Name: 신생아 간외 Cholangiocytes의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 학습하세요 신생아 마우스 간외 담관 세포 분리 및 배양 방법을. 콜라겐 겔을 이용한 정밀한 조직 분리 기법으로 담관 발달 및 병리 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 소화 분자 연구 UPENN NIDDK 센터의 분자 병리 및 이미징 코어 및 이미징에 대한 지원은 간 질환 (P30의 DK50306)에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 (RGW에) 건강의 국립 연구소 (R01 DK-092111)에서와 프레드 수잔 Biesecker 소아 간 센터에서 교부금에 의해 및 (SK에) 어린 시절 간 질환 연구 및 교육 네트워크에서 친교에 의해 지원되었다.

달리 명시되지 않는 한 전체 절차는 실온에서 수행된다. 모든 동물의 작업은 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 프로토콜에서 인도적인 조건 하에서 수행되어야한다. 1. 장비의 제조 및 솔루션 <ol><li> 조직 문화 후드와 인큐베이터 (그림 1A)에 근접 마우스 수술 테이블을 설정합니다. 참고 : 필요한 장비는 해부 현미경, 광원, 12.5 cm 긴 직선 홍채 가위, 좋은 팁을 6 인치가 아닌 톱니 모양의 곡선 집게, 4 인치 곡선 팁 (그림 1B)와 톱니 모양의 집게를 포함한다. </li><li> 수술 테이블에 70 % 알코올의 유리 비커에 멸균 악기를 배치합니다. </li><li> 무균 격리 미디어 (표 1)로 3 멸균 60mm 배양 접시를 채우; 수술 테이블에 두 개의 후드 하나, 얼음에 모두 배치합니다. </li><li> 쥐의 꼬리 콜라겐을 놓고,멸균 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), 멸균, 살균 1 N 수산화 나트륨과 조직 문화 후드에서 담도 상피 세포 (BEC) 미디어 (표 1). 참고 : 콜라겐 얼음에 있어야합니다. </li></ol> 2. 담즙 덕트 분리 및 문화 <ol><li> 의식이 IACUC 가이드 라인 (그림 1C) 당 자궁 전위, 다음까지 이산화탄소에 노출, 생활 0-3 일 사이에서 신생아 쥐를 안락사. 참고 : 이전 마우스는 특정 실험의 필요에 따라 사용할 수 있습니다. </li><li> 앙와위에서 동물을 배치하고 골반 지역의 중간 선을 넘어 작은 수평 절개를합니다. U 모양의 플랩을 형성, 옆으로 최대 복부의 양쪽이 절개를 확장 할 수 있습니다. 복부 장기를 노출하는 플랩을 켭니다. 복부가 열리면,주의 깊게 간, 담관의 더 나은 시각화를 위해 동물의 오른쪽으로 복강 밖으로 창자를 이동. 참고 : 간장의 더 나은 식별을 얻기 위해 흉곽에 가로 절개를 확장 할 필요가있다. </li><li> 해부 현미경을 사용하여, 담관, 간, 창자를 식별합니다. 구조는 매우 섬세하고 있으므로주의를 사용하여, 먼저 담관 (그림 1D)를 확인합니다. 톱니 모양이 아닌 톱니 모양의 집게로, 꼼꼼하게 청소하고 담즙을 둘러싼 지방을 포함하는 결합 조직을 선택합니다. 덕트 청소하게 다른를 개최 한 집게를 사용합니다. </li><li> 담낭을 청소하기 위해 비슷한 방법을 사용합니다. </li><li> 얼음에 격리 미디어의 첫 번째 접시에 청소 덕트 및 담낭을 놓습니다. 미디어에 추가로 결합 조직을 제거하고 담낭에서 담즙을 제거하면서 부드럽게 비 톱니 모양의 집게로 구조를 마사지. </li><li> 격리 미디어의 두 번째 접시에 덕트 및 담낭을 전송합니다. </li><li> 5 동물의 덕트 및 담낭의 분리 후, 전송후드에서 세 번째 페트리 접시에 조각. 