을 줄이고, 작업도 septin의 caging의 고갈이 크게 자식 작용 마커 8의 채용을 줄일 것으로 나타났습니다. 따라서, 적어도 시겔의 경우, 케이지 어셈블리와 autophagosome 상자 형성을 septin 목록N은 상호 의존적 인 프로세스로 볼 수 있습니다. septin 케이지에 의해 시겔의 구획화에 대한 다른 세포 요구 사항은 액틴의 중합 및 액토 마이 오신 활동 (그림 2B)를 포함한다. 감염의 새로운 동물 모델, 제브라 피쉬 애벌레 19 혜택을 누릴 수있는 자연 마우스 세균성 이질의 모델 및 시겔의 병인, septin 생물학 및 생체 내에서 세균 자식 작용의 조사가 없습니다. 그러한 생체 현미경 (도 3A)에 대한 꼬리 정맥 생존 실험 주사, 꼬리 근육 주사 등 다양한 해부학 적 위치에있는 박테리아를 주입하여 제브라 피쉬 유충을 감염시킬 수있다. 용량, S.에 따라 flexneri 중 하나를 48 시간 게시물 감염에서 해제 할 수 있습니다 제브라 피쉬의 유충에 주입, 또는 진보적 궁극적으로 치명적인 감염 (그림 3B - 3D)가 발생할 수 있습니다. 시겔의 독성 FActors는 28 ° C, 제브라 피쉬의 최적 성장 온도에서 표현되고, 이질균에 의한 감염은 제브라 피쉬의 유형 III 분비 시스템 (T3SS) 19, 인간의 질병에 필수적인 독성 결정에 따라 엄격하게 의존한다. 촬영 함께, 이러한 관찰은 제브라 피쉬의 유충은 시겔 라 감염의 생체 분석을위한 유용한 새 호스트를 나타낸다는 것을 나타냅니다. 제브라 피쉬의 유충의 광학 접근성은 생체 내 (그림 4A)에서 septin의 caging 전에 포유류 호스트 모델을 사용하여 수행 된 적이없는 성취의 시각화를 가능하게한다. septin 케이지가 생체 내에서 자식 작용을 대상으로 박테리아를 포획 증거를 보완하기 위해, 하나는 GFP-LC3를 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬의 유충 감염 시겔 (그림 4B)에 자식 작용 마커 모집을 관찰 할 수 있습니다. 생체 엘에서 시겔 autophagosomes의 ultrastrucutral 분석을 위해ectron 현미경 명확 이중 액포 막 (19)에 의해 세균의 세포질 격리를 표시하는데 사용될 수있다. 자식 작용은 세포 자율 면역의 핵심 구성 요소 및 intracytosolic 박테리아 14-16에 대한 중요한 방어 메커니즘으로 볼 수 있습니다. 생체 내에서 기능 자식 작용을 특성화하기 위해, P62의 모르 폴리 노 - 처리 된 애벌레 지브라 피쉬가 사용될 수있다. 핵심 자식 작용 기계는 달리 [예., 36 자식 작용 관련 단백질 (ATGs) 26], P62은 감염에 일반적으로 이전 개발할 수 있습니다 척추 개발 27 따라서 제브라 피쉬의 유충을위한 필수적인 것은 아니다. 놀랍게도, P62-고갈 유충 S. 접종 크게 증가 사망률 증가 박테리아 부담 19 flexneri 결과입니다. 그 septin 케이지 어셈블리를 보여주는 체외 작업과 일치 autophagosome 형성 7,8와 상호 의존적이며, 시겔에 septin 모집 명확하게 (P62-고갈 유충에 감소 <str옹&gt; 그림 4C). 이 자료는 제브라 피쉬의 생존 세포 내 세균 감염을 제어하는​​ P62 매개 자식 작용 (autophagy)에 의존한다는 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> 체외 septin 케이지 1도. (A) HeLa 세포를 감염되었다 S. flexneri는 4 시간 40 분 동안 고정 SEPT9 및 phalloidin에 대한 항체로 표지하고, 공 초점 축소 복사에 의해 촬상. 스케일 바, 1 μm의. (B) HeLa 세포는 S.에 감염되었다 flexneri는 4 시간 40 분, 고정, P62 및 SEPT2에 대한 항체로 표지하고, 형광 현미경으로 몇 군데. 스케일 바는, 1 μm의. (C) 헬라 세포는 GFP-ATG8 / LC3로 형질 S.에 감염되었다 4 시간 40 분 동안 flexneri, 고정, 형광등 마일에 의해 SEPT2에 대한 항체로 표지 및 영상화croscopy. 스케일 바, 1 μm의. 