Name: 에 의해 감광성 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 학습하세요 감광성 막 단백질의 양성자 이동과 입체 구조 역학을 시간 분해 적외선 분광법으로 분석하는 방법을 배우세요. 이 기법은 미세초에서 밀리초 시간 척도에서 단백질 기능을 관찰하여 분자 생물물리학 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft에서 J.H.(FOR-1279, SFB-1078, B3)에 수여하는 보조금의 지원을 받았습니다. 유용한 의견을 주신 Tom Resler와 Björk Süss에게 감사드립니다.

1. 일반 샘플의 측면과 악기 준비 <ol><li> 시간이 해결 단계 스캔 측정을 위해 장착 된 상용 FT-IR 분광기를 사용합니다. 최상의 결과는 진동 분리 테이블 위에 FT-IR 분광계를 배치하십시오. </li><li> 몇 밀리바에 광학 함을 대피. 건조한 공기 또는 질소로 샘플 실을 제거. </li><li> FT-IR 분광계의 MCT 검출기 앞에 가시 광선에 불투명 한 IR 투명 재료를 넣습니다. 이러한 예방 조치 단계 스캔 실험 중에 흥미로운 레이저 펄스 유물을 방지하기 위해 필수적이다. 참고 : 우리는 게르마늄 25mm 직경의 (창) 창을 사용합니다. 높은 굴절율은 바람직하지 못한 강도가 큰폭으로 반사 방지 코팅의 Ge 필터를 이용하여 피해 상실시킨다. </li><li> 액체 질소와 MCT 검출기 듀어를 냉각. 참고 : 태양 광 MCT 검출기의 사용은 우수한 photometr에게, 따라서, 때문에 자신의 선형 응답 photoconductives 선호하고IC의 정확성과 기준의 신뢰성 31,53. </li><li> 저가의 버퍼 (&lt;20 ㎜) 동질 단백질 막을 형성 단백질 현탁액을 건조하는 동안 염 결정의 형성을 방지하기 위해 이온 강도에서의 적어도 2 단백질 1mg / ㎖로 실험에 사용하여 샘​​플을 예비 농축. 침전물 시료 (리포좀 또는 세포막 패치에서 예, 막 단백질) 초 원심을인가함으로써 그들을 집중 / 씻는다. 침전물 (예를 들어, 세제 용해 막 단백질을)하지 않는 단백질을 적절한 차단의 centricons를 사용합니다. </li><li> 최적의 결과를 사용한다 : A) 가능한 한 단백질 제제로 순수하고 활성; 세포막 패치 또는 리포좀에 재구성 단백질에 대한 무게 3 ≤ B) 지질 / 단백질 비율; C) 세제 / 단백질 세제 용해 단백질에 대한 무게 1 ≤ 비율. 진동 밴드 단백질 (예를 들어, CHAPS)들과 중복 세제 또는 지질의 사용을 피하십시오. </li></oL&gt; 박테리오로돕신에 감쇠 총 반사 실험 2. 준비 <ol><li> FT-IR 분광계의 샘플 실에 ATR 액세서리를 장착합니다. 참고 : 우리는 5 활성 반사와의 ZnSe / 다이아몬드 ATR을 사용합니다. 자신의 광학 특성이 흥미로운 가시 레이저에 의해 영향을받는 등, 같은 ATR 액세서리의 내부 반사 요소 (IRE) 게르마늄이나 실리콘과 같은 반도체 물질을 피하십시오. </li><li> 4cm -1 기존의 빠른 스캔 FT-IR 분광법에 의한 깨끗한 IRE 표면의 해상도로 넓은 범위 (약 4,000-800 ㎝ -1)의 에너지 스펙트럼을 측정한다. 나중 단계에서 흡수 스펙트럼을 계산하기위한 기준 스펙트럼으로서이 스펙트럼을 사용한다. </li><li> 샘플 (예를 들면, pH를 7.4에서 4 M의 NaCl 100 mM의 NAPI를) 재수 나중에 사용되는 버퍼 20 ㎕와 ATR의 IRE의 표면을 커버. 버퍼의 IR 흡수를 측정한다. </li><li> 버퍼를 제거하고 IRE 표면 위스콘신 린스일 물. 표면을 만지지 마십시오. 강한 공기 흐름에 의해 IRE 표면에서 잔류 액체를 제거합니다. </li><li> IRE 표면 (~ 0.2 cm 2 지역)의 상단에 보라색 세포막 박테리오로돕신의 2 ~ 3 μL (BR)을 확산 (탈 이온수 ~ 6 mg의 단백질 / ㎖). 필름이 달성 될 때까지 건조 공기의 부드러운 흐름에 따라 단백질 현탁액을 건조. </li><li> 드라이 필름의 흡수 스펙트럼을 측정한다 (도 1 참조). </li><li> 부드럽게 드라이 필름 (예를 들면, pH를 7.4에서 4 M의 NaCl 100 mM의 NAPI를) 재수 높은 이온 강도의 버퍼의 20 ~ 40 μl를 추가합니다. 주 : 고 이온 강도는 프로빙 표면에 가능한 부근 (도 2)만큼 단백질을 유지할 수 있도록, 멤브레인 막의 과도한 팽윤을 방지한다. </li><li> 수분 증발을 방지하기 위해 뚜껑 ATR 홀더 커버. 선택적으로, 온도 제어를위한 25 °의 C로 설정 순환 욕조에 연결된 커버 재킷을 배치합니다. 긴 photocycles (&amp; #와 단백질에 대한(62) 초), 온도 제어는 기준의 안정성을 높일 수 있습니다. </li><li> 흡수 스펙트럼을 측정한다. 버퍼의 흡수 스펙트럼 (도 3)를 감산함으로써 필름의 재수 화 후 표면 근처에 남아있는 시료의 비율을 추정한다. </li><li> 재수 후 5 ~ 20 분 간격 (그림 4)에서의 흡수 스펙트럼을 기록하여 붓기 필름의 안정화를 확인합니다. 이 단계는 선택 사항이지만 권장합니다. </li></ol> 3. 세제 용해 Channelrhodopsin-2 전송 실험을 수행 <ol><li> 5 mM의 염화나트륨, 5 mM의 HEPES 직경 20mm의 BAF 2 윈도우의 중심에 (산도 7.4) 및 데실-말토 (DM)에 용해 ChR2 (~ 10 ㎎ 단백질 / ㎖)의 10 μl를 추가합니다. 6-8 mm 직경의 마이크로 피펫 팁의 도움으로 확산 (~ 200 ㎍ / cm의 단백질 표면 밀도 2). </li><li> 영화 USI를 형성건조한 공기의 부드러운 흐름을 겨. 최상의 결과를 위해 막이 균질 거칠게 큰 개구에 IR 빔의 크기와 일치하는 직경을 갖도록. </li><li> ≥ 1mm 두께의 평평한 실리콘 O 링을 사용하여 건조 막 3-5 3-5 방울 주위에 분포 글리세롤 / 물 혼합물의 μL 및 제 윈도우와 밀접 부근을 첨가하여 막을 수화물. 주 : 글리세롤 / 물 혼합물의 비율은 창문 (54) 사이의 상대 습도를 제어한다. 흡습성 샘플 3 / 7, 2 / 7 글리세롤 / 물 비율 (w w /)를 사용하십시오. 글리세롤 / 물 방울 단백질 막과 직접 접촉 않을 것입니다. </li><li> 홀더에 BAF 2 끼워 창을 삽입합니다. 수화 된 필름의 크기와 일치하는 구멍을 가진 종이와 같은 IR 불투명 재료와 샘플 창 취재하여 검출기에 도달하는 직선 광을 막는다. 샘플 실에 홀더를 배치합니다. </li><li> 25 °에 홀더의 온도를 제어온도 조절 순환 욕조에 연결된 온도 조절 재킷으로 C. </li><li> 흡수 스펙트럼을 측정한다. 아미드 I 영역에서의 최대 흡수 (~ 1,700-1,620 cm -1) 0.6-1.0의 범위에 있는지 확인합니다. </li><li> 물, DM, 대표 막 단백질 (그림 6)에 대한 참조 흡광 계수 스펙트럼을 사용하여 수화 필름의 흡수 스펙트럼에서 질량과 단백질 / 세제 / 물 몰비 (그림 5)으로 추정된다. </li><li> 수화 수준 단계 스캔 실험 (≥ 1 시간)를 수행하기 전에 안정화 될 때까지 기다립니다. </li></ol> 흥미로운 레이저 4. 조정 및 동기화 photocycle를 트리거하기 위해 YAG 레이저 (λ = 532 nm의) : BR에 대한 실험은 펄스 노스 다코타의 두 번째 고조파 방출을 사용하십시오. 영업 이익이 제공하는 ChR2 관련된 실험을 위해, λ = 450 ㎚의 여기를 사용YAG 레이저 : tical 파라 메트릭 발진기 (OPO)는 노스 다코타의 3 차 고조파 (λ = 355 nm의)에 의해 구동. 레이저 펄스가 차 사진 흥분을 최소화하기 위해 (~ 10 NSEC) 충분히 짧은 있는지 확인합니다. 주 : 레이저 펄스의 에너지를 가능한 한 일정하게 유지되어야한다. 과도 레코더에 연결된 포토 다이오드에 의해 레이저의 반사를 측정하고 응답 (도 8)를 통합하여 확인 된 우리의 설정에서는, 레이저 강도는 평균값 주위 ≤ 10 % 변동한다. <ol><li> 샘플 몇 레이저를. 전력계를 사용하여 펄스 당 2-3 엠제이 / cm 2로 샘플에서의 레이저의 에너지 밀도를 조정한다. <ol><li> ATR 설정에, ATR 뚜껑의 상부에 배치 된 광섬유를 사용한다. </li><li> 전송 실험을 위해, 시료에 레이저를 가지고 미러를 사용하고, 필요한 경우에, 시준 렌즈를 하나 또는 약간의 샘플 필름의 크기 이상 직경에 레이저 광을 발산. </li></ol></li><li> LASE 동기화R 분광계에 의해 데이터 기록과 펄스. 