참고 : 셀이 5 개 이상 동물로부터 분리 될 경우에, 5 동물의 각 그룹에 대한 새로운 해결책을 이용​​하여 일괄 적으로 수행. </li><li> 조직 문화 후드에 두꺼운 콜라겐 젤을 준비합니다 : 참고 : 어떤 크기의 접시 사용할 수 있습니다. 5 신생아의 각 그룹에 대해 3 ㎖ 콜라겐의 최종 볼륨이있는 60mm 문화 요리는 잘 작동합니다. 이는 갓 절연 덕트 매립시 신선한 준비되어야한다. <ol><li> 얼음에 쥐 꼬리 콜라겐, 살균 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS 배), 멸균 dH보다 2 O 및 멸균 1 N NaOH를 놓습니다. </li><li> 콜라겐의 0.023 배의 볼륨 등을 1 N 수산화 나트륨의 양을 사용하여, dH보다 2 0, 10X PBS, 수산화 나트륨, 콜라겐 1X PBS에 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐의 최종 농도와 젤에 필요한의 볼륨을 계산 덧붙였다. 참고 : 콜라겐의 대체 소스를 사용하는 경우, 중화 젤 형성을위한 제조 업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 함께 dH보다 2 0, 1, 혼합0X PBS, 1 N 수산화 나트륨은, 다음도 혼합하기 위해 콜라겐과 피펫을 잘 추가합니다. </li></ol></li><li> 콜라겐 용액을 실온에서 일관성 같은 겔로 두꺼워지면, 곧바로 콜라겐 덕트를 포함. </li><li> 5 % CO 2, 30 분 동안 응고 콜라겐을 활성화하기 위해, 37 ° C에서 인큐베이터에 놓습니다. </li><li> 젤 (흰색 분명에서 색상 변경), BEC 미디어 (표 1) 3.5 mL를 오버레이를 응고 및 37 ° C에서 배양하면, 5 % CO 2. </li><li> BEC 미디어에게 일주일에 3 번을 제거하고 3.5 ml의 신선한 용지로 교체합니다. </li></ol> 두꺼운 콜라겐 젤 3.을 고립 차 Cholangiocytes 주 : 3 주 안에, cholangiocytes (큰 핵이 포함 된 덕트에서 직접 확장과 세포)의 시트 두께의 콜라겐 볼 수 있습니다. 접시에있는 섬유 아세포의 다수가있는 경우, 그것은 폐기되어야한다. 요리의 몇 가지 영역이있는 경우섬유 아세포 성장, 이들은 메스로 잘라 전에 cholangiocytes 분할을 제거 할 수 있습니다. <ol><li> 얇은 콜라겐 젤을 준비합니다 : <ol><li> 무균 PBS로 1 ㎎ / ㎖의 농도로 콜라겐을 희석. 참고 : 100 mm 플레이트 1 ML을 사용; 다른 크기의 요리에 따라 조정합니다. </li><li> 셀 확산기 (큰 접시) 또는 피펫 팁 (작은 접시)로 균등 콜라겐 용액을 퍼지 한 후 10 분 동안 실온에서 떠난다. </li><li> DMEM/F12와 함께 접시를 덮고 37 ° C, 10 분 동안 5 % CO 2에서 배양한다. </li><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 1X PBS로 세척. 즉시 1X PBS를 대기음. </li><li> 플레이트를 회전하거나 진탕 판을 배치하여 확산 콜라겐의 제 2 박막 층과 코트. 37 ° C, 10 분 동안 5 % CO 2에서 배양한다. </li><li> 콜라겐이 응고 된 후, 커버 DMEM/F12 플레이트와 37 ° C, 30 분 동안 5 % CO 2에서 배양한다. </li></ol></li><li> 일에서 세포를 분리ICK 콜라겐 젤 : <ol><li> 그것은 부동되도록 세포 배양 주걱 또는 세포 스크레이퍼로, 플레이트 떨어져 부드럽게 콜라겐 젤을 다 쳤어요. </li><li> DMEM/F12 10 ㎎ / ㎖로 유형 XI 콜라게나 제를 (자료 목록 참조) 희석하여 콜라게나 솔루션을 준비합니다. 잘 살균 필터 섞는다. </li><li> 두꺼운 콜라겐 세포의 60mm 접시 당 콜라게나 솔루션 (위)의 1 ML을 추가합니다. (3 ㎖이어야 함) BEC 미디어를 제거하지 마십시오. 37 ° C에서 30 분 동안 접시를 품어, 5 % CO 2. </li><li> 세포를 포함하는 솔루션을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. </li><li> 5 분 2,200 XG에 스핀 다운. 