Name: 프로테옴 Transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 Microdissections (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 배우세요 거미 독 추출 및 독샘 미세해부 기법을 통해 프로테옴 및 트랜스크립톰 연구를 수행하는 방법을. 전기 자극을 이용한 독 수집과 질량 분석을 활용한 단백질 분석이 포함됩니다.

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나는이 프로토콜의 개발에 그들의 도움을 다음 분들께 감사 : 척 크리스텐슨, 그레타 Binford, 알렉스 K. 랭커스터, 콘라드 Zinsmaier 및 메이스 이마 드를. 질량 분석 및 단백질 체학 데이터는 AZCC에 SWEHSC, NIH / NCI 부여 CA023074에 NIEHS 부여 ES06694 지원 애리조나 단백질 체학 (Proteomics) 컨소시엄과 아리조나 대학의 BIO5 연구소에 의해 인수되었다. 이 작품에 대한 자금 제시카 E. 의복 보조금 1F32GM83661-01과 1R15GM097714-01에서 국립 보건원 (일반 의학의 국립 연구소)에서 제공되었다.

전기 자극 장치의 1. 준비 <ol><li> 콘센트와 외부 신호 입력에 외부 풋 페달을 연결하는 전기 자극기의 전원 코드를 연결합니다. 참고 : 전기 배선이 제대로 절연되어야하며, 노출 된 금속 제공하는 전류가 감동 할 수 없습니다. 보호를 위해 라텍스 또는 니트릴 장갑을 착용 할 것. 전원 코드를 부착하고 와이어를 부착 할 때 전기 자극기의 전원 스위치를 OFF 위치에 있어야합니다. </li><li> 전기 자극기에 붉은 출력 단자에 양극을 연결 (극성 스위치는 정상 모드 인 경우) 및 블랙 출력 단자에 음극을 연결한다. 참고 : 각 전극 와이어 악어 클립에 종료한다. </li><li> 다음 권장 초기 설정으로 설정 자극기 : 전압 = 7 V, 초당 주파수 = 1 펄스, 지연 = 0 밀리 초, 지속 시간 = 200 밀리 초, 트윈 펄스는 오프 = 일반 스위치와 모드 스위치. </li><li> voltme하기 위해 악어 클립을 부착하여 전극의 시험 출력터 긍정적이고 부정적인 테스트 리드. 자극기의 전원 스위치를 켜고 페달과 현재 제공합니다. </li></ol> 움직이지 집게 및 기타 자료 2. 준비 <ol><li> 액체 플라스틱 코팅에 페더급 집게의 한 갈래를 찍어 및 코팅 건조 수 있도록 네 시간 기다립니다. 단단히면 재봉사의 단일 층으로 반대 가닥의 끝의 15mm를 포장하고, 매듭의 끝을 매서 스레드를 고정합니다. 주 : 플라스틱 코팅 전류를 지연하도록 절연을 제공하는 반면 스레드는, 전기 전도성을 촉진인가 식염수를 흡수하기 위해 사용된다. </li><li> 날카로운 가위 무딘 피하 주사 바늘의 끝 부분을 잘라 모래 종이에 구멍을 부드럽게. 튜브를 통해 진공 폐기물 트랩 (예를 들면, 진공 필터 플라스크)에 바늘을 연결합니다. 주 : 바늘 물을 얻어 흡입 역류 및 자극 전극에 의해 생성 된 회로를 완성하는 역할을 할 것이다. 니들 개구부 뮤세인트 막힘없이 진공 솔루션에 아직 충분히 큰 거미를 끼치 지 충분히 작은 수 (예를 들어, 25 G 게이지 X 1 ½, 재료 목록 참조). </li><li> 위치 페더급 집게 수평 상단에 집게의 플라스틱 코팅 단자와보기의 해부 현미경의 현장에서 자기베이스 또는 고정 스탠드 장치에 고정 된 비닐 덮인 두 갈래의 클램프를 사용하여 밀폐 된 위치와 스레드 하단에있는 단자를 코팅. 참고 : 두 갈래 클램프 클램프 홀더에 의한 자기베이스에 고정 된 위치에 유지 (자료 목록 참조). 고무 밴드는 단단히 한 번 소개 된 거미 주변 폐쇄 위치에 페더급 집게를 유지하기 위해 추가 압력을 추가하려면 다음 클램프 홀더, 페더급 집게의 접지 단자 주위에 고정 될 수있다. </li><li> 스레드의 상류 집게 &#39;바닥 단자에 양극 악어 클립을 부착하고 금속 진공 바늘을 둔 부정적인 악어 클립을 연결합니다. </li&gt; <li> 스레드와 악어 클립과 무딘 진공 바늘에 부정적 영향을 배치 사이의 집게 가닥에 긍정적 인 리드를 배치하여 전압계와 전류 시험 회로. 보도 풋 페달은 충분한 전류가 감지 보장하고 충분한 전류가 감지되면 리드를 제거합니다. </li><li> 독 수집에 대한 몇 가지 마이크로 모세관 튜브를 준비합니다. 분젠 버너 불꽃을 통해 수평 집게 개최 끝을 배치, 장갑을 낀 손으로 한쪽 끝에서 멸균 금속 집게로 다른 쪽 끝에서 하나의 마이크로 모세관 튜브를 잡습니다. 고정 된 위치에서 다른 쪽 끝을 잡고, 멀리 연장 팁을 만들 수있는 불꽃에서 금속 집게와 마이크로 캐 필러에 당깁니다. 주 : 마이크로 캐 쉽게 파괴 수있는 보호 안경을 착용하십시오. </li><li> 페트리 접시에 장착 퍼티 스트립에 준비된 마이크로 캐 필러를 휴식. 마이크로 캐 필러는 해부 현미경 종료 검사 및 소독 금속 집게로 뽑아 끝 부분에 작은, 경 사진 구멍을 만드십시오. </li><li> 라멸균 0.5 ml의 튜브 벨 변수 수. 튜브를 멸균 멸균, 탈 이온수를 추가 (예를 들어, 멸균 탈 이온수 5 μL). 