분광계를 트리거 : YAG 레이저의 Nd 전자의 Q-스위치 동기화 아웃 TTL 펄스를 사용합니다. 각각 YAG의 BR 10 Hz에서 레이저와 ChR2 0.25 Hz에서 : 노스 다코타의 여기 속도를 설정합니다. </li><li> 레이저 여기 레이트를 제어하기 위해 펄스 딜레이 생성기 (PDG)를 사용하는 경우의 Nd 반복율 : YAG 레이저를 쉽게 조정할 수 없습니다. <ol><li> PDG 외부 트리거 입력 : YAG 레이저 다코타의 램프 싱크 아웃을 연결합니다. PDG는 Q-스위치 노스 다코타의 입력 싱크에에 ~ 190 마이크로 초 지연 TTL 펄스 출력을 제공 : YAG 레이저는 레이저 발진을 유발 할 수 있습니다. 게이트 PDG는 마지막 허용 트리거 (BR 또는 ChR2 4 초 100 밀리 초) 이후 일정 시간 후 외부 트리거를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 5. 시간 해결 단계 스캔 준비 및 설정 <ol><li> 광학 경로에 로우 패스 광학 필터를 놓습니다. 1,800-85에 시간이 해결 단계 스캔 측정을 수행하려면0cm -1 스펙트럼 범위는 1,950 ㎝ -1 위 1,800 ㎝ -1 (그림 7) 아래 좋은 전송 (&gt; 50-80%)와 필터 불투명를 사용합니다. </li><li> AC에서 DC-커플 링 모드로 감지기를 변경합니다. 참고 :이 조정 후 간섭 무늬 신호가 더 이상 주변에 제로하지만 DC 레벨로 알려진 값 주위를 진동하지 않습니다. </li><li> 신호대하지만 검출기의 선형성 한계 내에 따라서 가능한 최대 빔 높은 광자 플럭스 분광계의 조리개와, 더를 사용한다. </li><li> 제로에 간섭 무늬의 DC 레벨을 가져와 아날로그 디지털 변환 (ADC)의 동적 범위를 더 잘 사용할 수 있도록하기 위해 전자 이득을 다시 조정. 전치 증폭기에 의해 제공된 신호에 전압 바이어스를인가함으로써 DC-오프셋 레벨을 달성한다. 참고 :이 옵션은 현대 FT-IR 분광계에 포함되어 있습니다. 그렇지 않으면, 홈 메이드 외부 장치는 프리 앰프와 ADC (38) 사이에 배치하는 대신 이용 될 수있다. 케어는입니다이러한 장치의 전자 빠르고 선형 보장하기 위해 필요합니다. </li><li> FT-IR 분광계의 단계 스캔 메뉴를 시작합니다. 1,975.3-0 cm에 단계 스캔 측정의 대상 스펙트럼 대역폭을 설정 -1. 약간 광학 필터의 컷오프를 초과, 그는-Ne 레이저의 파수 (본 경우에는 1 / 8 일)의 일부에 스펙트럼 대역폭을 조정합니다. </li><li> 나중에 시간에 반응 속도의 왜곡을 방지하기 위해 모든 하이 패스 전자 필터를 사용하지 않도록 설정합니다. 그 컷오프 주파수는 순서대로 또는 ADC (잡음 에일리어싱을 감소)의 샘플링 속도 이상일 때 로우 패스 필터는 전자 유리할 수있다. </li><li> 각각 8 ㎝ -1 및 64 ㎝ -1로 스펙트럼 및 위상 해상도를 설정합니다. 앞으로 단 하나 측에 간섭 무늬 획득 모드를 설정합니다. 이러한 옵션을 하나의 간섭 무늬는 약 500 포인트가 필요합니다. </li><li> 160 KH 예 (분광계 가능한 가장 높은 ADC의 샘플링 레이트를 설정Z, 6.25 마이크로 초). 즉, &quot;외부&quot;에 &quot;실험에 대한 트리거&quot;로 설정, 레이저는 마스터입니다. BR (최대 42 밀리 초) 7,000 20,000 ChR2 (최대 125 밀리 초)을 위해 : 기록 할 선형 간격의 데이터 포인트의 수를 설정합니다. 참고 : 긴 시간 규모는 데이터 수집 (38)을 트리거 파 발생기로부터 준 대수적 시간 이격 외부 TTL 펄스를 이용하여 ADC 메모리를 오버 플로우하지 않고 적용 할 수 있고, 또는 내부 ADC (31)의 대체품으로서이 평행 과도 레코더를 사용하여, 32. </li><li> 샘플의 어두운 상태에 대한 기준으로 약 100 프리 트리거 포인트를 저장합니다. 주 : 밀리 세컨드 타임 스케일에서의 데이터 품질이 종종 모바일 미러의 변동에 의해 제한된다. 100 이상 프리 트리거 포인트를 늘리면 따라서 크게 데이터 품질을 개선 할 것으로 예상되지이다. </li><li> 즉, 광 반응의 평균 수 미러 멋 부리다 당 공동 추가의 수를 설정이온. BR의 경우, 20 공동 추가 (10 Hz에서 여기 속도로 시간을 측정하는 20 분)를 사용합니다. ChR2 2의 추가 공동 (0.25 Hz에서 여진 속도로 측정 시간 70 분)에 대한 사용 </li><li> BR에 대한 실험 10 배를 반복 ChR2에 대한 35 배 세에 다른 샘플 필름, 미러 위치 당 마침내 ~ 200 공동 추가를 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 데이터 처리 <ol><li> 첫번째와 마지막 측정으로부터 얻어진 광 - 유도 된 IR의 차이 스펙트럼을 비교함으로써 시료의 상태를 확인한다. 차이 스펙트럼의 강도는 아래의 첫번째 둘레의 60 % 인하 어떤 측정을 폐기 참고. </li><li> 기록 된 간섭을 평균. <ol><li> &quot;스펙트럼 계산기&quot;로 평균을하고 추가 할 시간이 해결 된 간섭을 선택 FTIR 분광계의 OPUS 소프트웨어를 사용하여. </li><li> &quot;=&quot;간섭 무늬의 평균을 구하십시오. 참고하면 간섭 무늬의 위상그것은 평균 간섭 무늬 또는 단일 채널 스펙트럼에 무관심 측정하는 동안 일정하다. 일정한 위상 계산 및 제위한 위상 스펙트럼 및 마지막으로 기록 된 간섭 무늬를 비교함으로써 확인 될 수있다. </li></ol></li><li> 평균화 시간 분해 단일 ​​채널 스펙트럼을 구하는 푸리에 평균화 시간 분해 간섭 무늬의 변형을 수행. <ol><li> 단계 6.2.1에서와 같은 소프트웨어를 사용하여, 평균 시간이 해결 간섭 무늬를 선택하고 &quot;스펙트럼에 간섭 무늬&quot;의 아이콘을 클릭합니다. 메르 츠 위상 보정 방법, (2)의 제로 충전율 (기악 해상도 당 두 개의 디지털 점), 그리고 아포 디제이 기능 (예를 들어, 삼각형, Blackmann - 해리스 3 조건 등)를 사용합니다. </li><li> 시간 분해 스펙트럼에 시간이 해결 간섭 무늬를 변환하는 바닥 &quot;변환&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> &quot;데이터 포인트 테이블&quot;또는 &quot;로 시분 해 단일 ​​채널 데이터를 내보낼; MATLAB &quot;을 사용하여 파일&quot;OPUS 소프트웨어의 아이콘 &quot;으로 저장합니다. 외부 프로그램에서 데이터 처리를 계속한다. <ol><li> 레이저 전에 단일 채널 스펙트럼을 평균 및 시간 분해 흡수 스펙트럼의 차이에 시분 단일 채널 데이터를 변환. </li><li> 소음 표준 편차, ε을 사용하여, 파수의 함수 (그림 12)과 차이 스펙트럼에서 예상되는 잡음의 표준 편차 벡터를 계산하고, 의미, S 0 (ν), 레이저 앞의 100 단일 채널 스펙트럼 : ε / S 0 (ν). ε의 값은 연속적인 단일 채널 스펙트럼을 뺀 √ (2)에 의해 보정 된 표준 편차를 산출하는 것으로 추정된다. </li><li> 사용 될 너무 시끄러운 스펙트럼 영역 제거 (1천8백25cm -1 (850) 아래 CM 이상, 예를 들어, -1). </li><li> 준 대수적으로 평균 (예를 들어, 20 스펙트럼 / 시간 년)을 수행합니다. appearan데이터의 CE 개선하고 스펙트럼의 수는 손실에 중요한 정보 (그림 9)없이 ~ 10 2 ~ 10 4로 감소 될 것이다. </li><li> 푸리에 보간을 사용하여 (1 점 / cm-1로) 포인트 4 배 스펙트럼 밀도를 증가 (제로 충전을 게시). 참고 : 우리는 MATLAB에서 실행되는 집에서 만든 프로그램에서 6.4.4 단계 6.4.1를 수행합니다. </li></ol></li><li> 특이 값 분해, SVD (그림 13)으로 얻어진 시간 분해 스펙트럼 (그림 10A)을 처리합니다. 상당한 SVD 성분 (도 10b)의 제한된 수의 데이터를 재구성하여 데이터 디노 이징을 수행. 참고 : 우리는 내장 &quot;SVD&quot;기능을 사용하여, MATLAB에서 SVD를 수행합니다. </li></ol>