뜨는을 취소하고 DMEM/F12 비슷한 양의 펠렛을 일시 중지 다시. </li><li> 5 분 2,200 XG에서 다시 솔루션을 스핀. 뜨는을 제거합니다. </li><li> 3 0.5 % 트립신의 ML, 37 ° C, 5 분 동안 5 % CO 2 부화에 재현 탁 펠렛. 배양 후, 솔루션을 피펫 아래 cholangiocytes의 시트를 중단 할 수 있습니다. BEC 미디어의 5 ML을 추가합니다5 분 1,500 XG에 차 스핀 솔루션입니다. </li><li> 다음 5 분 동안 1,500 XG에서 솔루션을 회전, DMEM/F12에 뜨는하고,에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 BEC 미디어 (표 1)에서 펠렛을 일시 중지 다시. 이전에 만든 얇은 콜라겐 젤 접시에 세포. </li></ol></li></ol> 세포의 4. 통로 및 저장 참고 : 필요에 따라 얇은 콜라겐 겔에 세포가 분할 할 수 있습니다. <ol><li> 이전에 10 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 0.25 % 트립신의 배양에 멸균 PBS로 접시를 씻으십시오. </li><li> BEC 매체 동량으로 중화하고, 5 분 동안 1,500 XG에서 펠렛. DMEM/F12와 펠렛을 씻어 후, 5 분 1,500 XG에서 펠렛. </li><li> 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시에 배포 BEC의 미디어를 Resuspend 세포. 주 : 대안 적으로, 세포는 저장 매체에 재현 탁하고 -80 ° C 냉동고 나 액체 질소 (표 1)에 저장 될 수있다. </li></ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+bile+ducts%3A+Essentials+for+the+clinical+hepatologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li>
<li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes%2C+periportal+hepatocytes%2C+and+adult+liver+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li>
<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium%3A+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁의 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 설명하는 것은 신생아를 포함한 모든 연령대의 마우스 마우스의 간외 담관에서 순수한 cholangiocytes을 분리하는 기술이다. 기술 간외 cholangiocytes은 간내 cholangiocytes 별도로 연구 될 수 있다는 장점을 제공하고, 이러한 세포의 집단 사이의 주요 차이점을 확인하는 연구를 용이하게 할 수있다. 우리는 최근하다는 연구가이 방법에 의해 고립 된 붉은 털 로타 바이러스 8에 감염 간외 cholangiocytes에 속눈썹을 감소 발표했다. 단점 기법은 노동 집약적이며, 세심한 박리가 섬유 아세포 오염을 방지하기 위해 필요하다는 것을 포함한다; 또한, 부산물 및 문화에 적어도 3 주 대부분의 실험을위한 충분한 세포를 얻기 위해 필요합니다. 따라서,이 세포는 두 가지 차원의 문화와 관련된 변경 사항을 반영 할 수 있습니다. 그것은 아직 얻어진 세포 집단은 줄기 세포 또는 세포의 유의 한 숫자를 포함하는지 여부를 결정되지 않은peribiliary 땀샘 9,10에서의.</su...