닫기 튜브와 얼음에 장소 튜브. </li><li> 비커에 식염수를 준비하고 멸균 물을 두 번째 비커를 입력합니다. </li></ol> 집게에 거미의 3 고정화 <ol><li> CO 2 탱크의 전원을 켜고 폐 플라스틱 수집 병에서 거미를 전송 긴 금속 집게를 사용하여 CO에 2 챔버 (자료 목록 참조). 참고 : 검은 과부 거미 위험한 독을 가지고, 항상이 프로​​토콜 중 장갑을 착용하십시오. </li><li> 5 ~ 10 분 동안이나 때까지 실에서 거미를 유지 마취 부드럽게 긴 집게로 prodded 때 더 이상 이동. 식염수와 집게에 실을 적시 전송 피펫을 사용합니다. 참고 : 검은 과부 CO 2 마취 매개 변수에 대한 지침은 스파 냐 무어 (19)을 참조하십시오. </li><li> CO 2에서 마취 된 거미 검색무딘 해부 집게와 장갑을 낀 손을 사용하여 전방 다리에 의해 그것을 따기에 의해 실. 집게 장치를 페더급하기 위해 마취 거미를 이동합니다. 폐쇄 페더급 집게의 별도의 접지 단자와 접지 단자 사이에 거미의 두흉부를 놓고 단자가 자리에 단단히 유지되고 있지만, 분쇄되지 않는 거미를 보장하기 종료 종료 할 수 있습니다. 양극이 바닥 단자에 연결된 상태를 유지하면서, 거미가 실 코팅 구에 쉬고, (거미 해부학에 대한 안내는 Foelix 20 참조) 아래 갑각의 등쪽면을 배치하고, 등딱지의 복부 측면은 플라스틱 코팅에 직면하고 있는지 확인합니다. 거미를 처리 할 때 신속하게 작업 할 수 있습니다. </li><li> 거미의 chelicerae 때까지 현미경 배율, 초점, 광원을 해부 조정 송곳니 명확하게 볼 수 있습니다. </li></ol> 4. 독 컬렉션 <ol><li> 진공을 켜고 두 번째 끝이 무딘 주사기 N을 사용하여 수용액과 거미 chelicerae 스프레이eedle. 불순물을 제거하기 위해 진공 바늘로 물을 멀리 흡입. </li><li> 거미 연단에 부착 된 음극과 진공 바늘을 터치 풋 페달을 한 번 이상으로 펄스를 제공합니다. 필요한 경우 진공 떨어져 역류. 참고 : 거미 연단은 chelicerae과 endites (자세한 거미 해부학에 대한 Foelix 20 참조) 사이의 등의 표면에 chelicerae 입 후방 내부입니다. 참고 : 각 펄스, 거미의 다리를 계약하고, 독이 송곳니에서 신흥 투명 방울로 볼 수 있습니다. </li><li> 수집 독 (솔루션은 모세 혈관으로 흡수되어 버립니다) 물 또는 완충 용액을 0.5 ml의 튜브에 마이크로 모세관 팁과 전송 모세관 팁 방울. 주 : 체액 오염 및 사망으로 이어질 수 모세관과 거미를 천공하지 마십시오. 또한 방적 돌기에서 실크와 접착제 모세관의 오염을 방지. </li><li> 와 D (최종 수집 팁 반대에) 마이크로 캐 필러에 튜브 어댑터와 함께 전송 주사기를 부착다시 튜브에 ispense 독 솔루션입니다. 얼음에 튜브를 넣어. 참고 : 근처의 날카로운 물건 용기에 폐 모세 혈관 폐기하십시오. </li><li> 거미에 가까운 그것의 모자와 함께 열려 플라스틱 수집 병을 놓습니다. 무딘 해부 집게가 한 손에 개최 조심스럽게 열린 페더급 무딘 집게 신속하게 가까운 캡 유리 병을 수집에 거미를 슬라이딩, 다른 손으로 접지 단자를 집게로 조심스럽게 거미의 다리를 잡고. 완료되면 -80 ° C 냉동고에서 다음 거미 저장 독을 함유 튜브를 계속합니다. 참고 : 다시 유리 병에 집게에서 거미를 이동할 때주의를 기울여야하는 것을 계속한다. 반드시 수집 유리 병 및 캡의 빠른 전송을 위해 거미에 근처에 확인하고 장갑을 착용하십시오. </li></ol> 5. 독 글 랜드 해부 <ol><li> 2 ~ 삼일 독을 수집 한 후, CO 2 챔버 (단계 3.1 참조) 거미를 마취. 해부 현미경 옆에 액체 질소 캐리어와 장소를 입력합니다. 참고 : WHEN은 액체 질소를 사용 눈 보호 및 극저온 장갑을 작동합니다. </li><li> 청소 해부 영역과의 RNase과 DNA 오염을 제거 솔루션을 해부 포셉. 버퍼 (예를 들면, 1X 식염수 구연산 나트륨 (SSC) 버퍼)를 해부하여 해부 현미경 아래에 배치 작은 페트리 접시를 채 웁니다. </li><li> CO 2 챔버에서 전송 거미 petri 접시 빠르게 복부에서 두흉부를 분리하는 집게를 사용합니다. </li><li> 집게로 해부 현미경으로 두흉부를 잡고보기의 필드에 chelicerae를 놓습니다. chelicerae의 측면 측면 등딱지에 합류 표피를 잘라 집게의 두 번째 쌍의 날카로운 끝을 사용합니다. 옆으로 집게의 두 번째 쌍을 사용하여 chelicerae를 잡고 독을 분비 빼낼 때까지 앞뒤로 가볍게 잡아. </li><li> chelicerae에서 별도의 분비 cyrosafe 0.5 ML 튜브 및 전송 (또는 남길 원하는 경우 chelicerae에 첨부). 장소 클액체 질소에 ED 관. 참고 : 각각의 해부는 더 이상 15 분 이상 소요됩니다. </li><li> 완료 될 때까지 추가 거미 해부를 반복합니다. -80 ° C의 냉동고에 액체 질소에서 전열관. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도없이 경쟁 금융 이익을 가지고 있지.