저자는 더 경쟁 금융이자를 선언하지 않습니다.

단백질에 대한 시간 분해 스텝 스캔 FT-IR 실험을 수행 할 때 고려할 필요 첫번째 측면 중 하나는 IR 분광법에 적합한 형태로 시료의 준비이다. 또한 단백질 이외의 물질에서 IR 흡수를 감소시킬 필요가있다, 특히 물이. 가장 일반적인 방법은 필름을 형성하기 위해 샘플의 벌크 물이 증발한다. 필름은 수용액 중 일부 방울을 추가하여 또는 제어 다습 분위기에 막을 노출시킴으로써 하나 재수 화 될 수있다. 우리는 두 경우 모두는 IR 흡광 법에 의해 얻어진 수화 레벨 (도 3 및도 5 참조)를 추정 할 수있다 방법을 보여 주었다. 얻어진 수화 수준이 솔루션에 비해 낮은 나타날 수 있지만, 그들은 기능적으로 관련 단백질의 수화 필름의 연구를하고, 실제로 살아있는 세포 (70)에서 발견 된 것과 가까이에 있습니다. 물 게다가,알고 및 샘플 지질 또는 세제의 양을 제어하는​​ 것도 중요하다. 모두 IR 흡수가 감소 분광 영향을 충분히 낮게 유지하지만, 그 단백질의 무결성과 기능성을 유지하기 위해 충분히 높아야한다. 시간이 해결 단계 스캔 분광법은 빛에 의해 재현성 트리거 할 수있는 가역 반응을 나타내는 단백질 만 똑 바르게 적용 할 수있다 (단, 빠른 버퍼 교환 단계 스캔 결합에서 진행 상황을 참조) 71. 에서의 반응은 적어도 ~ 500X에 재현 할 필요가 스텝 검사, 최소 8 ㎝ -1 해상도 1,800-850 cm -1 영역을 커버하는 간섭 무늬를 완료합니다. 그러나 실제로는, 추가 데이터 평균화 일반적 다운 잡음 레벨을 누르는 것이 요구된다. 200 co-additions/mirror 위치 (반응의 열 다섯 번 반복)의 경우 6.25 마이크로 초 해상도 흡광도 차이 스펙트럼 잡음 STA를 표시 할 수있다ndard 편차 ATR과 -5 10 × -6 10 × 5 ~ 3 전송 실험 (그림 15)에 대한 -4 10 × 10-5 × 2 사이 2. 더 높은 광자 처리, 전송 덕분에 ATR, 성공적으로 ChR2 약한 흡수 변화를주는 샘플을 연구하기위한 핵심 요소보다 ~ 7 낮은 소음 레벨을 허용한다. 한편, ATR은 전송 실험을 5 회 이상 25 이하의 샘플을 필요로한다. 시간이 해결 단계 스캔 FT-IR 분광법의 응용 프로그램이 느린 photocycles를 표시하는 단백질에 대한 문제가있다 : 단계 스캔에 의해 간섭 무늬를 기록하는 것은 긴 비실 될 수 있습니다. 일부 솔루션들은 종종 증가 된 단백질 소비 및 실험 27,74 복잡성의 비용으로 측정 속도를 체류 교환 샘플 사용에 기초하여 그러한 경우 72, 73, 취급을 위해 제시되었다. 어떤 경우에는 EX하여이 문제를 회피 할 수있다photocycle 엄격히 완료되기 전에 샘플을 인용. ChR2를 들어, 99 %의 복구를위한 광 여기 60 초 후 필요로하는 photocycle으로, 4 초에 복구가 이미 80 % 48입니다. 레이저 펄스 당 10 %의 여기 효율과, ChR2 분자의 98 %는 0.25 Hz에서 레이저 반복율에서 실험을 수행하는 것이 가능하게, 광 여진 후 어두운 상태에서 4 초이다. 데이터 처리는 최상의 결과를 얻기 위해 요구되는 최종 기술적 측면이다. 대수 평균화는 노이즈를 감소시키고, 또한 중요, 특이 값 분해 또는 해외 피트를 사용하여, 왜곡없이 후방 데이터 분석 기능을 필수 데이터의 크기를 감소시킨다. 대수 평균, 그러나, 측정하는 동안 이동 거울와 다른 1 / f 노이즈 소스 (도 9)에서의 진동으로 인한 시간 트레이스의 변동을 평균화 매우 성공적이지. 베이스 라인에서의 이러한 변동밀리 초 단위의 범위와 데이터의 손상 품질의 노이즈를 초과 할 수 있습니다. 특이 값 분해는 소음을 줄이기 위해 데이터의 중복을 활용하고, 일부 수정 (57)와 그것뿐만 아니라 기저선 변동을 감소시킬 수있다. 마지막으로, 시간 분해 스텝 스캔 FT-IR 실험 어려워 가장 시간이 많이 걸리는 부분 대역들의 할당 및 상기 데이터의 스펙트럼 및 역학적 해석에 대응한다. 박테리오로돕신에 대한 IR 차이 스펙트럼에 나타나는 밴드의 많은 수십 년 동안 많은 연구자 그룹의 축적 된 작업 덕분에 할당하거나 해석되었다. 이러한 channelrhodopsin-2와 같은 훨씬 덜 연구 된 단백질의 경우, 위의 발표 시간이 해결 IR 실험은 사이트 감독 돌연변이에 병렬 실험을 동반하고 기계적인 해석 (48)에 도달하는 보완 기술의 정보와 결합 될 필요가있다.

