방법은 자발적인 특성화 및 놀라게 유도 로코을의 로테 논에 의한 파킨슨 병 모델에서합니다 초파리

다음 실험의 전반적인 목표는 초파리의 로테논 유도 파킨슨병 모델에서 놀람 유도 및 장기 자발적 운동을 결정하는 것이며, 이는 표현형을 유도하기 위해 로테논 보충 식품에서 초파리를 사육함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 파리는 놀람 반응 분석법과 이중 바이알 장치 및 장기 자발적 운동 분석을 받습니다. 초파리 활동 모니터(drosophila activity monitor)의 결과는, 로테논에 대한 노출이 깜짝 놀람과 장기간의 자발적 운동의 정량화에 기초하여 초파리의 운동 결함을 유발한다는 것을 보여줍니다.

이러한 방법은 초파리 분야의 주요 질문, 놀람 유도 운동 결함 및 장기 자발적 운동과 같은 신경 퇴행성 및 운동 장애 모델에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 인스턴트 초파리 배지 1.5g을 추가합니다. 표준 플라이 바이알에서 적절한 로테논 용량을 함유한 5ml의 탈이온수로 배지를 구성합니다.

다음으로 진정제, 생후 1일에서 3일 된 8-12마리의 수컷 파리를 이산화탄소를 사용하여 약물이 들어 있는 바이알로 운반합니다. 보충된 음식은 파리가 바이알을 수평 위치에 두고 20분 동안 진정제에서 회복할 수 있도록 합니다. 그런 다음 실험의 나머지 기간 동안 섭씨 25도의 12시간 라이트 다크 인큐베이터에 바이알을 똑바로 세웁니다.

다음으로, 표준 플라이 바이알을 다른 바이알 위에 뒤집고 이음새를 테이프로 밀봉하여 이중 바이알 장치를 만듭니다. 그런 다음 이중 바이알을 6.33cm의 동일한 세 부분으로 나누고 바이알 주위에 영구 마커로 원을 표시합니다. 약물에 노출된 지 3일이 지나면 이송이 이중 바이알 장치로 날아갑니다.

솔기 위의 테이프를 교체하면 파리가 15분 동안 새로운 환경에 적응할 수 있습니다. 그런 다음 바이알을 흰색 배경에 놓고 디지털 카메라를 설정합니다. 전체 장치가 단일 액자에 표시되고 이중 바이알 장치와 타이머가 시야에 있고 모든 파리에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다.

카메라와 바이알의 위치를 표시하여 임상시험 간 프레임을 일관되게 유지하고 카메라 뷰에 임상시험 번호와 약물 치료를 명확하게 표시합니다. 그런 다음 이중 바이알 장치를 조리대에 세 번 단단히 두드리고 모든 파리가 바이알 바닥으로 떨어지도록 하고 즉시 타이머를 시작합니다. 1분 동안 5초마다 장치의 사진을 찍습니다.

그런 다음 파리가 1분 동안 방해받지 않고 회복하도록 합니다. 각 시도 사이에 1분의 회복 시간으로 분석을 두 번 더 반복합니다. 사진을 검토하고 시간 경과에 따른 각 섹션의 파리 수를 기록하여 계산을 통해 15ml의 탈이온수와 적절한 로테논 용량이 포함된 배지인 3g의 인스턴트 OPH를 재구성합니다.

5분 후, 투명한 바이알에 튜브를 수직으로 조심스럽게 넣고 튜브를 비틀어 단단한 음식을 1cm 높이로 넣습니다. 그런 다음 튜브 끝에 있는 플라스틱 캡을 부드럽게 밀어 기포 진정제가 생성되지 않도록 합니다. 어느 날 생후 수컷이 이산화탄소를 가지고 날아다니며 붓으로 각 튜브에 파리 한 마리를 조심스럽게 삽입합니다.

그런 다음 튜브 끝을 작은 면봉으로 막습니다. 튜브를 수평 위치에 두고 파리가 이산화탄소에서 회복할 때까지 15분 동안 하고 모든 파리가 살아 있고 활동적인지 확인합니다. 튜브를 초파리 활동 모니터 또는 DAM에 삽입하고 모든 튜브가 DAM에 대해 동일한 위치에 있는지 확인합니다.

DAM을 섭씨 12도의 25시간 라이트 다크 인큐베이터에 넣습니다. 그런 다음 DAM을 데이터 수집 시스템에 연결합니다. 그런 다음 기본 설정에서 DAM 소프트웨어를 엽니다.

10분 길이의 빈 길이를 선택하고 데이터 수집을 시작하고 프로그램이 7일 동안 데이터를 수집하도록 허용합니다. 그런 다음 DAM 파일 스캔 프로그램을 열고 입력 데이터 선택을 클릭하여 모니터 데이터에 액세스합니다. 그런 다음 적절한 모니터 범위를 선택하고 빈 길이를 10분 간격으로 설정합니다.

다음으로 출력 파일 형식에서 채널 파일을 선택하고 다른 모든 옵션은 기본값으로 둡니다. 그런 다음 데이터 스캔을 클릭하고 지정된 폴더에 파일을 저장합니다. 마지막으로, 데이터를 일주기 데이터 분석 소프트웨어로 가져와 분당 카운트를 얻습니다.

3일 동안 다양한 용량의 루몬 야생형에 노출된 후, 증가된 용량에 노출된 광둥의 파리는 놀람 반응의 결핍을 보였다. 30초 후 장치의 상단 부분에 파리의 비율이 더 낮고 하단 부분에 더 높은 비율이 있었는데, 이는 saral 반응의 결핍을 나타내며, 자발적 운동 분석에서 파리에 대해서도 유사한 추세가 나타났습니다. 분당 개수는 초파리 활동 모니터 또는 DAM에서 측정되었습니다.

노출 후 4일째에 250마이크로몰과 500마이크로몰의 로테논에 노출된 파리는 분당 카운트가 크게 감소합니다. 이러한 분석은 질병의 다른 식도 모델에서 운동 결함과 치료제의 효능을 특성화하는 데 편리하게 적용할 수 있습니다.