이 수치는 Mostowy 등 7에서 수정되었습니다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> 시겔 -septin 케이지 형성을위한 그림 2 셀룰러 요구 사항. (A) HeLa 세포가 제어 처리 하였다 (CTRL), P62, ATG5, ATG6 또는 ATG7의 siRNA. siRNA를 처리 한 세포의 전체 세포 용 해물은 siRNA의 고갈 (위)의 효율을 보여 GAPDH, P62, ATG5, ATG6 또는 ATG7 대해 immunoblotted 하였다. siRNA를 처리 한 세포는 S.에 감염되었다 고정 및 정량 현미경 표지, 4 시간 40 분 동안 flexneri. 그래프 (아래)는 처리 당 N ≥3 실험 SEPT2 케이지 내부 시겔의 SEM ± 평균 %를 나타냅니다. (B) 헬라 세포 S.에 감염되었다 FD (CytD) 사이토, DMSO로 처리 lexneri, latrunculin B (LATB), nocodazole (Noco) 또는 blebbistatin (물집)과 4 시간 후 40 분 고정하고 정량적 현미경 표지. 그래프 처리 당 두 개의 독립적 인 실험에서 SEPT2 케이지 내부 시겔의 SEM ± 평균 %를 나타냅니다.이 수치는 Mostowy 등 7에서 수정되었습니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3 이질 감염의 제브라 피쉬 모델입니다. (A) 이미지는 실체 현미경을 이용하여 제브라 피쉬 유충의 방향을 설명합니다. (왼쪽 패널) Zebrafish의 유충 72 시간 게시물 수정은 자신의 몸 윗면은 주사 바늘을 향 분사 플레이트 측면에 위치했다. (중앙 패널) 혈류 감염은 INJ에 의해 수행되었다꼬리 정맥에 박테리아 (빨간색 솔루션) 돌출 한, 비뇨 생식기 입구에 후방. 꼬리 근육 (오른쪽 패널) 감염은 체절을 통해 박테리아 (적색 용액)을 주입하여 수행 하였다. (B) 72 시간 후 수정 애벌레의 생존 곡선을 S.의 다양한 용량으로 주입 flexneri하고 48 시간 게시물 감염 28 ° C에서 배양 하였다. 유효 접종 낮은 (&lt;10 세 CFU 오픈 원), 중 (~ 4 × 10 3 CFU 오픈 삼각형) 또는 높은 (~ 10 4 CFU, 열린 광장)으로 분류 하였다. 접종 클래스 당 N ≥3 실험에서 ± SEM % (가로 막대)를 의미한다. (C) 열거 개별 애벌레에서 균질에 살고있는 박테리아의 여러 번 (LB)에 도금에 의해 측정 된 게시물 감염에 참고 만 유충 열거 분석에 포함 된 감염을 살아나. 도 표시 ± SEM (가로 막대)를 의미한다. (D) GFP- 시겔의 분포에 의해 결정여러 번 낮음, 중간, 높음 용량 접종 (꼬리 정맥 주사)를 이용하여 게시물 감염에서 형광 실체 현미경을 사용하여 라이브 영상. . 전송 이미지 (회색)와 GFP의 형광 (녹색) (B)의 오버레이 - (D)이 수치는 Mostowy 등 19에서 수정되었습니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4 생체 내에서 이질 감염 세포 생물학. (A) Zebrafish의 유충은 24 시간, 고정, GFP SEPT7 (빨간색)과 항체로 표지 (녹색에 대한 GFP- 시겔 (저용량)와 꼬리 근육에 감염된 ) 및 공 초점 현미경에 의해 촬상. 스케일 바, 5 μm의. (B) GFP-LC3 제브라 피쉬의 유충 mCherry- 시겔 (중간 용량)에 대한 감염되었다4 시간 고정, mCherry (빨간색)와 GFP (녹색)에 항체로 표지하고, 공 초점 현미경으로 몇 군데. . 또는 P62 (오른쪽 이미지) morpholinos가 SEPT7에 대한 항체 (표지, 고정, 4 시간 동안 GFP- 시겔 라 (중간 용량)에 감염되었다, 스케일 바, 1.5 μm의 (C)는 Zebrafish의 유충은 어느 컨트롤 (왼쪽 이미지 CTRL)로 처리 빨간색)와 GFP (녹색), 그리고 공 초점 현미경으로 몇 군데. 화살표를 septin 케이지 (CTRL) 여부에 갇힌 시겔의 몇 가지 예를 강조 4 시간 게시물 감염 (P62은 고갈). 스케일 바, 5 μm의. 이 수치는 Mostowy 등 19에서 수정되었습니다.