독은 생리 학적 반응 단백질, 펩타이드 및 신약 개발을위한 응용 프로그램과 다른 분자의 중요한 원천뿐만 아니라 셀룰러 및 생태 학적 연구 1-3의 근본적인 측면을 나타냅니다. 그러나, 특히 위험하거나 작은 동물 독의 수집은 어려운 작업이다. 이 프로토콜은 독과 독 분비가 검은 과부 거미에서 수집 할 수있는 방법을 보여줍니다, 그리고 독에서 복제 독의 MuDPIT 분석 및 cDNA를 유래의 단백질 데이터베이스의 조합을 통해이 방식의 성공 (21)을 땀샘을 확인합니다. 이 프로토콜은 검은 과부와 중간 크기 거미, 잘 작동하는 동안 다른 독 수집 기술은 그러나, 피펫 예를 들어, 24.이 후자의 방법 유리에 이빨에서 독을 직접 흡입으로 큰 mygalomorph (거미 같은) 거미를 위해 사용되어왔다 , aggressi되지 않는 작은 크기의 거미를 위해 잘 작동하지 않습니다했습니다. 좀 더 일상적인, 일관성 있고, 빨리이되도록 여기에 설명 된 독 수집 프로토콜 중 하나 특히 중요한 측면은 수집 과정의 준비 및 최적화의 초기 단계입니다. 이 프로토콜은 마스터에 처음 도전이지만, 반복 시험으로, 그것은 쉽고 빠르게된다. 주의 또한 유해 거미 취급, 전류, 미세 점 유리 마이크로 모세관, 및 주사기 바늘의 사용을 포함하는 모든 주요 단계에서 압박된다. 그것은 마이크로 모세 혈관을 형성 할 때 안경뿐만 아니라, 니트릴 장갑, 실험실 코트, 긴 바지 및 폐쇄 신발로 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것이 중요합니다. 독 컬렉션 또 다른 도전 형태는 양 리 수집 될 수있는 어느 하나의 거미, 특히 Latrodectus 종에 의해 생산 독 소량기껏해야 각 당 1-2 마이크로 리터에 mited. 단백질 젤 또는 기능 분석과 같은 다운 스트림 애플리케이션에 충분한 독을 얻는 것은 하나의 튜브에 여러 사람들로부터 독의 조합을 필요로 할 수있다. 이러한 경우, 독은 동일한 성별, 개체 발생 단계의 개체로부터 결합되어야하고, 인구 일부 독액 25, 26, intersexual 발달 지리적 변동의 인식을 부여. 거미는 또한 적은 양의 글 랜드의 최근의 고갈을 반영 할 수있다 개인들 사이에서 생산 된 독의 양에 상당한 차이가 발생할 수 있습니다. 따라서 그들의 마지막 수유 후 독 며칠를 수집하는 것이 바람직 할 수있다. 작은 독가 해제되면, 과도한 전류는 체액 또는 사망과 독의 오염으로 이어지는, 표피가 파열 될 수있는 거미에 적용해서는 안된다. 거미의시와 독 샘플의 오염LK 또는 인간의 소스는 멸균 또는 청소 장비의 사용을 피해야한다. 이러한 문제에도 불구하고, 순수한 독의 수집, 살아있는 거미를 떠나, (다른 세포 단백질에서 독 성분을 분리하지 않음)과 거미를 죽이고 선 균질에서 독을 얻는 방법에 바람직하다. 이것은 샘플이 빠르게 단백질 분해를 방지하기 위해 냉동되도록하는 것도 매우 중요하다. 독 추출하여 독 분비선에서 독 유전자 발현을 자극 후속 독 생산을 촉진한다. 거미 독 고갈 살아 남기 위해이 프로토콜을 허용하기 때문에 따라서, 자신의 글 랜드 해부 할 수있는 몇 가지 일 후에 독 유전자 발현이 같은 성적은 10, 11를 복제 등의 유전 연구를위한 충분한 것으로 예상되는 시점에서 (거미를 죽이는). 몇 가지 중요한주의 사항은 독 글 랜드 해부에주의해야합니다. 중점 실험실 equipm의 사용에 배치해야ENT와 RNA를 분해 RNases의 무료 시약. 따라서이 된 RNase과 DNA 오염을 제거 솔루션과 집게 및 기타 비 일회용 장비와 표면을 닦아하는 것이 좋습니다. 해부는 또한 조직의 RNA의 무결성을 보장하기 위해 가능한 빨리 그리고 직접적 냉동로서 수행되어야한다. 그들의 두흉부 복부 빠르게 분리 한 후 마지막으로 해부 만, 마취 거미 수행하여야한다. 결론적으로,이 문서는 거미의 독과 독 분비를 얻을 수있는 검증 프로토콜을 제공합니다. 독과 독을 분비는 단백질 체학 및 transcriptomic 접근 방식을 사용하여 단백질과 펩타이드 성분의 분리 및 특성에 대한 수 있습니다. 또한, 독 샘플은 그 구성 분자의 생물 의학 및 약학 적 잠재력을 결정하는 기능 분석의 시작 포인트를 나타낼 수있다. 거의 모든 거미가 독을 생산하고 넓은 다이버개별 종에 의해 합성 된 독 성분의 SITY는 독 분자의 광대 한 다양성이 아직 13 발견 할 수 있습니다 제안합니다. 따라서,이 프로토콜은 거미 독에 존재하는 생물학적 활성 분자의 풍부한 원천을 조사하는 도구를 제공합니다.

