에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

본 절차의 전반적인 목표는 시간 분해 STEP 스캔 FTIR 분광법을 사용하여 두 가지 광민감성 막 단백질의 양성자화 및 구조 변화 역학을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 수화된 단백질 박막을 형성함으로써 이루어지며, 박테리오옵신(bacteriopsin)의 경우 감쇄 전반사(ATR) 구성으로, 채널로돕신-2(channelrhodopsin-2)의 경우 투과 구성으로 적외선 흡수를 측정합니다. 두 번째 단계는 적절한 파장의 나노초 레이저 플래시로 시료를 여기시켜 단백질 내의 광주기 반응을 유도하고, 시료와 상호작용하는 적외선의 강도 변화를 시간 분해능으로 검출하는 것입니다.

다음으로, 두 분할 빔 사이의 광경로차를 조절하는 간섭계의 이동 거울 상에서 서로 다른 지점마다 위 과정을 반복하여 전체 시간 분해 간섭도를 기록합니다. 마지막 단계는 푸리에 변환과 람베르트-베르 법칙을 이용하여 시간 분해 간섭도를 시간 분해 IR 차이 흡수 스펙트럼으로 변환하는 것입니다. 최종적으로, 특히 MI one 및 CO 이중 결합 카복실 영역의 밴드 시간 진화를 분석하여 단백질의 구조적 변화 및 양성자화 역학을 얻습니다.

기존의 대부분의 실험 방법론들이 가진 기술적 주된 장점은 단백질의 일시적인 양성자화 변화를 분해하여 관찰할 수 있다는 점입니다. 또한, 이는 단백질의 기능성을 조사하는 데 가장 적절한 시간 범위인 마이크로초 및 밀리초 시간 척도에서 가능합니다. 이 방법은 단백질의 기능적 기전 동안 어떤 잔기가 언제 양성자화되는지, 또는 단백질의 주요 변화가 언제 일어나는지와 같은 분자 생물물리학 및 단백질 과학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

본 실험 절차의 시연은 본 실험실의 연구원 Victor Ria가 진행합니다. 우선, FTIR 분광계의 시료 챔버에 감쇄 전반사(attenuated total reflectance, ATR) 액세서리를 장착하십시오. 일반적인 급속 스캔 FTIR 분광법을 사용하여, 깨끗한 내부 반사 소자 표면의 광범위한 에너지 스펙트럼을 4 cm⁻¹ 분해능으로 측정하십시오. 이후 시료 재수화에 사용할 고이온 강도 완충액 20 µL를 ATR 표면에 도포하십시오.

그 다음 완충액의 IR 흡수도를 측정합니다. 이어서 완충액을 제거하고 표면에 닿지 않게 주의하며 물로 헹굽니다. 강한 공기 흐름으로 잔류 액체를 제거한 후, 6 mg/mL 농도의 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin) 단백질 용액 3 µL를 표면 위에 분사합니다.

건조 공기를 약하게 불어넣어 단백질 현탁액을 막 형태가 될 때까지 건조합니다. 그런 다음 건조된 막의 흡수 스펙트럼을 측정하십시오. 이어서 고이온강도 완충액 20~40 µL를 조심스럽게 첨가하여 건조된 막을 재수화합니다.

수분 증발을 방지하고 흡수 스펙트럼을 측정하기 위해 A TR 홀더를 뚜껑으로 덮습니다. 버퍼의 흡수 스펙트럼을 빼서 필름의 재수화 후 표면 부근에 남아 있는 시료의 백분율을 추정합니다. 이때, 저이온 강도 버퍼에 dec alside로 용해된 channel opsin two 10 µL를 직경 20 mm의 불화바륨 윈도우 중심에 첨가합니다.

마이크로 파이펫 팁을 사용하여 용액을 넓게 펴고, 건조한 공기를 완만하게 흘려주어 직경 6~8 mm의 균일한 온열 필름을 형성합니다. 이때 필름의 직경은 최대 조리개에서의 IR 빔 크기와 대략 일치해야 합니다. 다음으로, 두께 1 mm의 평평한 실리콘 O-링을 사용합니다. 글리세롤과 물의 혼합액 3~5 µL를 건조한 필름 주변에 3~5방울로 나누어 첨가하여 필름을 수화시킨 후, 두 번째 윈도우로 단단히 닫습니다.

바륨 플로라이드 샌드위치 윈도우를 홀더에 삽입하십시오. 그런 다음 홀더를 시료실에 넣으십시오. 흡수 스펙트럼을 측정하십시오.

A TR 설정에서 아미드 I 영역의 최대 흡광도가 0.6에서 1.0 범위 내에 있는지 확인하십시오. A TR 덮개 위에 배치된 광섬유를 사용하여 레이저를 시료에 결합하십시오. 시료에서의 레이저 에너지 밀도를 펄스당 제곱센티미터당 2~3 millijoules로 조정하십시오.

