Name: 결합 된 DNA-RNA 형광 현장에서 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: 배우세요 DNA-RNA 형광 현장 하이브리드화(FISH)를 이용하여 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체 불활성화를 연구하는 방법입니다. 이 기술은 동일한 시료에서 RNA와 DNA를 동시에 검출하여 유전자 조절 메커니즘을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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저자는 지난 몇 년 동안 유용하고 고무적인 토론을 해준 Erasmus MC의 복제 및 개발 부서의 전현직 구성원 모두에게 감사드립니다. 또한 유용한 피드백을 제공해 주신 세 명의 익명의 검토자에게도 감사드립니다. 그리브나우 실험실에서의 연구는 네덜란드 연구 위원회(NWO-VICI)의 자금 지원과 ERC 시작 보조금으로 지원됩니다.

1. 여성 배아 줄기 세포의 분화 유도 X 염색체의 불 활성화를 유도하기 위해 참고 : 여성 마우스 배아 줄기 세포 (요청시 제공)을 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)로 코팅 된 호화 배양 접시에 표준 ES 세포 조건에서 재배하고 있습니다. 우리는 여기에서 독자가 표준 세포 배양 기술에 39-41을 잘 알고 있다고 가정합니다. 분화를 유도하기 위하여, T25 접시에서 성장 ES 세포는 MEFs에서 분리되고, 분화 배지에서 도금 될 것이다. <ol><li> ES 세포 배양에서 ES 매체를 제거하고 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다. </li><li> 1.5 ML 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (37 ° C에서 미리 예열) 추가하고 7 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 5 분 후, 식민지를 깨고 부드럽게 요리를 흔들. </li><li> 세포 분화 배지 3.5 ㎖를 첨가하여 트립신-EDTA를 비활성화. 피펫 세포 상하 단일 세포 용액을 수득하고, 수집15 ML 튜브에. 200 XG에 5 분 동안 회전, 분화 매체의 10 ML에있는 세포를 수집합니다. </li><li> 비 젤라틴 화 배양 접시에 세포 현탁액을 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 : ES 세포 현탁액에 남아 반면 MEFs는, 비 젤라틴 화 배양 접시에 부착 할 수 있습니다. </li><li> 한편, 6 - 웰 플레이트에 멸균 유리 커버 슬립 (24 X 24mm)를 추가 0.2 % 젤라틴을 추가하고, 상온에서 최소 5 분 동안 품어. </li><li> 1 시간 후, 주로 비 접착 ES 세포로 구성되는, 사전 도금 ES 세포 배양의 상층 액을 수집합니다. 커버 슬립을 포함 6 - 웰 플레이트에 플레이트 ES 세포. 참고 : 사용 ⅙ 6 잘 플레이트의 6 우물 합류 T25 접시의 일. 이 잘 분화의 3 일 후에 합류 차별화 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다. 더 이상 차별화 시간 코스, 세균 요리에 차별화 매체 접시 사전 도금 ES 세포와 incub에 대한세포 배양 인큐베이터에 통합 된 세포의 진탕 먹었다. 이 세포는 1-2 일 전에 고정으로 커버 슬립으로 도금 될 수 배아 체를 형성하도록 허용 할 것이다. </li></ol> 이후 DNA-RNA의 FISH 분석을위한 차별화 된 ES 세포의 2. 고정 <ol><li> 차별 문화에서 차별화 매체를 제거하고 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다. 참고 : 세포가 씻겨지지 않도록 조심스럽게 PBS를 추가합니다. </li><li> 세포 배양 PBS를 제거하고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) / PBS를 첨가하여 세포를 고정하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다. 