독은 주로 포식 또는 방어의 목적으로 다른 동물에 주입 동물의 분비물이며, 또한 생물 의학 관련 1-3으로 중요한 생물학적 응용 프로그램을. 특정 동물의 독을 합성하지만 진화 독립적 때문에 생산은 무척추 동물 (예를 들면, 자포 동물, 콘 달팽이, 전갈, 거미)과 척추 동물 (예를 들면, 뱀, 일부 물고기와 포유 동물)에서 분류 학적으로 널리 퍼져 여러 번 1,4 . 독의 생화학 적 특성은 전형적으로 크게 급속 구성 독소 일을 제공하는 주입 동물의 순환계 신경계에 작용하는 단백질 및 펩티드의 매우 다양한 구성된다 보여준다. 악의에 찬 동물의 작은 부분은 인간, synanthropic 분포 5 특히 종을 위협 할 수 있습니다. 독의 구성과 기능 활동의 연구는 중요한 역할을했다척추 동물의 세포 성분 (특히 신경 세포의 이온 채널) 6과 기본적인 세포 프로세스 (예 : neurosecretion)를 7 해명의 기능 특성. 또한, 선택 독 펩타이드는 암과 통증 8,9에 대한 치료로서 그 용도를 포함하여 생물 의학 상황에서 유용한 특성을 가지고 있고, 후보 물질 리드와 해독제 개발을위한 채굴된다. 독은 따라서 이러한 위험 분비물의 컬렉션이 많은 유틸리티가 있습니다, 생태 및 진화 연구 1,4,10,11에서 눈에 띄는 역할을한다. 40,000 설명 거미 (주문 Araneae)의 종과 송곳니 (12)에 종료 독 분비를 쌍으로 가지고 있어요 100 개 이상의 거미 가족 중 하나를 제외하고 모두&gt;가 있습니다. 거미의 높은 종 다양성은 악의에 찬 생물의 가장 큰 분기 군을 대표하는 것이 좋습니다. 그러나, 거미 독의 생화학 적 특성은 L가argely 대부분 인간 envenomation와 연관된 종의 소수 농축시켰다. 거미 독의 최근 프로테오믹스 및 transcriptomic 연구들은 일반적으로 많은 독특한 단백질과 펩타이드 2,13,14를 포함 나타냅니다. 높은 처리량의 cDNA 서열 분석 및 질량 분석 펩티드 핑거 발전 하였을 독 단백질 (15)의 발견을 촉진했다. 그럼에도 불구하고, 이러한 작업은 기술에 대한 충분한 독 및 / 또는 거미의 독을 분비하고, 자세한 설명서의 컬렉션으로 시작 16 몇 가지 있습니다. 이 논문은 비슷한 크기의 거미에 적용 할 수있는 검은 과부 거미의 독과 독을 분비의 수집을위한 프로토콜을 제시한다. 별도로 땀샘에서 독의​​ 컬렉션은 다른 세포 기능을 수행하는 단백질과 반대로 독으로 분비되는 단백질의 식별을 가능하게한다. 검은 부와 다른 Latrodectus 종은 널리 때문에 가끔 넘치도록 땀, 근육의 수축, 고혈압, 호흡 곤란 및 누덕 누덕 기운 마비 5 동반 인간에 심한 통증이 발생 그들의 높은 신경 독성 독,에 가장 위험한 거미들로 인식된다. 여기에 제시된 독 수집 프로토콜은 근육의 수축과 독의 방출을 유도하는 마취 거미에 전류를 전달하기 위해 전기 자극을 사용합니다. 독 방울 신속 마이크로 모세 혈관과 수집 및 냉동 저장을위한 튜브에 분배된다. 프로토콜이 위험한 절차를 관련이 있기 때문에, 그것은 단지 잘 훈련 된 개인에 의해 수행되어야하며주의 주요 단계에 촉구한다. 수집 된 독은 특성화 및 생리 학적 실험 또는 기능 분석 (18)의 구성 분자 (2)의 분리 등의 다양한 용도를 갖고, 독 11 유전자 발현을 자극. 프로토콜 대하여 descr로 결론독 동맥 박리와 독 특정 유전자의 복제에 유용 보존 iption은, 표현하는 다른 거미 10, 11에 독을 고갈 다음 2~3일 발생하는 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>신경 및 근육 자극기 (전기 자극기)&nbsp;</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td></td></tr><tr><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html 볼트미터</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>모든 일반 볼트미터/멀티미터로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>포인티드 페더웨이트 펜치</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td> Ace Hardware <td></td></tr><tr><td>25 G x 1&#189; Precision Glide에서 사용 가능 피하 주사기 바늘</td><td>BD 의료</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>진공 필터 플라스크 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>더 작은 플라스크 크기도 작동할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Buchner 투피스 퍼널, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &#956; l 모세관 보어 (마이크로 모세혈관)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 퍼티 스트립&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand 범용 초장용 집게 길이: 11-13/16 인치.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer, 20x (pH 7.0), 분자 등급</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>은 원료 화학물질(150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)로 제작 가능</td></tr><tr><td>Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tube(cryogenic safe)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, 액체 질소 벤치탑 플라스크</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>울트라 파인 핀셋 (해부 겸자)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>유사한 고품질 파인 포인트 핀셋으로 대체 가능</td></tr><tr><td>풋 스위치/페달</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>비닐로 덮인 슬리브가 있는 두 갈래 확장 클램프, 8.5인치</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>유사한 모델로 대체할 수 있음</td></tr><tr><td>클램프 홀더</td><td>VWR</td><td>89084-746</td><td>유사한 모델로 대체할 수 있으며 확장 클램프 로드의 직경을 수용해야 함</td></tr><tr><td>마그네틱베이스(클램프 홀더를 통해 확장 클램프 유지)</td><td>VWR</td><td>300042-270</td><td>확장 클램프를 고정 위치에 단단히 고정할 수 있는 유사한 장치로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>플라스틱 수집 바이알(대/40드람)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>면 재봉실</td><td>, Joann 직물 및 공예품 상점</td><td>7245855</td><td>유사한 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

