프로테옴 Transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 Microdissections

이 실험 절차의 전체적인 목표는 전사체 및 단백질체 연구를 위해 거미로부터 독을 추출하고 독샘을 적출하는 것이며, 이는 먼저 전기 자극을 통해 독을 수집하는 데 필요한 장비와 시약을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 해부 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 거미를 고정하고 마취시키는 것입니다. 다음으로, 거미에 전류 펄스를 가하고 방출된 독을 미세 모세관으로 수집합니다.

마지막 단계는 2~3일 후 거미의 독샘을 적출하는 것입니다. 최종적으로, 질량 분석법이나 기타 단백질체 분석을 통해 독의 구성 단백질 서열을 확인합니다. 독 채취 단계는 신속하면서도 신중하게 수행되어야 하는 일련의 조정된 동작들이 포함되어 있어 학습하기 어려우므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.

먼저 전기 자극기 전원 코드를 콘센트에 연결하고 외부 풋 페달을 외부 신호 입력단에 연결합니다. 다음으로 극성 스위치가 일반 모드(normal mode)인지 확인한 후, 양극 전극을 전기 자극기의 빨간색 출력 단자에 연결하고 음극 전극을 검은색 출력 단자에 연결합니다. 그런 다음 자극기를 다음과 같은 권장 초기 설정값으로 설정합니다.

악어 클립을 전압계의 양극 및 음극 테스트 리드에 연결하여 전극 출력을 테스트하십시오. 그런 다음 자극기 전원 스위치를 켜고 풋 페달을 사용하여 전류를 전달하십시오. 액체 플라스틱으로 한쪽 프롱을 코팅하여 페더웨이트 포셉(featherweight forceps)을 준비하고, 코팅이 마를 때까지 4시간 동안 기다리십시오. 플라스틱이 완전히 마른 후, 반대쪽 AP 프롱 팁의 15 mm 부분을 면 재봉사 한 겹으로 단단히 감싸고 끝을 매듭지어 실을 고정하십시오.

다음으로, 날카로운 가위를 사용하여 뭉툭한 피하 주사 바늘의 끝을 자릅니다. 이때 거미에게 해를 끼치지 않을 만큼 작으면서도, 막힘을 방지할 수 있을 만큼 충분한 크기로 자릅니다. 사포로 개구부를 매끄럽게 다듬은 후, 바늘을 진공 폐기물 트랩에 연결합니다. 그런 다음, 해부 현미경의 시야 아래에서 자기 베이스로 고정된 비닐 코팅 2갈래 클램프를 사용하여 페더웨이트 포셉(featherweight forceps)을 수평으로 꽉 닫힌 상태로 배치하며, 이때 플라스틱 코팅된 갈래가 위로, 실 코팅된 갈래가 아래로 오게 합니다.

다음으로, 실의 상류 쪽에 있는 하단 프롱에 양극 악어 클립을 부착하고, 끝이 뭉툭한 금속 진공 바늘에 음극 악어 클립을 부착하십시오. 그런 다음 실과 악어 클립 사이의 포셉 프롱에 양극 리드를 놓고, 뭉툭한 진공 바늘에 음극 리드를 놓으십시오. 전압계 회로 전류를 테스트하려면, 풋 페달을 눌러 충분한 전류가 검출되는지 확인한 후, 보호 안경을 착용한 상태에서 리드를 제거하십시오.

독 수집을 위한 마이크로 모세관 여러 개를 준비합니다. 다음으로, 페트리 접시에 마운팅 퍼티 스트립을 놓고 그 위에 마이크로 모세관들을 올려놓습니다. 장갑을 낀 손으로 마이크로 모세관의 한쪽 끝을 잡고, 다른 쪽 끝은 멸균된 금속 핀셋으로 잡아 분젠 버너 불꽃 위에 둡니다. 한쪽 끝을 고정한 상태에서 다른 쪽 끝을 불꽃에서 멀리 당겨 길쭉한 팁을 만듭니다. 해부 현미경으로 마이크로 모세관 끝을 관찰하고, 멸균된 금속 핀셋을 사용하여 당겨진 끝부분에 작은 경사 개구부를 만듭니다.

튜브의 뚜껑을 닫고 얼음 위에 놓습니다. 거미의 마취를 시작하려면 CO2 챔버의 가스를 켭니다. 그런 다음 긴 금속 핀셋을 사용하여 닫힌 플라스틱 수집 바이알에서 CO2 챔버로 거미를 옮깁니다.