완전 단백질은 그들의 기능을 수행하는 방법을 설명하기 위하여, 그것은 그들이 즉 종종 중간체의 시리즈를 포함하고시의 여러 명령을 연장 반응 경로를 따라, 작업으로 그들을 측정하도록 요구된다. 단백질 기능의 주요 단계는 종종 시간 범위 1 밀리 초 마이크로 초에서 개최, 백본 구조적 변화와 막 단백질의 양성자 이동 반응, 특히. X-선 결정학, 구조 생물학의 거의 틀림없이 기둥, 막 단백질이 함께 성장하기 어렵기로 악명이 잘 회절 단백질 결정에서 정적 (시간 평균)의 전자 밀도를 제공합니다. 거의 수소 원자의 위치를​​ 포함한 없지만 원자 3D 모델은, 전자 밀도에 기초하여 구축 될 수있다. 라우에 회절 3 또는 펨토초 X-선 펄스 4 중 하나를 의존하는 시간 분해 X-선 결정학에서 괄목할만한 진전이 높은 구조 정보에에 시간 차원을 추가X-선 결정학 5 herent. 그러나 기술 및 분석 과제를 별도로 설정, 결정 격자 백본 구조적인 변경을 손상과 단백질 역학, 단백질 결정 (5)에 기반 방법의 피할 수없는 단점을 변경할 수 있습니다. 따라서, 단백질의 동적 인 측면은 여전히 최고의 플래시 광분해 6,7에 의해 개척으로, 광학 방법으로 적용, 제한 구조 통찰력의 일반적인 단점과 함께하지만.된다 퓨리에 변환 적외선 분광기 (FT-IR)는 단백질 구조, 막 단백질 8-11에 무수한 정적 구조 및 기능 연구에 악용 마지막 기능에 가치 감도 광학 분광기의 시간 해상도를 결합합니다. 특히, FT-IR의 차이 분광기는 다른 12-19 하나의 준 안정 상태에서 단백질의 이동로와 같은 작은 스펙트럼의 변화를 연구 할 수있는 이상적인 도구로 입증되었습니다. Studie단일 분자 수준 (20, 21)에서보다 다른 단백질 역학에의 동기화를위한 트리거 과정을 필요로한다. 순환 광 반응과 단백질의 연구에서 수행으로 반응은, 트리거로 빛을 사용하여 침습적 빠르고하지 시작됩니다. 좋은 스펙트럼 해상도와 원하는 신호 - 대 - 잡음 비를 유지하면서 시간 분해 연구와 관련된 주요 문제는 충분한 시간 해상도의 달성이다. 또한 필수는 충분히 넓은 스펙트럼 및 시간 범위를 커버하는 것입니다. 시간이 해결 단계 스캔 FT-IR 분광법 출판 예 3,900-850 cm로 넓은 스펙트럼 범위를 커버 -1 역학 최대 3.5 cm로, ~ 시간의 9 주문을 연장 -1 스펙트럼을,이 측면 (22) 모두 우수 30 나노초 시간 해상도 23-28. 푸리에 변환 적외선 분광기는 분산 사람 29 이상 감소 된 소음과 향상된 광도 정확성을 보여줍니다. Howev어, 보통 빠른 스캔 촬영 모드에서 FT-IR 분광계는 간섭계의 모바일 미러 스캔을 완료하는 데 필요한 최소 시간의 결과로 ≥ 5 ~ 10 밀리 초 제한 시간 해상도의 고통. 스텝 주사 기법과 대조적으로, 동적 이벤트의 시간 의존성은 간섭계의 스캔 구간에서 분리된다. 요약하면, 별도의 단계가 아니라에서 모바일 미러 움직임은 지속적으로 검사를 완료하기 위해 스캔. 각 단계에서 (모바일) ​​미러가 고정 개최되는 과도가 기록됩니다. 따라서, 시간 해상도는 수은 - 카드뮴 - 텔루 라이드 10 내지 100 나노초의 범위에 일반적으로 (MCT) 검출기의 상승 시간에 의해 제한된다. 실제로, (날개 centerburst 작은 신호에 강렬한 신호를 포함) 간섭 무늬의 넓은 동적 범위, 샘플링에 이르는 많은 16-24로 비트 적절한 디지털화 아날로그 / 디지털 변환기 (ADC)를위한 필요 ~ 200 kHz의 이상하지 환율(5 마이크로 초) 30. 나노초의 시간 분해능은 8 ~ 12 비트 ADC가 충분 23,31-33되는 간섭 무늬 만 변화를 측정함으로써 달성 될 수있다. 기술적 인 측면 30,34,35 및 응용 프로그램 시간이 해결 단계 스캔의 36 ~ 38는 다른 곳에서 자세히 설명하고 있습니다. 현재 포스팅의 목적은 감광성 막 단백질에 대한 시간 분해 스텝 스캔 FT-IR 분광법의 실용성을 기술하는 프로토콜을 제공하는 것이다. 전송 및 감쇠 전반사 (ATR) : 여기에, 기술의 성능은 두 가지 샘플링 방법에 대해 표시됩니다. ATR의 사용은 단백질 전체 수분 조건을 보장뿐만 아니라 샘플의 pH와 이온 강도 49,50 급성 제어 할 수 있습니다뿐만 아니라 여분의 수분의 존재에서 작업 할 수 있습니다. 박테리오로돕신 및 channelrhodopsin-2 단계 - 스캔 실험은 두 가지 선택 시스템에서 설명된다. 39,40 수많은 생물 물리학 연구의 대상이되고있다. BR 기능 FT-IR 분광법의 연구에 적용된 다양한 기술 중 거의 틀림없이 가장 큰 영향을 발휘하고있다. 즉, FT-IR 분광기는 다른 13,41,51 차지로 막에서 양성자 전달에 포함 된 그룹을 해결하는 열쇠이다. Channelrhodopsin (CHR)는 자연 42,43에서 발견되는 첫 번째 빛 - 게이트 이온 채널이다. CHR의 광 여진은 이온 채널의 과도 개구로 이끈다. 그 발견은 분자 프로세스 등 44, 45에 의해 제어되는 optogenetics의 개발을위한 방법을 정착했다. CHR 미생물 rhodopsins의 가족에, BR로, 속하지만 BR 대조적으로, 훨씬 덜은 그 기능기구 (52)에 대해 잘 알려져 있습니다. ChR2는 IO로서의 기능을 겸비한양성자 펌프 활동 (46, 47)와 N 채널. 최근에, 우리는 내 단백질 양성자 전달 반응과 ChR2 48 단백질의 백본 형태 변화의 역 동성을 해결하기 위해 시간이 해결 단계 스캔 FT-IR 분광법을 적용했다.