주의 : PFA는 독성과 흡입하거나 피부 나 눈에 접촉 될 때 중요한 건강 위험을 일으킬 수 있습니다. 또한, PFA는 발암 물질이다. </li><li> 4 % PFA / PBS를 제거하고 70 % 에탄올로 커버 슬립 배 씻는다. 주 : PFA의 흔적 후속 FISH 단계에 방해가되므로 올바른 세척이 중요합니다. 커버 슬립 전에 F에 몇 개월 -20 ° C에서 70 % 에탄올에 저장 될 수있다ISH 분석. </li></ol> FISH 실험에 대한 DNA 프로브의 3. 레이블 참고 : 관심의 유전자 (최소 길이&gt; RNA FISH, 또는&gt; DNA의 물고기를 20킬로바이트 2 KB), 또는 관심있는 유전자를 포함하는 BAC의 DNA 조각을 얻습니다. 대부분의 전사가 동시에 검출 할 수있는 여러 사본에 원인이되므로 RNA 검출을 위해, 작은 프로브, DNA 검출에 비해 충분히 할 수 있습니다. 단일 복사본 DNA 가닥의 강한 신호에 대해서, 더 긴 프로브 혼입 합텐의 충분한 수를 검출 할 수 있도록 요구된다. 바람직하게, 비 - 전사 된 게놈 영역은 DNA 프로브를 설계를 위해 선택된다. RNA를 검출하기 위하여 더 작은 프로브를 사용할 때, 이는이 완전히 배제 할 수는 없지만 RNA가 전사되는 게놈 로커스 결합 DNA-RNA의 FISH 방법으로 검출되는 것을 방지 할 것이다. 마우스 XIST을 검출하기 위해, 5.5 킬로바이트 된 cDNA 프로브를 사용 하였다. DET에 대한X 염색체의 ection 여러 BAC 프로브가 사용될 수있다. 좋은 결과는 XIST의 현장 가까이에있는 BAC RP23-100E1 및 BAC CT7-474E4의 혼합물로 얻어졌다. 관심의 유전자 또는 염색체에 따라 여러 가지 프로브는 최적의 결과를 얻기 위해 필요할 수 있습니다. , RNA-FISH에 사용되는 재료로 작업 깨끗한 환경에서 살균 필터 팁, 이는 RNAse 무료로 H 2 O 및 작업을 사용할 때마다. <ol><li> DNA 1 μg을 16 μL의 총 부피에 H 2 O에서 희석. 4 제닌 ㎕의 또는 비오틴 라벨링 솔루션 (시약 참조) 추가 소용돌이로 교반하여 혼합하고 90 분 동안 16 ° C에서 알을 품다. 참고 : 비타민 B 복합체 또는 제닌 표지 뉴클레오티드 지금 흠 번역에 의해 통합됩니다. </li><li> 한편, 비 통합 세포핵을 제거하기 위해 G50의 열을 준비합니다. , 2 ML의 주사기를 타고 스탬퍼을 제거하고 주사기로 멸균면을 추가합니다. 솔루션 t에서 G50 공 추가O 1 분 642 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 주사기를 배치, 주사기를 채우십시오. 참고 : 주사기의 약 80 %가 현재 G50로 가득해야합니다. 이하 G50이 존재하는 경우 반복합니다. </li><li> 90 분 후, 닉 - 번역 반응 혼합물을 H 2 O의 40 μL를 추가 한 G50 컬럼에 반응을 추가한다. 열에서 빈 튜브를 추가하고 2 분 642 XG에 원심 분리기. 반응 튜브를 통하여 흐름을 수집한다. </li><li> 펫을 통해 흐름의 양을 측정하고, 200 μL의 총 볼륨에 도달하는 H 2 O를 추가합니다. 13.3 μL 연어 정자 DNA (10 ㎎ / ㎖), 13.3 μL 효모의 tRNA (10 ㎎ / ㎖), 26.7 μL 마우스 침대-1 DNA (1 ㎎ / ㎖) 28 ㎕의 2 M NaAc, 산도를 추가를 통해 흐름을 침전 5.6. 소용돌이로 교반하여 혼합하고, 533 ㎕의 얼음에게 차가운 100 % 에탄올을 추가합니다. 4 ℃에서 30 분 동안 16,200 XG에서 튜브와 원심 분리기를 흔들어 </li><li> 뜨는을 제거하고 70 % 에탄올로 두 번 펠릿 씻는다. 5 분에 대한 16,200 XG에 원심 분리기4 ° C, 공기 펠렛을 건조. 50 + 하이브리드 솔루션의 50 μl를 추가하고 용해를 촉진하기 위해 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 참고 : 레이블이 프로브는 -20 ℃에서 몇 년 동안 저장 될 수있다 주의 : 50 + 하이브리드 솔루션, 독성, 피부, 눈과 호흡기에 자극을 줄 수 있으며, 또한 기형이다 포름 아미드가 포함되어 있습니다. </li></ol> 4. Permeabilization, 결합 DNA-RNA 물고기를 고정 세포의 전처리 및 하이브리드 <ol><li> 70 % 에탄올 및 10 - 웰 플레이트에 세포 배양 PBS의 첨가를 제거하여, 커버 슬립에 고정 된 세포를 재수. 5 분 동안 품어. 