프로테옴 transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 microdissections

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

독의 화학적 일반적으로 다양한 생리 활성을 가진 수많은 단백질과 펩타이드를 포함하는 복잡한 분비물이다. 독 단백질의 기능적 특성은 세포의 수용체에 대한 약물 리드 나 프로브의 식별을 포함하여 중요한 생물 의학 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 거미 독이 생물 종 중 가장 풍부한 분기 군이지만, 단지 몇 종의 독액 인해 작은 동물로부터 독 분 수량을 수집과 관련된 어려움에 부분적으로 잘 이해된다. 이 논문은 서양의 검은 과부 (Latrodectus의 개밥 바라기)의 절차를 시연, 전기 자극을 이용하여 거미의 독의 수집을위한 프로토콜을 제시한다. 수집 된 독은 질량 분석을 통해 직접 단백질 식별, 기능 분석 및 transcriptomic 연구 독 유전자 발현의 자극을 포함하여 다양한 다운 스트림 분석에 유용합니다. 이러한 기술은 이소 프로토콜을 통해 장점을 갖는다독의 일환으로 분비되지 않는 세포 단백질에서 정품 독의 구성 요소를 분리하지 않는 전체 글 랜드 균질에서 후반 독. 대표적인 결과는 질량 분석기를 사용하여 수집 된 샘플로부터 공지 독 펩티드의 검출을 보여준다. 독 수집 절차의 결과는이 시퀀스 레벨에서 독 발현 된 단백질 및 펩티드의 특성에 이르게한다는 증명으로, 거미 독 땀샘 해부 용 프로토콜에 따른다.