<table><tbody><tr><td>FT-IR 분광계</td><td>Bruker</td><td>Vertex 80v</td><td>광전지-MCT 감지기, 외부 글로벌 및 무급유식 펌프가 장착되어 있습니다. 펌웨어 2.3.</td></tr><tr><td>BaF2 창문</td><td>korth Kristalle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond ATR 액세서리</td><td>Smiths 감지</td><td></td><td>Nine-reflection DuraDisk</td></tr><tr><td>온도조절 욕조</td><td>Julabo</td><td>F25</td><td></td></tr><tr><td>진동 분리 테이블</td><td>OPTA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulsed Nd:YAG 레이저와 두 번째 고조파 발생기</td><td>Continuum electro-Optics</td><td>Minilite&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>광학 파라메트릭 발진기(OPO)</td><td>OPTA</td><td>BBO-355-VIS/IR S/N 1009</td><td></td></tr><tr><td>디지털 지연/펄스 발생기&nbsp;</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG535</td><td></td></tr><tr><td>Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator</td><td>Spectra-Physics</td><td>Quanta-Ray</td><td></td></tr><tr><td>다양한 광학 거울 및 렌즈</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPUS 7.0</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software to control Vertex 80v spectrometer</td></tr><tr><td>MATLAB run time</td><td>Mathworks</td><td></td><td>집에서 만든 실행 프로그램을 실행하는 데 사용됩니다. 데이터 전처리</td></tr></tbody></table>

에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

단백질의 기능 중에 양성자 및 단백질 골격 형태의 변화의 역학 모니터링 메커니즘의 승낙 향한 필수적인 단계이다. 양성자 및 형태 적 변화는 적외선 (IR​​)의 차이 스펙트럼에 의해 탐색 할 수있는 둘 다 각각의 아미노산 측쇄와 펩티드 결합의 진동 패턴을, 영향을 미친다. 그 기능 단백질이 빛으로 반복 재현성 트리거 될 수 들어, 푸리에 변환 스텝 스캔 적외선 기술을 이용하여 넓은 스펙트럼 범위 (서브) 마이크로 초 해상도 적외선 차이 스펙트럼을 얻는 것이 가능하다. 의 반응 속도를 수행하기에 충분한, 4 - 광 반응의 ~ 10 2 -10 3 반복으로, 최소한의 합리적 스펙트럼 해상도와 대역폭에서 검사를 완료하기 위해, 흡수 차이 스펙트럼의 잡음 레벨 ~ 10의 낮은 될 수 있습니다 하나의 아미노산에서 양성자 변경됩니다. 보다 낮은소음 수준은 더 많은 데이터를 평균화 및 / 또는 수학적 처리에 의해 달성 될 수있다. 최적의 결과를 위해 필요한 단백질의 양은 사용되는 샘플링 기법에 따라, 5-100 μg 사이이다. 추가 요구에 대하여, 단백질은 우선 낮은 이온 세기 완충액에서 농축 한 후 필름을 형성, 건조 될 필요가있다. 단백질 막은 물의 작은 물방울 또는 제어 된 대기 습도 하에서도, 종래의 실험에 수화된다. 달성 수화 레벨 (단백질의 물 / g의 g)은 IR 흡수 스펙트럼으로부터 계측된다. 기술을 소개하기 위해, 우리는 네이티브 보라색 막 환경에서 빛을 주도 프로톤 펌프 박테리오로돕신의 photocycle을 공부하고, 빛 게이트 이온 채널 channelrhodopsin-2의 세제를 용해.