총 세 번 반복합니다. </li><li> 세포 배양 PBS를 제거하고 세포를 투과하는, 6 - 웰 플레이트에 0.2 %의 펩신을 추가합니다. 4 분 동안 37 ° C에서의 물을 욕조에 6 - 웰 플레이트를 품어. 펩신을 제거하고, 이는 RNAse 무료로 H 2 O와 비활성화 </li><li> 실온에서 5 분 동안 4 % PFA / PBS와 함께 배양하여 사후 수정 세포. fixati 후에, 5 분 동안 세포 배양 PBS로 두 번 세척한다. </li><li> 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올로 배양하여 세포를 탈수. 전송 6 - 웰 플레이트 밖으로 커버 슬립, 그리고 몇 분 동안 공기 건조 커버 슬립. </li><li> 열 접시에 1 시간 동안 65 ° C에서의 coverslips을 배양하여 나이 세포. </li><li> 분석 할 수있는 모든 coverslip을 함께 추가하여 마우스 침대-1 DNA와 FISH 프로브를 사전 하이브리드, 50 + 하이브리드 솔루션, 0.5 ㎕의 마우스 침대-1 DNA, 비오틴 표지 XIST 프로브의 1 μL와 제닌의 1 μL의 25 μL X 염색체를 검출하는 표시 BAC 프로브. 소용돌이로 교반하여 혼합하고, 5 분 동안 99 ℃에서 변성. 침대-1 DNA가 프로브에 존재하는 순서를 반복 교배 할 수 있도록 45 분 동안 37 ° C에서 즉시 품어. </li><li> 노화 후, 유리 슬라이드에 (SSC/10 MM의 인산 완충 formamide/2x 70 %로 구성) 변성 버퍼의 50 μl를 발견하고, 세포가 towar을 향 상단에 커버 슬립을 넣어변성 버퍼 DS. 2 분 동안 65 ° C에서 알을 품다. </li><li> 5 분 동안 얼음 차가운 70 % 에탄올에 배양하여 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립, 사후 수정 세포를 추가합니다. </li><li> 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올에 후속 배양 세포를 탈수. 6 - 웰 플레이트에서의 coverslips를 제거하고 몇 분 동안 건조시켜. </li><li> 유리 슬라이드에 사전 하이브리드 프로브를 발견하고, 상단에 커버 슬립을 배양한다. 장소 SSC formamide/2x 50 ㎖의 50 %로 가득 찬 가습 실에서 슬라이드 및 37 ℃에서 하룻밤 배양 </li></ol> 5. 후 하이브리드 세척 및 검사의 항체 매개 검출 <ol><li> 2X SSC와 6 - 웰 플레이트를 입력하고 미리 따뜻한 42 ° C.까지 하룻밤 배양 한 후 커버 슬립을 추가하고 5 분 동안 42 ° C에서 알을 품다. </li><li> 2X SSC를 제거하고, 42 ℃에서 10 분 동안 50 % formamide/2x SSC와 커버 슬립을 품다 총 3 회 (모두 씻어 30 분)에 반복합니다. </li&gt; <li> SSC formamide/2x 50 %를 제거하고 실온에서 2 × 5 분 트리스 - 식염수 사이 (TST)와 함께 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 스팟 50 ㎕의 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 트리스 - 생리 식염수 BSA (TSBSA), 그리고 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 차단하는 거꾸로의 coverslips을 품어. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 양 - 안티 발굴 항체 (TSBSA에서 1:500)의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 첫 번째 배양 단계의 coverslips을 품어 거꾸로. