에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

이 절차의 전반적인 목표는 시간 분해 STEP 스캔 FTIR 분광법 오스코피를 사용하여 두 개의 감광성 막 단백질의 양성자화 및 확인 변화의 역학을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 수화 단백질 필름을 형성하여 수행되며, 이 필름의 적외선 흡수는 박테리아 옵신에 대한 감쇠 전반사 구성 또는 채널 로댕 2에 대한 투과 구성에서 프로브됩니다. 두 번째 단계는 적절한 파장의 나노초 레이저 플래시로 샘플을 여기시켜 단백질에서 광순환 반응을 시작하여 샘플과 상호 작용하는 적외선 강도의 변화를 감지

다음으로, 위의 프로세스는 완전한 시간 분해 간섭계가 기록될 때까지 두 분할 빔 사이의 광학 경로 차이를 제어하는 간섭계의 모바일 미러의 불분명한 위치에서 반복됩니다. 마지막 단계는 푸리에 변환(Fourier transform)과 램버트(Lambert) 맥주 법칙을 사용하여 시간 분해 인터페로그램을 시간 분해 IR 차이 흡수 스펙트럼으로 변환하는 것입니다. 궁극적으로, 특히 MI one 및 CO 이중 결합 카르복실산 영역에서 bans의 시간 진화를 검사하여 단백질의 확인 및 양성자화 변화의 역학을 얻습니다.

가장 현존하는 실험 방법의 기술의 주요 장점은 단백질의 일시적인 양성자화 변화를 해결한다는 것입니다. 또한 단백질 기능을 조사하는 데 가장 관련성이 높은 시간 범위인 마이크로 및 밀리초 시간 척도에서 이를 수행합니다. 이 방법은 분자 생물 물리학 및 단백질 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 어떤 잔기가 양성자화되는지, 그리고 단백질의 기능적 메커니즘 중 또는 단백질의 주요 변화가 언제 발생하는지와 같은 경우에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

절차를 시연하는 것은 제 실험실의 Victor Ria 연구원이 수행합니다 첫 번째 마운트, 감쇠 총 반사율 또는 TR 액세서리를 FTIR 분광계의 시료 격실에 넣습니다. 4cm의 역센티미터에서 광범위한 에너지 스펙트럼을 측정합니다. 기존의 고속 스캔 FTIR 분광법에 의한 깨끗한 내부 반사 소자 표면의 해상도는 A TR의 표면을 나중에 샘플을 재수화하는 데 사용되는 20마이크로리터의 높은 이온 강도 버퍼로 덮습니다.

그런 다음 버퍼의 IR 흡수를 측정합니다. 그런 다음 버퍼를 제거하고 표면을 만지지 않고 물로 헹굽니다. 강렬한 기류에 의해 잔류 액체를 제거하십시오, 약 3 마이크로 리터, 밀리리터 당 6 밀리그램의 단백질 용액을 퍼뜨리고, 박테리아 로댕의 단백질 용액을 표면 위에 자주색 막으로 퍼뜨립니다.

필름이 얻어질 때까지 부드러운 건조 공기 흐름에서 단백질 현탁액을 건조시킵니다. 그런 다음 건조 필름의 흡수 스펙트럼을 측정합니다. 그런 다음 20-40 마이크로 리터의 높은 이온 강도 완충액을 부드럽게 첨가하여 건조 필름을 재수화합니다.

A TR 홀더를 뚜껑으로 덮어 수분 증발 측정 및 흡수 스펙트럼을 방지합니다. 완충액의 흡수 스펙트럼을 빼서 필름을 재수화한 후 표면 근처에 남아 있는 샘플의 비율을 추정합니다. 이 시점에서 10 μm의 채널 옵신 2를 20mm 직경의 불화 바륨 창 중앙에있는 낮은 이온 강도 완충액에 10 μl의 채널 옵신 2를 첨가합니다.

가장 큰 조리개에서 IR 빔의 크기와 대략 일치하는 직경을 가진 건조한 공기, 따뜻하고 균일한 필름의 부드러운 흐름을 사용하여 마이크로 피펫 팁을 사용하여 용액을 6-8mm 직경으로 펴십시오. 다음으로 1mm 두께의 평평한 실리콘 O-링을 사용합니다. 드라이 필름 주위에 3-5방울 떨어뜨려 분포된 글리세롤과 물의 혼합물 3-5마이크로리터를 추가하여 필름을 수화하고 두 번째 창으로 단단히 닫습니다.

불화바륨이 끼워진 창을 홀더에 삽입합니다. 그런 다음 홀더를 샘플 격실에 놓습니다. 흡수 스펙트럼을 측정합니다.