병원균의 확산을 대응하기 위해 숙주 세포는 박테리아를 구획하고 자식 작용을 유도하는 자신의 세포 골격을 재구성. 조직 배양 세포, 호스트와이 프로세스를 기본 병원체 결정의 사용 이질균 감염 식별 특징으로한다. 시겔 감염 제브라 피쉬 모델을 사용하여, 분자 발견 및 메커니즘의 역할은 생체에 조사된다.

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 치어의 조직 배양 세포를 이용하여 in vitro 및 in vivo 감염 과정 중 박테리아의 확산을 조절하는 세포 내 메커니즘을 조사하는 것입니다. in vitro 방법은 그람 음성 및 장침입성 박테리아 병원체인 Chlamydia trachomatis의 준비로 시작됩니다. 그 후 감염을 유도하고, 감염 중 숙주의 오토파지 기전과 세포 골격을 조작하기 위해 siRNA 또는 약리학적 시약을 사용합니다. Chlamydia에 의해 유발되는 오토파지와 세포 골격의 상호작용을 in vivo에서 연구하기 위해, 두 방법 모두 수정 후 3일 된 제브라피시 배아에 감염을 유도합니다.마지막 단계는 자가포식 및 세포골격 마커를 사용하여 조직을 염색하는 것입니다. 궁극적으로, 이 결과는 세포질 내 숙주 반응에 의한 감염 제어에 필요한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 것입니다. 리스테리아(listeria)와 같은 다른 박테리아보다 젤을 사용하여 박테리아 자가포식을 연구할 때의 장점은, 젤 표적 자가포식이 초기 케이지(incepting cages)에 포획될 수도 있다는 점입니다.이 방법은 오토파지(autophagy) 분야의 핵심 질문, 예를 들어 오토파지에서 세포골격의 역할은 무엇인지, 그리고 세포 내 박테리아의 억제 또는 촉진에 있어 오토파지의 역할은 무엇인지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 바이러스나 미토콘드리아의 오토파지와 같은 다른 오토파지 과정으로 확장될 수 있으며, septin 또는 오토파지 구성 요소와 관련된 인간 질병에 대한 치료적 함의를 가질 수도 있습니다. 이는 제브라피시를 이용한 실증 사례입니다.박테리아를 제브라피쉬에 주입하는 과정은 바늘 준비와 정확한 주입에 시간과 높은 정밀도가 요구되어 숙달하기 어렵기 때문에, 감염 단계가 매우 중요합니다. 제브라피쉬 감염의 현미경 관찰 또한 경험이 필요합니다. 본 프로토콜에서는 냉동 글리세롤 스톡에서 *C. flexneri* M9 DT 야생형 균주를 사용하여 Congo Red triptic soy 플레이트에 박테리아를 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.또한, 다음 날 10% fetal calf serum이 포함된 MEM 배지를 사용하여 6-well plate에 hella 세포를 분주합니다. 그다음 날 개별 콜로니를 선택하여 37 °C에서 진탕 배양하며 TCS 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다. 신선한 TCS로 1:80 희석하여 계대 배양을 준비합니다.600 nm에서 하위 배양물의 흡광도가 0.3에서 0.6 사이일 때, 1000 G에서 5분 동안 원심 분리하여 박테리아를 수집합니다. 그 다음, 박테리아 펠릿을 MEM에 현탁하여 동일한 흡광도로 재구성합니다.