프로테옴 Transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 Microdissections

이 절차의 전반적인 목표는 전사체 및 단백질체 연구를 위해 거미에서 독을 추출하고 독샘을 해부하는 것이며, 이는 먼저 전기 자극으로 독을 수집하는 데 필요한 장비와 시약을 준비하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 마취된 거미를 해부 현미경으로 집게로 고정시키는 것입니다. 다음으로, 거미에게 전류를 주입하고 방출된 독을 마이크로 모세관 튜브로 수집합니다.

마지막 단계는 2-3일 후에 거미의 독샘을 해부하는 것입니다. 궁극적으로, 질량 분석법 또는 독의 기타 단백질체 분석은 구성 독 단백질의 염기서열을 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법의 시각적 시연은 독 수집 단계가 신속하면서도 신중하게 수행되어야 하는 일련의 조정된 행동을 포함하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

시작하려면 전기 자극기 전원 코드를 콘센트에 연결하고 외부 풋 페달을 외부 신호 입력에 연결합니다. 그런 다음 극성 스위치가 정상 모드인지 확인하고 양극을 전기 자극기의 빨간색 출력 단자에 연결하고 음극을 검은색 출력 단자에 연결합니다. 그런 다음 자극기를 다음 권장 초기 설정으로 설정합니다.

앨리게이터 클립을 양극 및 음극 전압계 테스트 리드에 연결하여 전극 출력을 테스트합니다. 그런 다음 자극기 전원 스위치를 켜고 풋 페달로 전류를 전달합니다. 한 갈래를 액체 플라스틱으로 코팅하여 깃털처럼 가벼운 집게를 준비하고 플라스틱이 건조 된 후 코팅이 마를 때까지 4 시간 동안 기다렸다가 AP 반대쪽 갈래 끝 15mm를 면봉 재봉실 한 겹으로 단단히 감싸고 끝을 매듭으로 묶어 실을 고정합니다.

다음으로, 날카로운 가위를 사용하여 거미에게 해를 끼치지 않을 만큼 작지만 막히지 않을 만큼 큰 뭉툭한 피하 주사 바늘 끝을 자릅니다. 사포로 개구부를 매끄럽게 하고 바늘을 진공 폐기물 트랩에 부착합니다. 그런 다음 해부 현미경의 시야 아래에서 자기 베이스에 고정된 비닐로 덮인 두 갈래 클램프를 사용하여 깃털처럼 가벼운 집게를 단단히 닫힌 위치에 수평으로 배치하고 플라스틱 코팅된 단자를 위에는 놓고 나사산 코팅된 단자는 아래쪽에 놓습니다.

다음으로, 실의 상류 하단 단자에 양극 악어 클립을 부착하고 무딘 금속 진공 바늘에 음극 악어 클립을 부착합니다. 그런 다음 실과 악어 클립 사이의 집게 갈래에 양극 리드를 놓고 무딘 진공 바늘에 음극 리드를 놓습니다. 전압계 회로 전류를 테스트하려면 풋 페달을 밟아 충분한 전류가 감지되었는지 확인하고 보호 안경을 착용한 상태에서 리드를 제거하십시오.

독 수집을 위해 여러 개의 마이크로 모세관 튜브를 준비합니다. 다음으로, 페트리 접시에 장착 퍼티 스트립을 놓고 스트립에 마이크로 모세관을 놓습니다. 장갑을 낀 손으로 한쪽 끝에 단일 마이크로 모세관 튜브를 잡고 다른 쪽 끝을 멸균 금속 집게로 분젠 버너 불꽃 위에 놓고 다른 쪽 끝을 고정 위치에 유지하면서 끝을 불꽃에서 당겨 길쭉한 팁을 만들고 다른 쪽 끝을 고정 위치에 잡고 해부 현미경으로 미세 모세관 끝을 검사하고 멸균 된 금속 집게로 당겨진 끝에 작은 비스듬한 구멍을 만듭니다.

튜브를 닫고 얼음 위에 놓습니다. 거미 고정을 시작하려면 CO2 챔버 가스를 켭니다. 그런 다음 밀폐된 플라스틱 수집 바이알에서 긴 금속 집게가 있는 거미를 CO2 챔버로 옮깁니다.