도 1은 ATR 분광법에 사용 다이아몬드 내부 반사 소자의 표면에 증착 BR의 드라이 필름의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 펩티드 결합 (아미드, 아미드 I 아미​​드 II)의 진동의 특성 밴드는 명확하게 구별 할 수 있습니다. 드라이 필름의 대략적인 두께 (~ 0.2 cm 2)을 첨가 단백질 (18 μg)의 양 및 ATR의 표면을 고려하고, ~ 1.4 g / cm로 단백질의 농도를 가지고, ~ 1 μM로 추정 될 수있다 3, 58, 지질 1.0로 g / ㎤, 59과 1 / 3 보라색 막 (60) (W / W)의 지질 / 단백질 비율. 드라이 필름은 pH가 7.4 (그림 3)에서 4 M의 NaCl, 100 mM의 NAPI의 과잉 재수했다. 소산 파에 의해 프로빙 부피 수분 수준 효과적인 단백질 농도 디지털의 흡수 밴드를 제거하는 데 필요한 스케일링 인자로부터 추론 될 수있다물에서. 최적 배율이 경우 버퍼가 87 %와 표면 근방 볼륨의 샘플 13 %를 차지하는 것을 의미 0.87이었다. 계정 단백질 및 지질 농도와 퍼플 세포막 지질 / 단백질 비율 (상기 참조)를 고려하여, 우리는 소산 파에 의해 프로빙 부피의 125 ㎎ / ㎖의 효과적인 단백질 농도를 추론 할 수있다. 우리는, 특히이 경우, 시료의 막 두께는 1 ~ ~ ~ 6 ㎛ 인, 재수시 ~ 6 배 확대 수화 레벨로부터 추론 할 수있다. 트립위한 가장 ATR 배열 전형적인 45 °의 입사각에 대해서는, 수화 단백질 막용 소멸 필드 (d 피)의 침투 깊이는 1,800-850 cm -1 61 간격 μm의 0.3 내지 0.6 변화한다. 사라져가는 필드가 두 번 D의 P (61) 위에있는 샘플과 거의 구분하기 때문에, 우리는 ATR의 실험에 사용 된 단백질의 양이 승 원칙 감소 배에있을 수 있다는 추론신호의 상당한 손실을 ithout. 낮은 이온 강도의 버퍼를 사용하는 경우에는 필름이 더 확장되고 소멸 필드로 프로빙 부피 단백질 량 (도 2) 감소된다. 막 팽윤 및 버퍼의 이온 강도 사이의 정확한 의존성 지질의 특성상, 다른 요인 가운데, 의존 할 것이다. 예를 들어, 4 M 염화나트륨을 사용하여 퍼플 막의 BR 여기 얻어진 팽윤 유사한 막을 극성 E.에 재구성 된 막 단백질을 얻었다 단지 0.1 M NaCl을 62을 사용하여 대장균의 지질. 샘플이 프로빙 부피 5 % 미만을 차지하는 경우에 높은 이온 강도의 버퍼를 사용하여 수화 단계를 다시 수행 참고. 수분 후 붓기 필름 안정화 (그림 4)에 도달하는 시간이 필요합니다. 보라색 ​​막에있는 BR하는 과정은 12 분의 시간 상수, 단지 수 있습니다 : 그것은 안정적인 재수 필름이 더 이상 30 ~ 60 분 이상 소요 <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;도 5는 송신하여 얻어진 ChR2의 수화 된 필름의 IR 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 여기서, 수화는 글리세롤 / 물 혼합물에 의해 제공된 제어 다습 분위기에 드라이 필름을 노출시킴으로써 달성되었다. 스펙트럼은 물, 세제 및 단백질의 기여로 분해 될 수있다. 우리는 흡광 계수 스펙트럼을 사용하여 그들 각각의 양을 추정 할 수, 실험 스펙트럼에 맞게 조정. 물을 위해 우리는 문학 63에서 흡광 계수 스펙트럼을 가지고 가고, DM에 우리는 (그림 6) 100 ㎎ / ㎖ 용액에서 측정. 미토콘드리아 ADP / ATP 캐리어 (64)과 BR (그림 7) : 우리는 또한 두 대표 막 단백질에 대한 소멸 계수를 사용했습니다. 스케일링 계수는 각각 260 ㎍ / cm 2와 영화에서 200 ㎍ / cm 2의 물과 DM 대량의 표면 밀도를 나타냅니다. 나머지 흡수 (FigurE 3.5, 적색 선)이 서로 다른 멤브레인 단백질로부터 아미드 II 흡광 계수를 사용하여 250 ㎍ / cm 2의 표면 밀도로 추정 단백질 (도 6 참조)에서 주로 온다. 단백질 / 세제 / 물의 몰비가 각각 35 kDa의, 480 (DA) 및 (18) (DA)의 분자량을 사용 1/60/2000 계산되었다. BR에 전형적인 시간 - 해결 단계 스캔 FT-IR 실험에서 3D 플롯 ATR에 의해 얻어진 데이터 수집의 200 분을 포함, 그림 10A에 제시되어있다. 스펙트라는 L이, BR의 photocycle의 M 및 N 중간체는 가장 높은 인구 (도 11)에 도달 할 것으로 예상되는, 예를 들어, 특정 시간에 추출 될 수있다. 이들의 분광 특성을 광범위하게 13,41,65 설명하고 여기에서 더 이상 논의되지 않습니다. (12)는 몇 가지 선택 파수에서 시간 흔적을 보여줍니다. 1,762 ℃에서 반응 속도, 즉, 상승M-1 (t 1 / 2 ~ 60 마이크로 초)는 망막 쉬프베이스 (66)로부터 Asp85의 양성자의 역학에보고하고 제로의 붕괴는 지상 물리게 복구 67시의 탈 양성자를 나타냅니다. 1천7백40센티미터 -1 (t 1 / 2 ~ 1 밀리 초)에서 역학의 부정적 상승 Asp96의 측쇄, 쉬프베이스 (68)에 프로톤 공여체의 탈 양성자 화에보고한다. 세포질 67의 재 양성자에 제로 보고서에 대한 강도의 붕괴. 단백질의 구조적 변화의 역학 실온에서 67,69 ~ 3 밀리 초에서 최대 변화에 도달 아미드 I 아미드 II 지역에서 흡수 변화에 의해 탐색 할 수 있습니다. 문제를 분광하는 SVD의 응용 프로그램 (55, 56) 전에 검토되었다. A = U S : 간단히, SVD는, 매트릭스로 배열 된 실험 데이터를 factorizes <stroNG&gt; V T. 이 인수 분해는 파수의 소음 의존성을 고려하여베이스 라인 57에 변동 / 감도에 불이익을 수정할 수 있습니다. U 및 V의 열이 각각 각 SVD 구성 요소에 대해 직교 스펙트럼 및 시간 추적 벡터를 함유한다. S는 소위 특이 값을 포함하는 대각 행렬이다. U 및 V에서 (추상적 인) 분광 시각 성분은 연관된 특이 값에 의해 정량화 최소 제곱 센스에서 실험 데이터를 설명하는 관련성을 감소로 나타난다.도 13a는 부품 개수의 함수로서 특이 값을 나타내고 있으며, U (추상적 인 스펙트럼, 그림 13B)와 V (추상 시간 흔적, 그림 13C)의 첫 번째 8 개의 열 / 구성 요소를 재생합니다. 산도에 예상대로 신호는 (처음 다섯 개의 구성 요소에 집중되어있다otocycle 다섯 중간 상태를 포함), 대부분 랜덤 노이즈와 오류의 다른 소스에 의해 지배 위의 구성 요소. 실험 데이터는 U와 V의 처음 다섯 열 및 제 다섯 열 및 S 행만을 사용하여 재구성 하였다. SVD에 의해 복원 된 데이터는 순위 다섯 매트릭스 실험 데이터의 가장 최소 제곱 근사를 나타냅니다. 재구성 된 데이터 품질 개선 (그림 10B)를 보여줍니다. 즉, 소음은 크게 (시간 분해 단계 스캔 분광 25 공통) 기준의 일부 거의 눈에 띄지 변동 및 감도뿐만 아니라, 감소된다. SVD 가공 밀리 초 범위의 시간 - 추적 실험 (도 12에서 적색 선)의 품질 향상에 특히 유익하다. ChR2의 photocycle 시간 - 해결 단계 스캔 데이터는 변속 장치에 대한 상기 프로토콜을 사용하여 얻을 수 있었다<html> 대략 축적 된 측정 120 시간을 포함 시온 실험 (그림 14A). 스텝 검사에 의해 수집 된 시간 분해 데이터가 6.25 마이크로 초에서 125 밀리 초까지 연장. ChR2의 photocycle 전체 복구를 위해 약 60 초를 필요로한다. photocycle의 최신 부분은 빠른 스캔 FT-IR을 사용하여 적용 할 수 있으며, 다른 48 제시된 단계 스캔과 빠른 스캔 데이터 세트 모두를 흡수 합병하였습니다. ChR2의 스펙트럼 변화는 측정이 더 도전하고, BR에서 얻는 것보다 ~ 10 배 더 작다. 특히, 밀리 초 범위에서 기준에 진동이 낮은 흡수 변화에 명확하게 분명하게. 이들은 밀리 초 시간 스케일 (25)의 이동 거울에 작은 진동으로 인해 수 있습니다. 진동은 함께 노이즈의 일부를 크게 현저 데이터의 모양 (도 14B)을 개선, SVD에 의해 제거 될 수있다. gure 1 &quot;FO : 콘텐츠 너비 =&quot;5 인치 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 보라색 막에있는 BR의 그림 1. 흡수 스펙트럼은 ATR 액세서리 위에 다이아몬드 표면에 건조. 펩티드 결합의 진동에서 밴드 (아미드 I, II, 및 A) 표시됩니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig2highres.jpg" width="500" /> 다양한 이온 강도의 버퍼를 사용하여 재수 후 BR의 영화의 그림 2. 흡수 스펙트럼 (4 M의 NaCl, 100 mM의 나 2 HPO의 희석은 4 /의 NaH 2 산도 7.4의 PO 4). 아미드 II 밴드의 감소에 주목, 즉, 버퍼의 이온 강도의 감소와 함께, 영화 부종을 증가 시켰습니다. subtracti 후에 1천5백41센티미터 -1 (아미드 II 최대)에서의 흡광도의 강도에 의해 정량화 표면 근방 단백질 (삽입) 상대적인 양,버퍼의 흡수 기여에. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig3highres.jpg" width="500" /> 대량 버퍼 (4.3 M 이온 강도) 및 버퍼 기여 공제 후와 재수 BR의 영화의 그림 3. 흡수 스펙트럼. 감산 계수 0.87은 3,700-3,000 cm 사이에 강한 수분 흡수를 제거 -1 선택되었다 2,700-1,800 cm-1 사이의 평면 기준을 얻었다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig4highres.jpg" width="500" /> 4.3 M 이온 강도의 버퍼와 재수 후 BR의 그림 4. 흡수 스펙트럼 (버퍼 흡수는 그림 3에서와 명확성을 위해 차감되었습니다). 삽입 rehydrat 후 붓기 영화의 진화를 보여줍니다이온 1,541 ㎝ -1에서 아마이드 II 단백질 흡광도 하였다. 하나의 지수에 맞는 12 분의 영화 붓기 안정화를위한 시간 상수를 나타냅니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig5highres.jpg" width="500" /> 전송 (파란색 선)에 의해 측정 ChR2의 수화 필름의 그림 5. 흡수 스펙트럼. 흡광 계수 물 스펙트럼 (점선 오렌지 라인)과 DM (점선 시안 라인) 축소와 (레드 라인)을 차감 하였다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig6highres.jpg" width="500" /> 액체 상태의 물이 25 ° C (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # 스펙트럼)에서와 ADP / ATP 캐리어 (AAC)의 수화 필름 그림 6. 재현 질량 흡광 계수 스펙트럼 (64) . </s<html> trong&gt; 질량 흡광 계수 스펙트럼은 DM (100 ㎎ / ㎖)을위한 솔루션으로 측정, 및 BR을위한 수화 영화 하였다. <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig7highres.jpg" width="500" /> 시간이 해결 스캔 스캔 FT-IR 측정에 사용되는 광학 필터의 그림 7. 투과율. <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig8highres.jpg" width="500" /> .도 8의 Nd 차 고조파 (532 nm의)에 의해 제공되는 레이저 펄스의 태도 :. 1000 레이저 펄스의 상대적인 에너지의 편차의 YAG 레이저 히스토그램과 0.05의 표준 편차를 가진 가우시안 분포에 맞게. 1622/51622fig9highres.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 그림 9. 간격 (녹색, 검은 색, 파란색 선) 간격을 균일 한 번에 세 가지 대표 파수에서 BR의 흡광도 변화를 빛 유도 준 대수 평균 후 ~ 20 점 / 년 (레드 라인). 후 노이즈 감소를 통지 대수 평균은 시간의 진동을 공개하면 밀리 초 범위에서 추적합니다. <img alt="그림 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig10highres.jpg" width="500" /> pH가 7.4 (4 M의 NaCl, 100 mM의 NAPI)에서 ATR에 의해 기록 된 BR을위한 빛에 의한 흡광도의 변화 그림 10. 3D 표현입니다. 다섯 SVD의 구성 요소를 재구성 A) 원 자료. B) 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51622/51622fig10highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 11. L (12.5 마이크로 초)을, M (300 마이크로 초), 및 N (6 밀리 초) 중간이 가장 충실 세 선택한 시간에 BR의 photocycle의 FT-IR 차이 흡수 스펙트럼. <img alt="그림 12" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig12highres.jpg" width="500" /> 시간이 해결 단계 스캔 FT-IR의 차이 분광기에 의해 해결과 BR의 photocycle 그림 12. 양자 전송 및 단백질 백본 역학. 1,762cm -1 Asp85의 양성자 / 탈 양성자 역학 보고서에서와 1천7백41센티미터에서의 흡광도 변화 -1 (300 마이크로 초 전에 H-결합 변경 포함) Asp96의 탈 양성자 / 재 양성자 역학. 1,670에서 시간 추적 및 1,555센티미터 -1펩타이드 골격의 형태에 민감한 두 보고서 아미드 I의 변화와 II 진동. 백 트레이스는 원시 데이터에 대응하고, SVD 처리 된 데이터에 붉은 색이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51622/51622fig12highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 13" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig13highres.jpg" width="500" /> 도 13. BR의 photocycle의 실험적인 시간 분해 스텝 스캔 FT-IR 데이터의 특이 값 분해 (SVD) (도 10a 참조). SVD는 고려 파수에 노이즈 표준 편차 의존성을 가지고 실험 데이터를 계량 한 후에 수행되었다 (그림 15) 57. 전에 설명한 바와 같이,베이스 라인 변동의 통계적 무게를 줄이기 위해 1 차 유도체와 결합) 및 #(160), 제 50 구성 요소 (검은 색 원)의 상대 특이 값의 플롯. 처음 다섯 개의 구성 요소는 구성 요소 (빨간색 원)를 신호에 할당됩니다. 잡음 구성 요소에 대한 기대 지수 등 구성 요소 붕괴의 나머지 부분 (점선 회색 선 참조). B) 첫 여덟 추상적 인 스펙트럼 (U 8 U 1). C) 첫 여덟 추상 시간 흔적 (V 8 V 1). 신호에 할당 된 추상적 인 스펙트럼 및 시간 추적은 붉은 선으로 묘사하고, 그렇지 않으면 검은 색 라인.하는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51622/51622fig13highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 14" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig14highres.jpg" width="500" /> 스텝 검사에 의해 기록 ChR2위한 빛에 의한 IR 흡광도의 변화 그림 14. 3D 표현전송 모드. 단계 스캔 데이터는 photocycle의 일부.) 원시 데이터를 포함하는. B) 다섯 SVD 구성 요소와 재구성 데이터, 125 밀리 초까지 확장합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51622/51622fig14highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 15" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51622/51622fig15highres.jpg" width="500" /> 에서 FT-IR. 차이 흡수 스펙트럼 그림 15. 예상 소음 6.25 마이크로 초 시간 8 ㎝ -1 1 co-addition/mirror 위치 (500 광 반응) 또는 ~ 200 co-addition/mirror 위치를 포함하는 실험에 대한 스펙트럼 해상도 (10 5 광 반응). 밸류은 감쇠 전반사 (ATR) 및 송신 설정에 나타낸다.