내부 및 간외 cholangiocytes의 기원과 발전은 현저하게 다르다. 간은 복부 foregut의 내배엽 5 게실에서 개발하고 있습니다. 뇌 영역은 간내 담도 나무 5를 생성하는 동안 게실의 꼬리 영역은 간외 담도 트리를 형성한다. 간내 덕트 cholangiocytes는 요정 포털 지역 6 유관 플레이트 주변의 전구 세포에서 파생됩니다. 이러한 세포는 간세포 또는 cholangiocytes 6 하나로 분화 할 수있는 능력이있다. 이 cholangiopathies 특별히 cholangiocytes의 하나의 카테고리를 타겟팅 할 수 있습니다 주어진 중요한 임상 적 의미를 가지고 있습니다. Alagille 증후군은 간내 덕트에 영향을 미치는 예를 들어, 담도 폐쇄증은 처음, 신생아의 간외 덕트에 영향을 미칩니다. 마우스 및 래트에서의 간내 cholangiocytes 및 담관 유닛 절연 다중 디스크립션이있다. 에vestigators 덕트 분리 이후의 부산물에 의해 하나의 세포를 고립, 또는 간 소화 항체에 의해 특정 세포 표면 마커 1-4을 표현 cholangiocytes의 풀다운있다. 기능 및 편광 담관 단위 간 소화 크기 여과 (7)에 의해 고립되었다. 담관 유닛 절연 cholangiocytes 시험관 1,2 ductular 구조를 개발하기 위해 도시되었지만, 자극을 분비하고 분비 유체 7을 설명하기 위해 응답 할 수있다. 이러한 방법의 제한은 소화 효소와 간 관류에 대한 전문 기술 전문 지식과 특별한 장비의 필요성이 (가) 있습니다. 또, 간엽 세포 3 오염의 위험이있다. 구체적 신생아 간외 담관에서 간외 담관 cholangiocytes를 분리 방법은 상술되지 않았다. 이 논문은 신생아를 격리 할 수​​있는 간단한 방법을 설명합니다잘 순도 높은 수준의 성인 간외 담관 세포로의. 이 기술은 내부 및 간외 cholangiocytes과 간외 덕트를 포함 담도 폐쇄증과 같은 질병의 메커니즘에 대한 연구 사이의 차이에 대한 연구를 촉진 할 것이다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml, BEC 매체에 사용</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml,</td></tr><tr><td>비필수 아미노산과 함께 BEC 매체 MEM에</td> 사용 <td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml, BEC 매체에 사용</td></tr> 인<tr><td>슐린-트랜스페린-셀레늄</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml, BEC 매체에 사용</td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, BEC 매체에 사용</td></tr><tr><td>화학적으로 정의된 지질 농축액</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, BEC 매체에 사용</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, BEC 배지 및 500 &#956에 사용; 절연에서</td></tr><tr><td>l Gentamicin</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>15750-060</td><td>0.2 ml, BEC 매체 및 500 &#956에 사용됩니다. 엘 BEC</td></tr> 매체 <tr><td>MEM 비타민 용액</td><td>Gibco / Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml</td></tr><tr>에 사용되는 절연<td>에탄올 아민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0.13 ml</td></tr>, <tr>BEC 매체<td>콩 트립신 억제제</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml에 사용되며 BEC 매체에 사용됩니다. 용매는 PBS, 5 mg/ml 재고 농도</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, BEC 매체에 사용되는</td></tr><tr><td>소 뇌하수체 추출물</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1.1 ml, BEC 매체</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0.5 ml, BEC 매체에 사용, Stock conc 393 &#956; 에탄올로 희석한 g/ml</td></tr><tr><td>3 3',5-triiodo-L-thyronine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0.5 ml, BEC 매체에 사용, 에탄올로 희석한 재고 conc 3.4 mg/ml</td></tr><tr><td>표피 성장 인자</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0.5 ml, BEC 매체에 사용, 25 &#956; DMEM F12+1%BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>5 ml로 묽게 하는 g/ml는, BEC 매체에서 이용되고, 0.411 mg/ml의 재고 농도에 사용하고 DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 ml로 희석하고, BEC 매체와 500 &#956에서 이용됩니다; l 격리에서</td></tr><tr><td>쥐꼬리 콜라겐</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>콜라겐</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>10x에서 사용, sterlie, 콜라겐을 만드는 데 사용되는 콜라겐 농도에 따라 사용 된 양은 콜라겐 농도에 따라 다릅니다</td></tr><tr><td>dH2O</td><td>N</td><td>/ A</td><td>멸균, 콜라겐을 만드는 데 사용되며 사용되는 양은 콜라겐 농도 NaOH에 따라 다릅니다</td></tr>.<tr><td> 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>1 N으로 희석, 멸균, 콜라겐 제조에 사용, 사용되는 양은 콜라겐 농도에 따라 다릅니다</td></tr>. <tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td>의 콜라겐 분해 효소 XI<td>형을 DMEM 및 멸균 필터에 희석하여 사용 전</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (1x) 0.25%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml, 최대 10분</td></tr><tr><td>배양 트립신-EDTA (10x) 0.5%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 ml, 최대 10</td></tr>분 <tr><td>배양 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>기타 모델 허용</td></tr><tr><td>광원(광섬유 조명기)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>기타 모델 허용</td></tr><tr><td>12.5cm 직선 홍채 가위</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>기타 모델 허용</td></tr><tr><td>6" 톱니 없는 곡선 집게 미세한 팁으로</td><td>전자 현미경 과학</td><td></td><td>기타 모델 허용</td></tr><tr><td>미세 팁이있는 4 인치 톱니 모양의 스테인리스 집게</td><td>전자 현미경 과학</td><td></td><td>기타 모델 허용</td></tr></tbody></table>