먼저, HeLa 세포에 감염 다중도(MOI) 100:1로 직접 감염시킵니다. MEM에 희석한 ChAG를 플레이트에 도말된 HeLa 세포에 첨가하고, 웰당 총 MEM 부피가 2 mL가 되도록 맞춥니다. 그 다음, 숙주 세포에 대한 박테리아의 부착을 최대화하기 위해 플레이트를 700 ×g에서 10분 동안 원심분리하고, 실온에서 30분 동안 배양하여 박테리아가 세포를 감염시킬 수 있도록 합니다. 감염 기간이 종료되면 다음 단계로 진행합니다.세포를 부드럽게 두 번 세척하십시오. 세포 외 박테리아를 추가로 제거하기 위해 신선한 MEM을 사용하며, 경험적 관찰 결과에 따라 Gentamycin이 포함된 완전 배지에서 1~4시간 동안 세포를 배양하십시오. 다음으로, 감염된 세포를 고정하고 라벨링하십시오.63배 또는 100배 대물렌즈를 사용하여 에피 형광 현미경이나 공초점 현미경으로 이미징하면, DAPI로 표지된 cha septin 케이지를 분해할 수 있으며, 이는 세포질 내에서 액틴을 중합시키는 박테리아를 둘러싸고 있는 직경 약 0.6 µm의 고리 모양 구조로 시각화될 수 있습니다. septin 케이지 내부의 박테리아는 P 62, lc three, TG eight와 같은 오토파지 마커로도 식별할 수 있습니다. 개념적으로 이 절차에서 가장 어려운 부분은 in vivo 및 in vitro에서 박테리아 오토파고좀과 septin 케이지를 식별하는 것이며, 여기에는 세심한 현미경 관찰과 분석이 필요합니다.또한, 여러 생물학적 반복 실험에 걸쳐 적절한 수의 이벤트가 분석되고 있는지 확인하고 통계적 유의성을 확보해야 합니다. HeLa 세포에 chila를 감염시킨 후, 우선 박테리아가 세포질로 이동할 수 있도록 최소 2시간 30분 동안 유지합니다. 그다음, 세포골격을 처리하기 위해 약물 처리를 수행할 수 있습니다.음성 대조군으로서 세포가 포함된 배지 2 mL마다 희석된 약물 스톡 1~5 µL를 추가하십시오. 한 세트의 세포를 MEM 내의 DMSO로 처리한 다음, 세포의 자가포식 흐름(autophagic flux)을 조절하기 위해 세포를 30분 동안 배양하십시오. 20 nM rapamycin 또는 160 nM bafimycin을 사용하십시오.그 후 처치 후 4시간에서 12시간 동안 세포를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 고정하고 라벨링합니다. 이 기술은 생체 내(in vivo) 젤 감염과 자가포식 세포골격 상호작용을 모델링합니다. 이전에 설명한 대로 계대 배양을 시작하고 젤을 수집하려면, 박테리아를 1XPBS로 세척하고 1000 G에서 10분 동안 원심분리합니다.그런 다음 박테리아를 80 µL의 0.1% Phenol red 함유 PBS에 재현탁합니다. 이 준비물은 얼음 위에 보관하십시오. 예정된 주입 72시간 전에 나노리터당 약 2000마리의 박테리아가 포함되어 있어야 합니다. 산란된 제브라피쉬로부터 배아를 수집하여 세포 외 오염 물질을 제거합니다.0.003% bleach가 포함된 E two 배지에서 배아를 10분 동안 세척합니다. 10분 후, E two 배지로 교체하여 배아를 다섯 번 세척합니다. 다음으로 10 centimeter 디쉬에 E two 50 milliliters와 최대 50개의 배아를 넣습니다.수정 후 24시간 동안 28°C에서 총 약 100개의 배아를 배양합니다. 현미경 관찰을 방해하는 멜라닌 형성을 방지하기 위해, 발달 중인 배아를 0.003% PTU가 포함된 E2 배지에서 처리합니다. E2 배지에 200 µg/mL tricaine을 첨가한 수조를 사용하여 72시간 된 자어의 마취부터 시작합니다.