단백질 기능의 주요 단계, 특히 골격 구조 변화와 양성자 전달 반응은 종종 마이크로초에서 밀리초 사이의 시간 척도에서 발생합니다. 이러한 역학 과정은 시간 분해 단계 스캔 푸리에 변환 적외선 분광법으로 연구할 수 있으며, 특히 빛에 의해 기능이 트리거되는 단백질의 경우 연구할 수 있습니다.

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

본 절차의 전반적인 목표는 시간 분해 STEP 스캔 FTIR 분광법을 사용하여 두 가지 광민감성 막 단백질의 양성자화 및 구조 변화 역학을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 수화된 단백질 박막을 형성함으로써 이루어지며, 박테리오옵신(bacteriopsin)의 경우 감쇄 전반사(ATR) 구성으로, 채널로돕신-2(channelrhodopsin-2)의 경우 투과 구성으로 적외선 흡수를 측정합니다. 두 번째 단계는 적절한 파장의 나노초 레이저 플래시로 시료를 여기시켜 단백질 내의 광주기 반응을 유도하고, 시료와 상호작용하는 적외선의 강도 변화를 시간 분해능으로 검출하는 것입니다.다음으로, 두 분할 빔 사이의 광경로차를 조절하는 간섭계의 이동 거울 상에서 서로 다른 지점마다 위 과정을 반복하여 전체 시간 분해 간섭도를 기록합니다. 마지막 단계는 푸리에 변환과 람베르트-베르 법칙을 이용하여 시간 분해 간섭도를 시간 분해 IR 차이 흡수 스펙트럼으로 변환하는 것입니다. 최종적으로, 특히 MI one 및 CO 이중 결합 카복실 영역의 밴드 시간 진화를 분석하여 단백질의 구조적 변화 및 양성자화 역학을 얻습니다.기존의 대부분의 실험 방법론들이 가진 기술적 주된 장점은 단백질의 일시적인 양성자화 변화를 분해하여 관찰할 수 있다는 점입니다. 또한, 이는 단백질의 기능성을 조사하는 데 가장 적절한 시간 범위인 마이크로초 및 밀리초 시간 척도에서 가능합니다. 이 방법은 단백질의 기능적 기전 동안 어떤 잔기가 언제 양성자화되는지, 또는 단백질의 주요 변화가 언제 일어나는지와 같은 분자 생물물리학 및 단백질 과학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.본 실험 절차의 시연은 본 실험실의 연구원 Victor Ria가 진행합니다. 우선, FTIR 분광계의 시료 챔버에 감쇄 전반사(attenuated total reflectance, ATR) 액세서리를 장착하십시오. 일반적인 급속 스캔 FTIR 분광법을 사용하여, 깨끗한 내부 반사 소자 표면의 광범위한 에너지 스펙트럼을 4 cm⁻¹ 분해능으로 측정하십시오. 이후 시료 재수화에 사용할 고이온 강도 완충액 20 µL를 ATR 표면에 도포하십시오.그 다음 완충액의 IR 흡수도를 측정합니다. 이어서 완충액을 제거하고 표면에 닿지 않게 주의하며 물로 헹굽니다. 강한 공기 흐름으로 잔류 액체를 제거한 후, 6 mg/mL 농도의 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin) 단백질 용액 3 µL를 표면 위에 분사합니다.건조 공기를 약하게 불어넣어 단백질 현탁액을 막 형태가 될 때까지 건조합니다. 그런 다음 건조된 막의 흡수 스펙트럼을 측정하십시오. 이어서 고이온강도 완충액 20~40 µL를 조심스럽게 첨가하여 건조된 막을 재수화합니다.수분 증발을 방지하고 흡수 스펙트럼을 측정하기 위해 A TR 홀더를 뚜껑으로 덮습니다. 버퍼의 흡수 스펙트럼을 빼서 필름의 재수화 후 표면 부근에 남아 있는 시료의 백분율을 추정합니다. 이때, 저이온 강도 버퍼에 dec alside로 용해된 channel opsin two 10 µL를 직경 20 mm의 불화바륨 윈도우 중심에 첨가합니다.마이크로 파이펫 팁을 사용하여 용액을 넓게 펴고, 건조한 공기를 완만하게 흘려주어 직경 6~8 mm의 균일한 온열 필름을 형성합니다. 이때 필름의 직경은 최대 조리개에서의 IR 빔 크기와 대략 일치해야 합니다. 다음으로, 두께 1 mm의 평평한 실리콘 O-링을 사용합니다. 글리세롤과 물의 혼합액 3~5 µL를 건조한 필름 주변에 3~5방울로 나누어 첨가하여 필름을 수화시킨 후, 두 번째 윈도우로 단단히 닫습니다.바륨 플로라이드 샌드위치 윈도우를 홀더에 삽입하십시오. 그런 다음 홀더를 시료실에 넣으십시오. 흡수 스펙트럼을 측정하십시오.A TR 설정에서 아미드 I 영역의 최대 흡광도가 0.6에서 1.0 범위 내에 있는지 확인하십시오. A TR 덮개 위에 배치된 광섬유를 사용하여 레이저를 시료에 결합하십시오. 시료에서의 레이저 에너지 밀도를 펄스당 제곱센티미터당 2~3 millijoules로 조정하십시오.전력계 또는 투과 실험을 사용하여 미러로 레이저를 시료로 유도하고, 필요한 경우 렌즈를 사용하여 레이저 빔을 시료 박막 크기보다 약간 큰 직경으로 평행하게 맞추거나 분산시킵니다. Q 스위치를 사용하여 레이저 펄스와 데이터 기록을 동기화합니다. 네오디뮴 첨가 알루미늄 가넷 레이저 전자 장치의 Sync out TTL 펄스를 사용하여 분광계의 아날로그-디지털 변환기를 트리거합니다.시간 분해 측정을 수행하기 위해 레이저의 들뜸 속도를 설정하십시오. 1800에서 850 inverse centimeter 스펙트럼 범위에서 스텝 스캔 측정을 수행합니다. 1,950 inverse centimeter 이상에서는 불투명하고 1800 inverse centimeter 미만에서는 투과율이 좋은 로우패스 광학 필터를 광로에 배치하십시오.그런 다음 검출기를 AC 결합 모드에서 DC 결합 모드로 변경하십시오. 이 시점에서 검출기에 전류 바이어스를 인가하여 인터페로그램(INTERFEROGRAM)의 DC 레벨을 0으로 맞춥니다. 아날로그-디지털 변환기의 동적 범위를 더 효과적으로 활용할 수 있도록 전자적 이득(electronic gain)을 다시 조정하십시오.이후, FTIR 분광계의 스텝 스캔(step scan) 메뉴를 실행하십시오. 스텝 스캔 측정을 위한 대상 스펙트럼 대역폭을 헬륨 네온 레이저 파수의 8분의 1로 설정하십시오. 스펙트럼 및 위상 해상도는 각각 8 cm⁻¹과 64 cm⁻¹로 설정하십시오.appe 함수를 선택하십시오. 그런 다음 INTERFEROGRAM 획득 모드를 single side forward로 설정하십시오. 아날로그-디지털 변환기의 샘플링 속도를 분광계에서 사용 가능한 최고 속도로 설정하십시오.실험 트리거를 외부(external)로 설정하십시오. 그런 다음, 100개의 프리 트리거(pret trigger) 지점을 포함하여 기록할 선형 간격 데이터 포인트 수를 설정하십시오. 다음으로, 거울 위치당 광반응의 코에디션(co editions) 횟수 또는 평균 횟수를 설정하고 실험을 시작하십시오.마지막으로, 박테리아 redsin의 경우 실험을 10회 반복하고, channel redsin 2의 서로 다른 3가지 샘플 필름에 대해 35회 반복하여 거울 위치당 약 200회의 공동 합산(co additions)을 확보합니다. 박테리아 redsin 건조 폼의 흡수 스펙트럼에서는 펩타이드 결합 아미드 진동의 특징적인 밴드를 구분할 수 있습니다. 이온 강도가 낮은 버퍼를 사용하면 필름이 과도하게 팽창하여 소멸장(evanescent field)으로 탐지되는 단백질의 양이 감소합니다. 필름 팽창과 버퍼 이온 강도 사이의 정확한 의존성은 지질의 성질을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다.수화 후 필름 팽창은 박테리아의 도신(dosin)이 안정화될 때까지 시간이 필요합니다. 보라색 막(purple membrane)에서 이 과정은 시정수가 12분인 단일 지수 함수적 특성을 보입니다. 박테리아를 대상으로 한 전형적인 시간 분해 단계 스캔 FDIR 실험의 3D 그래프입니다.여기 Redsin이 표시되어 있습니다. 특정 시점에서 스펙트럼을 추출할 수 있습니다. 예를 들어, 박테리아 redsin 광주기의 중간 상태가 최대 모집단에 도달할 것으로 예상되는 시점 등이 이에 해당합니다.박테리아 로돕신(bacterial rhodopsin)의 광주기 흡광도 변화 시간 추적 곡선에서 1,762 cm⁻¹ 영역은 aspartate 85의 양성자화 및 탈양성자화 역학을 나타내며, 1,741 cm⁻¹ 영역은 수소 결합 변화와 aspartic acid 96의 탈양성자화 및 재양성자화 역학을 나타냅니다. 1,670 및 1,555 cm⁻¹에서의 시간 추적 곡선은 다음과 같습니다.펩타이드 백본 구조에 모두 민감한 MI 1 및 2 진동의 변화를 보고하십시오. 이 방법을 따르면, 단백질 개발 후 특정 잔기에 진동 밴드를 할당하기 위해 부위 특이적 신경 발생이나 망막 효소 분광법과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 분자 생물 물리학 분야의 연구자들이 수많은 다양한 광구동 단백질의 기능적 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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연구