신생아 간외 cholangiocytes의 분리

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

간 인트라 및 간외 담관이 발달 별개이며, 차동 특정 질환에 의해 영향을받을 수있다. 그러나, 내부 및 간외 cholangiocytes, 신생아와 성인 세포 사이의 차이가 잘 이해되지 않습니다. 간내 담관에서 cholangiocytes의 분리를위한 방법은 잘 1-4 설정됩니다. 이 별개의 cholangiocyte 집단 간의 차이를 이해하고, 간외 덕트를 대상으로 이와 같은 담도 폐쇄증과 같은 질병을 공부에 큰 도움이 될 것이지만, 특히 신생아에서 간외 유관 세포의 분리, 아직 설명되지 않았습니다. 신생아 및 성인 마우스 양쪽 간외 담관 세포를 분리하기 위해 최적화 된 기술은 여기에서 설명한다. 이 기술은 섬유 아세포와 같은 중간 엽 세포에서 최소한의 오염과 순수한 세포 인구를 산출한다. 이 메 톡시D는 철저한 해부와 지방과 섬유 아세포 층을 제거하는 긁기 다음 간외 덕트 및 담낭의 제거를 기반으로합니다. 구조는 실험적인 사용을 위해 다음 트립신 될 수 있으며, 도금 재 단층에 cholangiocytes의 파생물을 할 수 있도록 약 3 주 동안 콜라겐 배양의 두꺼운 층에 포함됩니다.

신생아 마우스 간외 우수한 순도 cholangiocytes, K19의 면역 형광 염색법에 의해 설명되는 것과 같이 (그림 2A와 2B)의 인구의 분리에이 프로토콜의 결과를 사용하는; 우리는 성인 쥐에서 세포를 분리 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다. 우리는 두꺼운 콜라겐 겔에 단일 층을 형성하기 위해 갓 고립 담관의 세포 3 주 정도 관찰했다. cholangiocytes는 절연 도관으로부터 세포 시트를 형성하는 두꺼운 콜라겐에 걸쳐 선형 적으로 성장한다. 문화가 삼주 전에 분할하지 않으면 구멍이 세포의 시트에 나타납니다 이후 단층이, 자란되기 전에 세포를 분리하고 얇은 콜라겐 젤에 다시 도금해야한다. 최적의 세포 성장과 섬유 아세포의 오염을 최소화하기 위해, 해부 및 청소 단계 (2.3, 2.4) 동안 신중하고 꼼꼼하게 섬세한 간외 덕트를 둘러싼 결합 조직을 제거하는 것이 중요합니다. 석면의 성장이있는 경우폭발, 메스 또는 부드러운 흡인 두꺼운 콜라겐의 영향을받는 지역의 제거 이전에 분할 세포에 섬...