전력계 또는 투과 실험을 사용하여 미러로 레이저를 시료로 유도하고, 필요한 경우 렌즈를 사용하여 레이저 빔을 시료 박막 크기보다 약간 큰 직경으로 평행하게 맞추거나 분산시킵니다. Q 스위치를 사용하여 레이저 펄스와 데이터 기록을 동기화합니다. 네오디뮴 첨가 알루미늄 가넷 레이저 전자 장치의 Sync out TTL 펄스를 사용하여 분광계의 아날로그-디지털 변환기를 트리거합니다.

시간 분해 측정을 수행하기 위해 레이저의 들뜸 속도를 설정하십시오. 1800에서 850 inverse centimeter 스펙트럼 범위에서 스텝 스캔 측정을 수행합니다. 1,950 inverse centimeter 이상에서는 불투명하고 1800 inverse centimeter 미만에서는 투과율이 좋은 로우패스 광학 필터를 광로에 배치하십시오.

그런 다음 검출기를 AC 결합 모드에서 DC 결합 모드로 변경하십시오. 이 시점에서 검출기에 전류 바이어스를 인가하여 인터페로그램(INTERFEROGRAM)의 DC 레벨을 0으로 맞춥니다. 아날로그-디지털 변환기의 동적 범위를 더 효과적으로 활용할 수 있도록 전자적 이득(electronic gain)을 다시 조정하십시오.

이후, FTIR 분광계의 스텝 스캔(step scan) 메뉴를 실행하십시오. 스텝 스캔 측정을 위한 대상 스펙트럼 대역폭을 헬륨 네온 레이저 파수의 8분의 1로 설정하십시오. 스펙트럼 및 위상 해상도는 각각 8 cm⁻¹과 64 cm⁻¹로 설정하십시오.

appe 함수를 선택하십시오. 그런 다음 INTERFEROGRAM 획득 모드를 single side forward로 설정하십시오. 아날로그-디지털 변환기의 샘플링 속도를 분광계에서 사용 가능한 최고 속도로 설정하십시오.

실험 트리거를 외부(external)로 설정하십시오. 그런 다음, 100개의 프리 트리거(pret trigger) 지점을 포함하여 기록할 선형 간격 데이터 포인트 수를 설정하십시오. 다음으로, 거울 위치당 광반응의 코에디션(co editions) 횟수 또는 평균 횟수를 설정하고 실험을 시작하십시오.

마지막으로, 박테리아 redsin의 경우 실험을 10회 반복하고, channel redsin 2의 서로 다른 3가지 샘플 필름에 대해 35회 반복하여 거울 위치당 약 200회의 공동 합산(co additions)을 확보합니다. 박테리아 redsin 건조 폼의 흡수 스펙트럼에서는 펩타이드 결합 아미드 진동의 특징적인 밴드를 구분할 수 있습니다. 이온 강도가 낮은 버퍼를 사용하면 필름이 과도하게 팽창하여 소멸장(evanescent field)으로 탐지되는 단백질의 양이 감소합니다. 필름 팽창과 버퍼 이온 강도 사이의 정확한 의존성은 지질의 성질을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다.

수화 후 필름 팽창은 박테리아의 도신(dosin)이 안정화될 때까지 시간이 필요합니다. 보라색 막(purple membrane)에서 이 과정은 시정수가 12분인 단일 지수 함수적 특성을 보입니다. 박테리아를 대상으로 한 전형적인 시간 분해 단계 스캔 FDIR 실험의 3D 그래프입니다.

여기 Redsin이 표시되어 있습니다. 특정 시점에서 스펙트럼을 추출할 수 있습니다. 예를 들어, 박테리아 redsin 광주기의 중간 상태가 최대 모집단에 도달할 것으로 예상되는 시점 등이 이에 해당합니다.

박테리아 로돕신(bacterial rhodopsin)의 광주기 흡광도 변화 시간 추적 곡선에서 1,762 cm⁻¹ 영역은 aspartate 85의 양성자화 및 탈양성자화 역학을 나타내며, 1,741 cm⁻¹ 영역은 수소 결합 변화와 aspartic acid 96의 탈양성자화 및 재양성자화 역학을 나타냅니다. 1,670 및 1,555 cm⁻¹에서의 시간 추적 곡선은 다음과 같습니다.

펩타이드 백본 구조에 모두 민감한 MI 1 및 2 진동의 변화를 보고하십시오. 이 방법을 따르면, 단백질 개발 후 특정 잔기에 진동 밴드를 할당하기 위해 부위 특이적 신경 발생이나 망막 효소 분광법과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 분자 생물 물리학 분야의 연구자들이 수많은 다양한 광구동 단백질의 기능적 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.