그 다음 마이크로 매니퓰레이터와 미세 핀셋을 사용하여 마이크로 주입 바늘의 끝을 부러뜨리고, 현미경으로 파손 상태를 확인합니다. 이제 바늘을 준비합니다. 먼저 세균 배양액 한 방울을 현미경 스테이지 위의 커버 슬립으로 옮깁니다. 둘째로, 마이크로 인젝터와 가스 실린더의 전원을 켭니다.셋째, 바늘 끝을 물방울 속으로 내립니다. 넷째, 바늘을 채워 cha 감염 동안의 제브라피쉬 생존율을 평가합니다. 가는 붓을 사용하여 정맥 주사를 신중하게 실시합니다.마취된 유충을 등 쪽이 바늘을 향하도록 주사판 위에 측면으로 배치합니다. 이제 바늘 끝을 생식비뇨기 개구부 근처에 위치시키고 배측 정맥(coddle vein)을 겨냥합니다. 그런 다음 피부를 뚫고 1~5 nL의 박테리아 볼루스를 주입합니다.페놀 레드(phenol red)가 정맥을 따라 퍼지는 것을 확인함으로써 미미정맥(codal vein) 주입이 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있습니다. 기술적으로 미미정맥 주입은 이 절차에서 가장 어려운 부분이며, 이를 위해 제브라피쉬 유생을 이용한 숙련 과정이 필요합니다. 유생의 적절한 고정이 필요하기 때문에 공초점 현미경 관찰 또한 까다로울 수 있습니다.주입 후, 감염된 각 유충을 1 mL의 E2 배지가 들어 있는 24-웰 플레이트의 웰에 개별적으로 옮깁니다. 플레이트를 28 °C에서 배양하며 배아를 매일 관찰합니다. 이는 septin 및 자가포식 마커의 모집을 시각화하기 위함입니다.꼬리 근육과 같은 국소 부위에 Ella를 주입합니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 유충을 주입할 준비를 합니다. 제브라피쉬를 측면으로 향하게 하고 근육 위에 바늘을 배치합니다.그런 다음 두 체절 사이의 공간을 뚫고 약 1 nL의 Ella를 주입합니다. 꼬리 근육에 성공적으로 주입되면 주입된 체절이 붉은색으로 변하는 것을 확인할 수 있습니다. 페놀 레드 완충액의 영향으로, 37 °C의 E2 배지에서 저융점 0.1% agarose를 준비하십시오.글라스 바텀 디쉬에 agarro를 한 방울씩 각각 떨어뜨립니다. 주입된 유충을 최소량의 용액과 함께 agarro 방울로 옮깁니다. 원하는 방향으로 유충을 배치하고 agarro가 굳을 때까지 기다립니다.다음으로, LMA로 디쉬 전체를 덮은 후 trica를 사용하여 E two로 처리합니다. 그 다음 몇 시간 동안 2분마다 Zacks를 취합니다. 감염된 조직 배양 세포에서, shaila는 파고솜(phagosome)에서 세포질로 탈출하며, 이곳에서 숙주의 세포골격이 재배열되어 septin 케이지 형태의 구조 내에 박테리아를 구획화할 수 있습니다.셉틴 케이지(septin cage)에 갇힌 박테리아는 P62 및 LC3와 같은 자가포식 마커에 의해 인식됩니다. 제브라피시는 CHA 감염의 in vivo 연구를 위한 가치 있는 새로운 호스트입니다. 감염 용량에 따라, 제브라피시는 감염 후 48시간 이내에 저용량의 박테리아를 제거하거나, 고용량의 경우에는 감염으로 인해 폐사할 수 있습니다.