독과 독 선 해부의 컬렉션은 자주 시퀀스 레벨 10,11,15에 독 단백질과 펩티드의 특성을 수행한다. 수집 된 독은 또한 기능적 활동 (18)를 결정하기 위해 생체 분석에서 사용될 수있다. 독의 수집하여 RT-PCR (10, 11)를 통해 특정 독소 성적 증명서의 복제를 촉진, 독 그랜드 유전자 발현을 자극 할 것이다. 독 단백질의 식별도 독 마개의 cDNA 라이브러리로부터 생성 15,21 서열 데이터베이스와 표준 질량 분석 기술을 통합하여 높은 처리량의 방식으로 달성 될 수있다. 예컨대 직장, 독 및 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 수집 땀샘에서 시작 유효성을 입증 일례가도 1에 도시되어있다. 독 L.에서 수집 개밥 바라기 성인 여성이 용액을 트립신 소화시켰다탠덤 질량 분광법 (MS / MS)을 HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피)를 연결 MuDPIT 분석. 여기 MuDPIT 분석 애리조나 프로테오믹스 컨소시엄 대학에 의해 수행 하였다. (스펙트럼으로부터 유추 딸 이온) 검출 된 펩티드의 질량과 그 분해 단편 이론적 L.로부터 구축 유전자 발현 라이브러리로부터 수득 된 cDNA 서열의 번역으로부터 예측 펩타이드 서열과 비교 하였다 개밥 바라기 독 샘 (21) (글 랜드 해부 프로토콜에 의해 취득한 전술). 이 실험에서, 36 단백질은 99.9 %의 확률 임계치에서, 모든 수집 된 스펙트럼으로부터 검출하고, 적어도 하나의 펩티드를 검출 함유 하였다. 검출 된 단백질의 하나는 단백질 서열 (도 1B)의 35 %를 덮고, 세 배타적 펩티드에 대응하는, 43 총 스펙트럼 (도 1a에 도시 된 일례의 스펙트럼)에 의해지지된다. collecte 수 번역 감지 단백질 (<html> D cDNA를) L.에서 latrodectin하는 최고 BLASTP 히트가 이 실험에서 검출 된 단백질의 아미노산 서열 수준에서 2E-46의 전자 점수 tredecimguttatus (GenBank 등록 P49125.1), 및 주 80 % 동일성. 또한 알파 - latrotoxin 저 분자량 단백질로 알려져 Latrodectin는 블랙 위도우의 인식 독 성분 제시된 프로토콜의 효과를 검증, 22, 23 스파이더이다. 독에서 확인 된 일부 단백질은 BLAST 히트가 발견되는 시퀀스에 해당합니다. 미지의 단백질 독 오염물을 나타내고, 또는 때문에 기인 거미 가능한 제한된 게놈 자원뿐만 아니라 단백질 제한된 기능 정보 등의 결과인지 불분명하다. 그럼에도 불구하고, 유전자 또는 단백질 발현은 진짜 독 구성 요소인지 여부를 공개해야 다른 조직에 비해 독을 분비 이러한 새로운 단백질의 풍요 로움을 조사 분석한다. 항상 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지를 = FO &quot;천만에 <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> 그림 1 : 질량 분석기를 사용하여 블랙 위도우의 독에서 확인 Latrodectin 펩타이드 (A) 대표 스펙트럼 (43 일) L.의 MuDPIT 분석의 MS / MS 부분을 통해 발견했습니다. 개밥 바라기 부분 B. 스펙트럼에 도시 된 수집 된 cDNA 서열의 예측 된 변환에 할당 독이 질량 상단 문자로, (CGEEDFGEEIVK) 부모 펩타이드를 단편화 제조 횡축 검출 딸 이온의 비 (m / z)를 충전하기 위해 도시 일부의 스펙트럼에 딸 이온 질량에 기초하여 상기 펩타이드 서열을 나타낸다. (B) 단백질 서열은, 적색 굵게 도시 할당 및 텍스트를 파트에 도시 된 스펙트럼 추가 빨간색 텍스트 (굵게하지 않음)로부터 대응하는 서열을 강조했다 이 단백질의 다른 펩타이드는 다른 수집 SP 검출 나타냅니다ectra. 단백질 서열은 해부 독 땀샘에서 얻은 cDNA 서열 변환됩니다.

이 기사는 1 위해 전기 자극을 이용하여 거미의 독을 추출하기위한 프로토콜), 프로 테오 믹 특성을 수행 2) 독 선 유전자 발현을 자극, 3) 독의 기능 연구를 수행을 제공합니다. 이는 유전자 발현 연구를위한 독 그랜드 microdissections의 설명이 이어진다.