거미를 챔버 안에 5~10분 동안 두고, 긴 핀셋으로 조심스럽게 자극하여 거미가 더 이상 움직이지 않는지 확인합니다. 그런 다음 전송 피펫을 사용하여 식염수로 핀셋의 실 부분을 적십니다.

다음으로, 마취된 거미의 앞다리를 잡아 CO2 챔버에서 꺼냅니다. 둔탁한 해부용 핀셋과 장갑을 낀 손을 사용하여 마취된 거미를 페더웨이트 핀셋 장치로 옮깁니다. 그런 다음 닫혀 있는 페더웨이트 핀셋의 갈래를 벌려 거미의 두흉부를 갈래 사이에 위치시킵니다.

거미가 으깨지지 않으면서도 단단히 고정되도록 프롱(prong)을 닫습니다. 거미의 갑각 등면이 아래로 향해 실이 코팅된 프롱 위에 놓이고, 배면이 플라스틱 코팅 쪽을 향하며 양극 전극이 하단 프롱에 부착된 상태인지 빠르게 확인합니다. 다음으로, 거미의 독샘과 송곳니가 명확하게 보일 때까지 해부 현미경의 배율, 초점 및 광원을 조절합니다. 독 수집을 시작하려면 진공 장치를 켜고 거미의 독샘에 물을 분사합니다.

두 번째 뭉툭한 팁 시린지 바늘과 진공 바늘을 사용하여 물을 흡입해 불순물을 제거합니다. 다음으로, 음극이 연결된 진공 바늘을 거미의 rostrum에 접촉시킨 후 풋 페달로 펄스를 가합니다. 그러면 거미의 다리가 수축하며, 독액이 투명한 액적 형태로 송곳니에서 나오는 것을 확인할 수 있습니다.

필요한 경우 역류한 액체를 진공 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 마이크로 모세관 팁으로 독방울을 수집하고, 모세관 팁을 물이 들어 있는 0.5 milliliter 튜브에 넣어 물이 모세관 안으로 빨려 들어가게 합니다. 모세관으로 거미를 찌르거나, 거미줄 및 방사돌기(spinnerets)의 접착물로 인해 모세관이 오염되지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 튜브 어댑터가 연결된 전송 주사기를 수집 팁 반대편 끝의 마이크로 모세관에 부착하고, 독액 용액을 튜브에 다시 분주한 후 튜브를 얼음에 배치하며 독액이 포함된 튜브를 -80 °C에서 보관하십시오. 독액 수집이 완료되면, 캡이 닫힌 상태의 개방형 플라스틱 수집 바이알을 거미 가까이에 둡니다. 신속한 이동을 위해, 한 손으로 뭉툭한 해부용 포셉을 사용하여 거미의 다리를 조심스럽게 잡고, 다른 손으로 매우 가벼운 포셉을 조심스럽게 엽니다.

그 다음 뭉툭한 핀셋을 사용하여 거미를 수집 바이알로 옮깁니다. 그리고 빠르게 캡을 닫습니다. 독 추출 2~3일 후, CO2 챔버에서 거미를 마취시킨 다음, 액체 질소 운반 용기를 채워 해부 현미경 옆에 둡니다. 해부 영역과 핀셋을 RNA away로 세척합니다.

그런 다음 작은 페트리 접시에 1x saline sodium citrate를 채우고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 이어서 거미를 CO2 챔버에서 페트리 접시로 옮긴 후, 핀셋을 사용하여 두흉부와 복부를 빠르게 분리합니다. 그다음 해부 현미경 아래에서 핀셋으로 두흉부를 고정하고 colliery가 시야에 들어오도록 위치시킵니다.

두 번째 포셉의 날카로운 끝을 사용하여 carabase와 colliery의 외측면을 연결하는 큐티클을 외측으로 절개합니다. 두 번째 포셉으로 colliery를 잡고, 독샘이 빠져나올 때까지 조심스럽게 앞뒤로 당깁니다. 이 과정은 15분 이내에 완료합니다.

선(gland)을 콜리토리(colliery)에서 분리하여 0.5 milliliter 크라이오 세이프 튜브로 옮깁니다. 닫힌 튜브를 액체 질소에 넣고, 질량 분석 기술을 독선 cDNA 라이브러리로 생성된 서열 데이터베이스와 통합합니다. 이를 통해 독 단백질의 식별이 가능해졌습니다. Laro inept peptide는 질량 분석법을 사용하여 검은과부거미 독에서 확인된 36가지 단백질 중 하나였습니다.

검은과부거미와 같은 거미를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.