제브라피쉬 RV의 광학적 투명성 덕분에 septin cage의 in vivo 시각화가 가능해졌으며, 이는 septin cage가 autophagy 대상으로 표적화된 박테리아를 포착한다는 증거를 보완하기 위해 다른 척추동물 모델에서는 수행되지 않았던 성과입니다. GFP lc three 형질전환 제브라피쉬를 감염시켜 lc three 양성 autophagosome이 세포 내 cha로 모집되는 과정을 in vivo 실시간으로 관찰하여 autophagy를 특성화하였습니다. P 62 morpho 처리된 치어에 chala control Morpho를 주입하였으며, 해당 치어들은 정상적인 septin cage 구조를 보였습니다.그러나 P 62 morpho 처리된 유충에서는 chala로의 septin 모집이 감소하였으며, 이는 P 62가 자가포식 메커니즘의 필수 구성 요소임을 나타냅니다. 감염 과정을 숙달하면, 본 절차를 적절히 수행했을 때 PHI 유충 실험은 1~2일 내에 완료될 수 있습니다. CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 게놈 편집과 같은 다른 방법들을 사용하여 제브라피시 게놈을 조작할 수 있습니다. 또한, 새로운 형광 표지 제브라피시 라인을 제작함으로써, 실시간 라이브 이미징을 통해 gel 감염 중 자가포식 세포골격 역학을 관찰할 수 있습니다.Chaga Septin 케이지는 자가포식 세포골격 상호작용을 연구하는 데 사용되어 왔으며, 감염 및 세포 생물학 연구자들이 자가포식에서 세포골격의 새로운 역할을 규명하는 길을 열어주었습니다. Ella를 이용한 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 2등급 실험실 환경에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. CLP - 유도 패혈증의 컨텍스트에서 생체에 autophagy를 평가하는 현재의 프로토콜이 여기에 제시된다 : (GFP) - LC3 마우스를 사용 autophagy에 측정을위한 프로토콜, 및 전자 현미경에 의해 autophagosome 형성을 측정하기위한 프로토콜.

맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도

여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다.<br...

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

여기, 선물이 HeLa 세포 이질균에 감염 하 여 elicited 칼슘 (캘리포니아2 +) 응답을 시각화 하는 프로토콜. 세균 감염의 매개 변수를 최적화 하 고 캘리포니아2 + 형광 프로브 이미징, 비정형 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 감염 활동의 넓은 범위를 통해 박테리아에 의해 유도 된 특징 이다.

상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

본 프로토콜은 시험관 내 상피 세포주를 사용하여 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 조사하기 위한 감염 분석을 설명합니다.

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

배우세요 Shigella flexneri 감염 시 autophagy와 세포 뼈대 상호작용을 연구하는 방법을 Danio rerio 유생을 이용하여. 이 기법은 세포 자율 면역과 세균 제한 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

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