아미드 한 영역의 최대 흡수가 A TR 설정의 경우 0.6에서 1.0 범위인지 확인합니다. A TR 뚜껑 위에 놓인 광섬유를 사용하여 레이저를 샘플에 연결합니다. 샘플에서 레이저의 에너지 밀도를 펄스당 평방 센티미터당 2-3밀리줄로 조정합니다.

파워 미터 또는 투과 실험을 사용하여 미러를 사용하여 레이저를 샘플로 가져오고, 필요한 경우 렌즈를 사용하여 레이저 빔을 샘플 필름 크기보다 약간 높은 직경으로 정렬하거나 전환합니다. Q 스위치를 사용하여 레이저 펄스를 데이터 기록과 동기화합니다. 네오디뮴 도프 아트리움 알루미늄 가넷 레이저의 전자 장치의 TTL 펄스를 동기화하여 분광계 아날로그-디지털 변환기를 트리거합니다.

분해능 시간을 수행할 레이저의 여기율을 설정합니다. 1800 - 850 센티미터 역의 스펙트럼 범위에서 스텝 스캔 측정. 1, 950 inverse centimeters 이상의 불투명한 optical path와 1800 inverse centimeters 미만의 양호한 투과율을 가진 optical path에 lowpass optical filter를 배치하십시오.

그런 다음 감지기를 AC에서 DC 결합 모드로 변경합니다. 이 시점에서 검출기에 전류 바이어스를 적용하여 INTERFEROGRAM의 DC 레벨을 0으로 만듭니다. 아날로그-디지털 변환기의 다이내믹 레인지를 더 잘 활용하기 위해 전자 게인을 다시 조정하십시오.

그런 다음 FTIR 분광계의 단계 스캔 메뉴를 시작합니다. 스텝 스캔 측정을 위한 목표 스펙트럼 대역폭을 헬륨 네온 레이저 파수의 1/8로 설정합니다. 스펙트럼 분해능과 위상 분해능을 각각 8cm와 64cm로 설정합니다.

appe 함수를 선택합니다. 그런 다음 INTERFEROGRAM 획득 모드를 단면 전방으로 설정합니다. 아날로그-디지털 변환기의 샘플링 속도를 분광계에서 사용 가능한 가장 높은 값으로 설정합니다.

실험 트리거를 외부로 설정합니다. 그런 다음 100개의 pret 트리거 포인트를 포함하여 기록할 선형 간격의 데이터 포인트 수를 설정합니다. 다음으로, 미러 위치당 광 반응의 공동 에디션 수 또는 평균 수를 설정하고 실험을 시작합니다.

마지막으로, 박테리아, redsin에 대해 10 회, 채널 redsin 2에 대한 3 개의 다른 샘플 필름에서 35 회 실험을 반복하여 미러 위치 당 약 200 개의 co를 첨가합니다 펩타이드 결합 amite 진동의 특성 금지는 박테리아 redsin dry foam absorption spectrum에서 구별 할 수 있습니다. 낮은 이온 강도 완충액을 사용할 때 필름이 과도하게 팽창하여 소실장에 의해 조사되는 단백질의 양이 감소합니다. 필름 팽창과 완충 이온 강도 사이의 정확한 의존성은 다른 요인들 중에서도 지질의 특성에 따라 달라집니다.

수화 후 필름 팽창은 도신의 박테리아에 대한 안정화에 도달하는 데 시간이 필요합니다. 보라색 멤브레인에서 프로세스는 시간 상수가 12분인 모노 지수입니다. 일반적인 시간 분해 단계 스캔, 박테리아에 대한 FDIR 실험의 3D 플롯.

Redsin이 여기에 표시됩니다. 스펙트럼은 특정 시간에 추출할 수 있습니다. 예를 들어, 박테리아 redsin 사진 주기의 중간 상태가 가장 높은 개체군에 도달할 것으로 예상되는 경우입니다.

박테리아 막대 Dossin 사진에서 사이클 시간 1, 762 센티미터의 역센티미터에서 흡광도 변화의 흔적. 수소 결합 변화와 아스파르트산의 탈양성자화 재현 국가 역학에 대한 아스파르테이트 85 및 1, 741 역센티미터의 양성자화 탈양성자 역학에 대해 보고합니다.96. 시간은 1, 670 및 1, 555 역 센티미터에서 추적됩니다.

MI 1 및 2 진동의 변화에 대해 보고하며, 둘 다 펩타이드 골격 확인에 민감합니다. 이 방법에 따라, 부위 지시 신경 발생 또는 망막 효소 분광법과 같은 다른 기술을 수행하여 개발 후 단백질의 특정 잔류물에 진동 대역을 할당할 수 있습니다. 이 기술은 분자 생물 물리학 분야의 연구자들이 다양한 빛 기반 단백질의 기능적 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.