프로테옴 Transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 Microdissections

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 전사체 및 단백질체 연구를 위해 거미로부터 독을 추출하고 독샘을 적출하는 것이며, 이는 먼저 전기 자극을 통해 독을 수집하는 데 필요한 장비와 시약을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 해부 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 거미를 고정하고 마취시키는 것입니다. 다음으로, 거미에 전류 펄스를 가하고 방출된 독을 미세 모세관으로 수집합니다.마지막 단계는 2~3일 후 거미의 독샘을 적출하는 것입니다. 최종적으로, 질량 분석법이나 기타 단백질체 분석을 통해 독의 구성 단백질 서열을 확인합니다. 독 채취 단계는 신속하면서도 신중하게 수행되어야 하는 일련의 조정된 동작들이 포함되어 있어 학습하기 어려우므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.먼저 전기 자극기 전원 코드를 콘센트에 연결하고 외부 풋 페달을 외부 신호 입력단에 연결합니다. 다음으로 극성 스위치가 일반 모드(normal mode)인지 확인한 후, 양극 전극을 전기 자극기의 빨간색 출력 단자에 연결하고 음극 전극을 검은색 출력 단자에 연결합니다. 그런 다음 자극기를 다음과 같은 권장 초기 설정값으로 설정합니다.악어 클립을 전압계의 양극 및 음극 테스트 리드에 연결하여 전극 출력을 테스트하십시오. 그런 다음 자극기 전원 스위치를 켜고 풋 페달을 사용하여 전류를 전달하십시오. 액체 플라스틱으로 한쪽 프롱을 코팅하여 페더웨이트 포셉(featherweight forceps)을 준비하고, 코팅이 마를 때까지 4시간 동안 기다리십시오. 플라스틱이 완전히 마른 후, 반대쪽 AP 프롱 팁의 15 mm 부분을 면 재봉사 한 겹으로 단단히 감싸고 끝을 매듭지어 실을 고정하십시오.다음으로, 날카로운 가위를 사용하여 뭉툭한 피하 주사 바늘의 끝을 자릅니다. 이때 거미에게 해를 끼치지 않을 만큼 작으면서도, 막힘을 방지할 수 있을 만큼 충분한 크기로 자릅니다. 사포로 개구부를 매끄럽게 다듬은 후, 바늘을 진공 폐기물 트랩에 연결합니다. 그런 다음, 해부 현미경의 시야 아래에서 자기 베이스로 고정된 비닐 코팅 2갈래 클램프를 사용하여 페더웨이트 포셉(featherweight forceps)을 수평으로 꽉 닫힌 상태로 배치하며, 이때 플라스틱 코팅된 갈래가 위로, 실 코팅된 갈래가 아래로 오게 합니다.다음으로, 실의 상류 쪽에 있는 하단 프롱에 양극 악어 클립을 부착하고, 끝이 뭉툭한 금속 진공 바늘에 음극 악어 클립을 부착하십시오. 그런 다음 실과 악어 클립 사이의 포셉 프롱에 양극 리드를 놓고, 뭉툭한 진공 바늘에 음극 리드를 놓으십시오. 전압계 회로 전류를 테스트하려면, 풋 페달을 눌러 충분한 전류가 검출되는지 확인한 후, 보호 안경을 착용한 상태에서 리드를 제거하십시오.독 수집을 위한 마이크로 모세관 여러 개를 준비합니다. 다음으로, 페트리 접시에 마운팅 퍼티 스트립을 놓고 그 위에 마이크로 모세관들을 올려놓습니다. 장갑을 낀 손으로 마이크로 모세관의 한쪽 끝을 잡고, 다른 쪽 끝은 멸균된 금속 핀셋으로 잡아 분젠 버너 불꽃 위에 둡니다. 한쪽 끝을 고정한 상태에서 다른 쪽 끝을 불꽃에서 멀리 당겨 길쭉한 팁을 만듭니다. 해부 현미경으로 마이크로 모세관 끝을 관찰하고, 멸균된 금속 핀셋을 사용하여 당겨진 끝부분에 작은 경사 개구부를 만듭니다.튜브의 뚜껑을 닫고 얼음 위에 놓습니다. 거미의 마취를 시작하려면 CO2 챔버의 가스를 켭니다. 그런 다음 긴 금속 핀셋을 사용하여 닫힌 플라스틱 수집 바이알에서 CO2 챔버로 거미를 옮깁니다.거미를 챔버 안에 5~10분 동안 두고, 긴 핀셋으로 조심스럽게 자극하여 거미가 더 이상 움직이지 않는지 확인합니다. 그런 다음 전송 피펫을 사용하여 식염수로 핀셋의 실 부분을 적십니다.다음으로, 마취된 거미의 앞다리를 잡아 CO2 챔버에서 꺼냅니다. 둔탁한 해부용 핀셋과 장갑을 낀 손을 사용하여 마취된 거미를 페더웨이트 핀셋 장치로 옮깁니다. 그런 다음 닫혀 있는 페더웨이트 핀셋의 갈래를 벌려 거미의 두흉부를 갈래 사이에 위치시킵니다.거미가 으깨지지 않으면서도 단단히 고정되도록 프롱(prong)을 닫습니다. 거미의 갑각 등면이 아래로 향해 실이 코팅된 프롱 위에 놓이고, 배면이 플라스틱 코팅 쪽을 향하며 양극 전극이 하단 프롱에 부착된 상태인지 빠르게 확인합니다. 다음으로, 거미의 독샘과 송곳니가 명확하게 보일 때까지 해부 현미경의 배율, 초점 및 광원을 조절합니다. 독 수집을 시작하려면 진공 장치를 켜고 거미의 독샘에 물을 분사합니다.두 번째 뭉툭한 팁 시린지 바늘과 진공 바늘을 사용하여 물을 흡입해 불순물을 제거합니다. 다음으로, 음극이 연결된 진공 바늘을 거미의 rostrum에 접촉시킨 후 풋 페달로 펄스를 가합니다. 그러면 거미의 다리가 수축하며, 독액이 투명한 액적 형태로 송곳니에서 나오는 것을 확인할 수 있습니다.필요한 경우 역류한 액체를 진공 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 마이크로 모세관 팁으로 독방울을 수집하고, 모세관 팁을 물이 들어 있는 0.5 milliliter 튜브에 넣어 물이 모세관 안으로 빨려 들어가게 합니다. 모세관으로 거미를 찌르거나, 거미줄 및 방사돌기(spinnerets)의 접착물로 인해 모세관이 오염되지 않도록 주의하십시오.다음으로, 튜브 어댑터가 연결된 전송 주사기를 수집 팁 반대편 끝의 마이크로 모세관에 부착하고, 독액 용액을 튜브에 다시 분주한 후 튜브를 얼음에 배치하며 독액이 포함된 튜브를 -80 °C에서 보관하십시오. 독액 수집이 완료되면, 캡이 닫힌 상태의 개방형 플라스틱 수집 바이알을 거미 가까이에 둡니다. 신속한 이동을 위해, 한 손으로 뭉툭한 해부용 포셉을 사용하여 거미의 다리를 조심스럽게 잡고, 다른 손으로 매우 가벼운 포셉을 조심스럽게 엽니다.그 다음 뭉툭한 핀셋을 사용하여 거미를 수집 바이알로 옮깁니다. 그리고 빠르게 캡을 닫습니다. 독 추출 2~3일 후, CO2 챔버에서 거미를 마취시킨 다음, 액체 질소 운반 용기를 채워 해부 현미경 옆에 둡니다. 해부 영역과 핀셋을 RNA away로 세척합니다.그런 다음 작은 페트리 접시에 1x saline sodium citrate를 채우고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 이어서 거미를 CO2 챔버에서 페트리 접시로 옮긴 후, 핀셋을 사용하여 두흉부와 복부를 빠르게 분리합니다. 그다음 해부 현미경 아래에서 핀셋으로 두흉부를 고정하고 colliery가 시야에 들어오도록 위치시킵니다.두 번째 포셉의 날카로운 끝을 사용하여 carabase와 colliery의 외측면을 연결하는 큐티클을 외측으로 절개합니다. 두 번째 포셉으로 colliery를 잡고, 독샘이 빠져나올 때까지 조심스럽게 앞뒤로 당깁니다. 이 과정은 15분 이내에 완료합니다.선(gland)을 콜리토리(colliery)에서 분리하여 0.5 milliliter 크라이오 세이프 튜브로 옮깁니다. 닫힌 튜브를 액체 질소에 넣고, 질량 분석 기술을 독선 cDNA 라이브러리로 생성된 서열 데이터베이스와 통합합니다. 이를 통해 독 단백질의 식별이 가능해졌습니다. Laro inept peptide는 질량 분석법을 사용하여 검은과부거미 독에서 확인된 36가지 단백질 중 하나였습니다.검은과부거미와 같은 거미를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 우리는 여성의 검은 과부 거미의 복부에서 비단 생산 땀샘을 제거하는 효율적인 전략을 설명합니다. 이 절차는 일곱 별개의 비단 생산이 높은 정화 패션, 거미 실크의 생산 및 섬유 조립을 공부 조사를위한 중요한 프로세스의 분비를의 급속한 고립 수 있습니다.