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이 비디오는 푸리에 변환 적외선 분광법을 사용하여 아밀로이드 펩타이드를 베타 시트가 풍부한 초분자 구조로 자체 조립하는 방법을 보여줍니다. 적외선 빔은 굴절률이 높은 결정을 통과하고 결정과 샘플의 계면을 가로지르는 에너지 흡수를 기록합니다. 샘플 단백질의 2차 구조는 적외선 스펙트럼의 특정 영역에서 특징적인 흡수 피크를 분석하여 식별되며, 이는 초분자 어셈블리의 형성을 식별하는 데 도움이 됩니다.

펩타이드 자기 조립을 연구하기 위한 푸리에 변환 적외선 분광법 기술

여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 .

광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

여기, 우리는 프로토콜 3 색 smFRET 데이터 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델의 분석을 제시. 이 방법을 과학자 들은 복잡 한 단백질 시스템, cooperativity 또는 서로 상호 작용을 포함 하 여에서 운동 정보를 추출할 수 있습니다.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

단백질 단백질 상호 작용은 생물 학적 시스템에 대 한 중요 한 고 단백질 복합물의 기능과 역학에 대 한 통찰력을 제공 하는 바인딩 활동의 연구. 형광 공명 에너지 전달 및 중지 흐름 기법을 사용 하 여 복잡 한 단백질의 운동 매개 변수를 수량화 하는 방법을 설명 합니다.

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

펨토초 시간 해결에 대한 신호 생성 및 최적화, 측정, 데이터 수집 및 데이터 처리에 대한 세부 정보가 설명되어 있습니다. 톨루엔에서 β-카로틴의 흥분 상태 역학에 대한 근적외선 자극 라만 연구가 대표적인 응용 분야로 나타났다.

기능성 π-컨쥬게이트 시스템의 초고속 시간 해결 근거리 자극 라만 측정

단백질의 빠른 광화학 산화는 단백질의 구조적 특성화를 위한 새로운 기술입니다. 다른 용매 첨가제와 리간드는 다양한 하이드록실 라디칼 청소 특성을 가지고 있습니다. 상이한 조건에서 단백질 구조를 비교하기 위해서는 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼의 실시간 보상이 반응 조건을 정상화하는 데 요구된다.

단백질 지형 변화의 측정을 위한 단백질의 빠른 광화학 산화에 실시간 보상 가능하게

본 프로토콜은 인간 건강에 중요한 역할을 하는 두 모델 단백질의 구조 및 역학을 조사하는 방법을 기술한다. 이 기술은 벤치 탑 생물 물리학 적 특성화와 중성자 스핀 에코 분광법을 결합하여 단백질 간 운동과 관련된 시간 및 길이 스케일의 역학에 액세스합니다.

중성자 스핀 에코 분광법을 통한 단백질 역학 연구

시간 해결된 단일 분자 단백질 유도 형광 향상은 단백질의 국소 구조적 변화에 민감한 유용한 형광 분광 근접 센서이다. 여기서 우리는 그렇지 않으면 구형비정형및 불안정으로 알려진 α-시뉴클레인에서 안정적인 지역 적합성을 발견하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

핵 자기 공명(NMR) 분광법은 잔류물 특이적 방식으로 구조적 단백질 역학을 특성화할 수 있습니다. 당사는 피코초에서 나노초의 시간 척도에 민감한 NMR 15NR1 및 R2 이완 및 {1H}-15N 이종 핵 오버하우저 효과(hetNOE) 실험을 기록하기 위한 실습 프로토콜을 제공합니다.

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험

학습하세요 감광성 막 단백질의 양성자 이동과 입체 구조 역학을 시간 분해 적외선 분광법으로 분석하는 방법을 배우세요. 이 기법은 미세초에서 밀리초 시간 척도에서 단백질 기능을 관찰하여 분자 생물물리학 연구에 활용됩니다.

에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

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에 의해 감광성 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