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 FITC (TSBSA에서 1:250)가 결합 토끼 반대로 양의 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 제 2 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 . </li><li> 트랜스FER 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 FITC (TSBSA에서 1:250)가 결합 염소 안티 - 토끼 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 세 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 . </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 마우스 항 비오틴 항체의 μL (TSBSA에서 1:200), 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 네 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 배양한다. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 로다 민 (TSBSA에서 1:250)가 결합 당나귀 - 항 - 마우스 항체의 μL, 거꾸로 TST-가습 어두운 chamb 실온에서 30 분 동안 다섯 번째 배양 단계의 coverslips을 품어어. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. </li><li> 스팟 50 새로운 유리 슬라이드에 coverslip에 당 로다 민 (TSBSA에서 1:250)가 결합 염소 안티 - 말 항체의 μL 및 TST-가습 어두운 챔버에서 실온에서 30 분 동안 여섯 번째 배양 단계에 거꾸로 커버 슬립을 품다 . 참고 : 염소 안티 - 말 항체는 당나귀 - 항 - 마우스 항체를 인식합니다; 시 연구원에게 제공, 염소 항 당나귀 항체는 잘 작동합니다. </li><li> 전송 다시 6 - 웰 플레이트에 커버 슬립 및 TST와 2 × 5 분을 씻어. 트리스 - 식염수 (TS)과 추가 5 분을 씻으십시오. </li><li> 3 분 3 분 3 분, 100 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올에 후속 배양 세포를 탈수. 6 - 웰 플레이트에서의 coverslips를 제거하고 몇 분 동안 건조시켜. </li><li> 유리 슬라이드에 DAPI와 매체를 장착 한 방울 (시약 참조) 스팟, 거꾸로 상단에 커버 슬립을 추가합니다. 손톱 광택과 함께 슬라이드를 밀봉하고형광 현미경으로 FISH 결과를 평가한다 (그림 1). </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

DNA FISH에 적합한 조건이 안정적 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 될 수있는 결합 된 DNA-RNA FISH는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여러 가지 방법은 DNA와 RNA를 모두 검출 프로브와 동시 배양의 필요성을 우회 동일한 셀의 DNA 및 RNA 모두를 연구에 적용되어왔다. 예를 들어, 중첩 방식으로, 첫 번째 RNA 물고기가 수행되고, 셀은 이미지하고, 좌표를 가져옵니다. 그 후, 같은 슬라이드는 RNA FISH의 신호가 손실되는 동안, DNA 물고기에 사용됩니다. DNA의 FISH 후, 균체를 다시 묘화하고, RNA 및 DNA의 FISH 모두로부터 얻어진 사진은 겹쳐있다. 고정 된 세포의 DNA가 안정적이며, 초기 RNA 물고기에 필요한 처리에 의해 영향을받지으로이 방법은 거의 모든 경우에 작동하지만,이 4 일 이상 비용이 매우 힘든 방법입니다. 또 다른 방법으로, 먼저 RNA 물고기가 수행되고, RNA 물고기 신호는 O를 추가로 고정되어DNA의 FISH를 적용한 후에 F 고정 제. 또한,이 방법도 사용할 수...