신생아 생쥐의 간외 담관에서 cholangiocytes을 분리하는 기술을 설명한다. 덕트 꼼꼼하게 해부 한 다음 세포는 두꺼운 콜라겐 젤의 부산물에 의해 격리됩니다. 이 방법은 간외 담관 개발 및 병리 공부를위한 유용한 도구를 제공합니다.

신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 신생아 뉴런 간외 담관세포를 분리하고 배양하는 것입니다. 이를 위해 우선 복부 장기를 외과적으로 노출시켜 간과 담관에 접근할 수 있도록 합니다. 절차의 두 번째 단계는 담관과 담낭 주변의 결합 조직과 지방을 세심하게 제거하는 것입니다.세척된 담관과 담낭을 두꺼운 콜라겐 겔 위에 올려놓고 3주 동안 배양합니다. 담관에서 이동해 나온 담관세포를 얇은 콜라겐 겔로 분할하여 추가 배양합니다. 최종적으로 면역형광 현미경을 통해 순수 담관세포의 단층 형성 결과를 확인할 수 있습니다.일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 해부 기술의 어려움뿐만 아니라 작은 담관의 세척 과정에서 어려움을 겪습니다. 이 절차를 위해 조직 배양 후드 및 인큐베이터 근처에 마우스 수술대를 설치하십시오. 모든 멸균된 수술 도구는 70% ethanol이 담긴 비커에 넣어 두십시오.배지가 채워진 60mm 디쉬 3개를 얼음 위에 둡니다. 수술대에는 디쉬 2개가 필요하며, 나머지 재료들은 후드 안에 보관하십시오. 콜라겐은 얼음 위에 두어야 합니다.안락사시킨 생후 0~3일 된 신생 마우스를 해부판 위에 등으로 누운 자세(supine position)로 놓는 것으로 시작합니다. 골반 근처의 중앙선을 따라 작은 가로 절개를 넣습니다. 절개 부위를 양옆으로 확장하여 U자형 플랩을 만들고 장기를 노출시킵니다.이제 장을 복부 오른쪽으로 조심스럽게 밀어냅니다. 간과 담관을 관찰하기 위해 필요한 경우 피부 절개 부위를 확장하여 플랩을 넓힙니다. 해부 현미경 하에서 총담관을 조심스럽게 식별하고 주변 조직을 제거하여 깨끗이 정리합니다.결합 조직과 주변 지방을 제거합니다. 다음으로, 동일하게 작업을 수행합니다. 담낭을 세척하려면 담관과 담낭을 분리하여 준비된 접시 중 하나에 넣습니다.등급이 지정되지 않은 포셉을 사용하여 조직 구조물을 마사지함으로써 결합 조직을 더 제거하고 담즙을 배출합니다. 그런 다음 세척된 조직을 두 번째 접시로 옮깁니다. 정확히 5마리의 신생아로부터 조직이 수집될 때까지 이 절차를 반복하십시오.먼저 농도가 높은 콜라겐 겔을 준비하십시오. 이 과정은 항상 가장 먼저 신선하게 수행해야 합니다. 멸균된 모든 용액을 준비하여 얼음 위에 두십시오.1X PBS 1mL당 콜라겐 2mg이 되도록 필요한 부피를 계산합니다. 콜라겐의 각 부분당 0.023 부분의 수산화나트륨을 첨가합니다. 파이펫팅을 통해 상온에서 분주액들을 혼합합니다.콜라겐을 추가하기 전에 PBS 수산화나트륨과 증류수를 혼합하는 것이 필수적입니다. 콜라겐 스톡은 겔에 가장 마지막으로 추가해야 하는 성분이며, 최종 용액은 피펫으로 분주해야 합니다. 이렇게 하면 콜라겐이 뭉치는 것을 방지할 수 있습니다.용액이 겔과 같은 농도로 변하기 시작하면, 즉시 분리된 조직을 매립하고, 매립된 조직을 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 굳힙니다. 굳어진 후, 겔 위에 3.5 milliliters의 BEC 배지를 덮고 배양을 계속합니다. BEC 배지를 일주일에 세 번 교체합니다. 3주 이내에 매립된 도관으로부터 핵이 큰 세포 시트가 형성될 것입니다.이들은 담관세포입니다. 배양 접시에 섬유아세포가 상당수 존재하고 이를 제거할 수 없다면, 해당 접시는 폐기해야 합니다. 이제 PBS 1 mL당 1 mg의 콜라겐이 포함된 얇은 콜라겐 겔을 준비하십시오. 100 mm 플레이트에 콜라겐 1 mL를 도포하고 균일하게 펴 바른 뒤 10분 동안 기다립니다.10분 후, 플레이트에 7 mL의 DM EMF 12를 덮고 10분 동안 배양합니다. 