거미를 5분에서 10분 동안 챔버에 보관하고 거미가 더 이상 움직이지 않는지 확인하십시오. 긴 집게로 부드럽게 찔러줍니다. 그런 다음 식염수가 든 전사 피펫을 사용하여 집게의 실을 적십니다.

다음으로, 마취된 거미를 CO2 챔버에서 앞쪽 다리로 집어 꺼냅니다. 둔기로 해부하는 집게와 장갑을 낀 손을 사용하여 마취된 거미를 깃털 무게의 집게 장치로 옮깁니다. 그런 다음 닫힌 깃털 겸자의 갈래를 분리하고 갈래 사이에 거미의 두부 두께를 놓습니다.

거미가 제자리에 단단히 고정되어 있지만 부서지지 않도록 갈래를 닫으십시오. 거미가 실로 코팅된 갈래에 놓이고 자동차의 복부 쪽이 플라스틱 코팅을 향하고 있는지 신속하게 확인하십시오. 다음으로, 거미와 송곳니가 명확하게 보일 때까지 해부 현미경 배율 초점과 광원을 조정합니다. 독 수집을 시작하려면 진공 청소기를 켜고 거미 탄광에 물을 뿌립니다.

두 번째 뭉툭한 주사기 바늘을 사용하여 진공 바늘로 물을 흡입하여 불순물을 제거합니다. 그런 다음 음극이 있는 진공 바늘을 거미의 연단에 대고 풋 페달로 펄스를 전달합니다. 거미의 다리가 수축하고 독이 송곳니에서 나오는 투명한 물방울로 보일 것입니다.

진공 청소기로 청소하고 필요한 경우 역류시킵니다. 그런 다음 마이크로 모세관 팁으로 독 방울을 수집하고 모세관 팁을 물이 담긴 0.5ml 튜브로 옮기면 모세관으로 빨려 들어갑니다. 모세혈관으로 거미에 구멍을 뚫거나 가시의 실크와 접착제로 모세관을 오염시키지 마십시오.

다음으로, 튜브 어댑터가 있는 전사 주사기를 채취 팁 반대쪽 끝에 있는 마이크로 모세관에 부착하고 독 용액을 튜브에 다시 분배한 다음 튜브를 섭씨 영하 80도의 얼음 저장 독이 들어 있는 튜브에 놓습니다. 독 채취가 끝나면 열린 플라스틱 채취 약병과 뚜껑을 거미 가까이에 놓습니다. 빠른 이동을 위해 한 손에는 뭉툭한 해부 겸자로 거미의 다리를 조심스럽게 잡고 다른 손으로는 깃털처럼 가벼운 겸자를 조심스럽게 엽니다.

그런 다음 뭉툭한 집게로 거미를 수집 유리병에 밀어 넣습니다. 그리고 독 채취 후 2-3일 후에 신속하게 캡을 닫고 CO2 챔버에서 거미를 마취한 다음 액체 질소 운반체를 채우고 해부 현미경 옆에 놓습니다. RNA로 절개 부위와 겸자를 청소합니다.

그런 다음 작은 페트리 접시에 식염수 구연산나트륨 1개를 채우고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 다음으로, 거미를 CO2 챔버에서 페트리 접시로 옮기고 집게를 사용하여 복부에서 두부 거미를 빠르게 분리합니다. 그런 다음 집게로 해부 현미경 아래에 두부 격자를 잡고 탄광을 시야에 배치합니다.

두 번째 집게의 날카로운 끝을 사용하여 캐러베이스를 탄광의 측면과 측면으로 연결하는 큐티클을 자릅니다. 두 번째 집게로 탄광을 잡고 독샘이 뽑힐 때까지 앞뒤로 부드럽게 잡아당깁니다. 15분 이상 걸리지 않습니다.

탄광에서 땀샘을 분리하여 극저온 안전 0.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 닫힌 튜브를 액체 질소에 넣고 질량 분석 기술을 독샘 CD NA에서 생성된 염기서열 데이터베이스와 통합합니다. 라이브러리를 통해 독 단백질을 식별할 수 있었습니다. Laro inept 펩타이드는 질량 분석법을 사용하여 블랙 위도우 독에서 확인된 36개 단백질 중 하나였습니다.

블랙 위도우와 같은 거미와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.