블랙 위도우 스파이더 실크 생산 땀샘의 Microdissection

심사 양적, 높은 처리량의 표현과 소규모 대장균 문화의 융합 단백질의 분석 정화하기위한 프로토콜을 설명하고 이황화 풍부한 동물 독의 표적 단백질의 발현에 적용됩니다.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

비록 Heteroptera suborder에 많은 곤충 (Insecta: Hemiptera)는 악의 찬, 그들의 독 성분 및 그들의 독 독 소의 기능 대부분 알려지지 않은. 이 프로토콜에는 더 특성화를 통해, 성희롱, 동맥 해 부를 사용 하 여에 대 한 heteropteran venoms 수확 하는 방법을 설명 합니다.

독 독 소 암살자 버그와 다른 Heteropteran 곤충에서 수확

여기에서, 우리는 바다 말미잘에서 조독 추출물을 얻고 용혈성 및 포스포리파제 활성을 검출하는 프로토콜을 기술한다.

간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인

여기에서 우리는 브라질 보건 시스템의 수요를 충족시키기 위해 후속 전갈 해독제 생산을 위한 독을 제공하는 것을 목표로 대규모 Tityus serrulatus Lutz and Mello, 1922(브라질 황색 전갈) 사육을 위한 성공적인 유지 관리 및 독 추출 프로토콜을 제시합니다.

해독제 생산을 위한 Tityus serrulatus (브라질 황전갈)의 포로 유지 관리 및 독 추출

여기에서는 폴리에틸렌 필름과 아미노산 용액으로 만든 인공 숙주를 사용하여 Trichogramma dendrollimi 에서 독을 추출하는 프로토콜을 제시합니다.

인공 숙주를 사용하여 기생 말벌 Trichogramma dendrolimi 에서 독 추출

이 비디오에서는, 우리는 폴리 - acrylimide 겔 전기 영동 (PAGE)를 사용하여 단백질의 전기 영동 분리하는 방법을 보여줍니다.

단백질의 전기 영동 분리

전기 분야의 응용 프로그램에 의해 전극의 배열에 - 디지털 Microfluidics는 개별 방울 (ML ~ NL)의 조작에 의해 특징 기법입니다. 그것은 빠른 속도, 순차, 소형 자동 생화학 assays을 수행에 적합합니다. 여기서 우리는 몇 가지 proteomic 처리 단계를 자동화 할 수있는 플랫폼을보고합니다.

자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

곰팡이 종의 proteomic 분석을위한 단백질 추출 proteomic 실험 (MIAPE) 지침에 대한 최소한의 정보에 따라 달성하는 표준화의 높은 수준이 필요합니다. 우리는에서 독소 유도와 단백질 추출하는 동안 실험 바이어스를 최소화하는 절차를 포함하는 비디오 프로토콜을...

에서 독소 유도와 단백질 추출 Fusarium 종.</emProteomic 연구> 문화

이 동영상은 포르말린 고정 파라핀 - - 임베디드 물질로부터 DNA 추출을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이것은 조직 섹션 크실렌과 deparaffinized하는 멀티 일 절차, 에탄올과 rehydrated 이후 유전자의 특정 또는 게놈 차원의 분석을 위해 DNA를 정화하고 분리 proteinase K로 처리됩니다.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

배우세요 거미 독 추출 및 독샘 미세해부 기법을 통해 프로테옴 및 트랜스크립톰 연구를 수행하는 방법을. 전기 자극을 이용한 독 수집과 질량 분석을 활용한 단백질 분석이 포함됩니다.

프로테옴 Transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 Microdissections

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