짧은 배양 후, 콜라겐을 XPBS 1회로 빠르게 세척합니다. 흡입법으로 PBS를 모두 제거한 다음, 첫 번째 층을 형성했을 때와 동일한 방식으로 콜라겐의 두 번째 층을 추가합니다.응고가 완료되면, 플레이트 위에 DMF 12를 덮고 30분 동안 배양합니다. 이제 두꺼운 겔에서 세포를 분리합니다. 먼저 스패튤라나 스크래퍼를 사용하여 콜라겐이 떠오를 수 있도록 플레이트에서 부드럽게 떼어냅니다.다음으로, 여과된 collagenase 용액을 준비하여 두꺼운 collagen이 담긴 각 60 millimeter 디쉬에 1 milliliter씩 첨가합니다. 그 후 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 30분 동안 배양한 후, 세포가 포함된 모든 용액을 제거하여 15 milliliter 튜브로 옮깁니다.튜브를 원심분리한 후 흡입법으로 상층액을 제거합니다. 펠렛을 4.5 milliliters의 DM F 12 배지에 재현탁하고 다시 원심분리합니다. 펠렛을 3 milliliters의 0.5%Trypsin에 재현탁하고 세포를 37 degrees Celsius에서 5분 동안 배양하며, 이 과정에서 세포 시트가 느슨하게 떨어집니다.5분 후, 덩어리들이 풀어질 때까지 5 또는 10 mL 피펫으로 통과시킵니다. 그런 다음 5 mL의 BEC 배지를 첨가하고 세포를 원심 분리합니다. 세 번째로 재현탁합니다.세척 단계로 펠릿을 DMM F 12 배지에 현탁시킨 후 세포를 다시 펠릿화합니다. 이제 세포를 BEC 배지에 재현탁하여 준비된 박층 위에 분주합니다. 콜라겐 겔에서 세포를 배양하고 필요에 따라 콜라겐 겔 상에서 세포를 분할합니다.설명된 프로토콜을 사용하여, 순도가 매우 높은 신생 생쥐의 간외 담관세포 집단을 분리하고 K 19 면역형광 염색을 수행하였습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 세심한 담관 절제와 두꺼운 콜라겐 젤 상에서의 외성장을 결합하여 신생 생쥐의 순수한 간외 담관세포 집단을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 우리는 전체 murine 간, 조직 소화, 세포 강화, 그리고 유동세포계측법 절연을 요구하는 과정에서 CD133 표현 간 줄기 세포와 암 줄기 세포의 절연을 설명합니다. 우리는 고급 단일 세포 분리 및 clonal 확장 메서드를 포함합니다.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

이 프로토콜 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트 3 차원 organoid 시스템의 생산을 설명합니다. 이러한 담 즙 organoids cholangiocyte 생물학 연구 문화에서 유지할 수 있습니다. 담 즙 organoids 조상 및 담 즙 셀의 마커를 표현 하 고 편광 된 상피 세포의 구성 됩니다.

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

쥐 신생아 담관 장애를 관찰하려면 손상되지 않은 담관과 효율적인 준비가 필요합니다. 따라서 쥐 신생아에서 전체 간외 담관 시스템을 분리하기위한 새로운 접근법이 담관의 완전성을 유지하면서 성공적으로 개발되었습니다.

9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

학습하세요 신생아 마우스 간외 담관 세포 분리 및 배양 방법을. 콜라겐 겔을 이용한 정밀한 조직 분리 기법으로 담관 발달 및 병리 연구에 활용할 수 있습니다.

신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

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