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광에 의해 세포와 조직을 공부하는 것은 1970 년대 후반 1 년에 소개 된 이후, 연구자들은 세포 내 수준에서 유전자 염색질 조직 및 유전자 발현을 연구 할 수있다. DNA의 FISH 자주 세포 유전학, 핵형이, 암 진단 (3) 및 착상 전 유전자 검사 (4)에 사용되고, 그것은 그 나라의 환경에서 핵산을 검출 할 수 있으므로 분자 연구 5-6에서 중요한 역할을한다. RNA FISH에 의해 단일 ​​세포 발현 분석은 네이티브 차 전 사체를 검출 할 수 있고, 비 암호화 RNA를 염색체로부터 전사되고, 예를 들면 등 집단 수준에서 유전자 발현을 평가하는 다른 기술에 이점을 제공 정량적 RT-PCR, 게놈 넓은 발현 분석 또는 노던 블롯 . 원래 자신의 사이트에서 직접 발생하는 RNA 전 사체를 시각화함으로써, 예를 들어왔다유전자 발현 확률 7이며, 때로는 8 대립 유전자 특정 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 기술의 개선도 9-11 세포 내에서 하나의 mRNA 분자의 검출과 정량을 허용했다. FISH의 기본 원리는 매우 구체적인 왓슨과 크릭 염기쌍에 의해 핵산 프로브로 세포 내에서 핵산의 혼성화로 구성된다. 프로브는 직접 또는 간접적으로 검출, 미시적으로 시각화 될 수있는 신호의 결과 일 수있다. 초기 시도는 안전 문제, 제한된 공간 해상도 및 시간 12-14에 하나의 타겟을 검출 할 수있는 능력에 근거 단점이 있었다 방사성 표지 된 프로브로 구성되었다. 형광 색소, 합텐, 효소 등의 비 방사성 라벨의 후속 개발, 일상적인 분자 생물학 기법으로 물고기의 폭 넓은 사용을 허용했다. FISH 프로브는 직접 fluoroch으로 표시 할 수있다산 핵산에 형광 분자의 화학적 연결하여 romes (15)와 형광 표지 된 뉴클레오티드 16 ~ 19, 또는 프로브가 간접적으로 (비오틴과 제닌 포함) 합텐의 통합에 접합 된 합텐 특정 항체에 의해 합텐의 면역 검출 후 시각화 할 수있는 통합을 시퀀스 형광 기자는 20 ~ 21 분자. 후자의 방법은 원래의 신호를 향상시키기 위해 사용되는 형광 표지 된 항체의 여러 계층을 사용하여 신호 증폭이 가능하고, 낮은 수준으로 발현되는 RNA 종의 검출을 가능하게한다. 직접 및 간접 라벨링 기술과 다양한 합텐을 결합하여 여러 가지 목표를 동시에 동일한 셀 내에서 시각화 할 수 있습니다. FISH 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 대상에 대한 프로브의 하이브리드입니다. 이론적으로, 프로브가 구체적으로 실제로 목표에만 바인딩되지만,이 특이성프로브는 상동 지역에 바인딩 수 있으므로 항상 달성되지 및 하이브리드 조건이 항상 특정 DNA 영역 또는 RNA 종에 적합하지 않을 것입니다. 그들이 FISH 절차의 엄격 성을 증가시킬 수 있고, 배경 잡음의 고레벨 초래 FISH 프로브의 비특이적 결합을 방지 할 수있는 포스트 - 혼성화 세척 따라서 특히 중요하다. RNA 분자가 하나의 좌초로 그들은 쉽게 FISH 프로브에 혼성화 할 수 있습니다. 대조적으로, 이중 가닥 DNA 분자는 먼저 프로브에 혼성화 할 수있는 후 변성 단계를 필요로한다. 이것은 일반적으로 DNA의 변성을 초래 시험편의 가열에 의해 달성된다. 그러나 이러한 가혹한 조건에서, 깨지기 쉬운, 단일 가닥 RNA 분자가 손실 될 수 있습니다. 따라서 결합 된 DNA-RNA FISH는 조건의 상당한 최적화를 필요로하고, 단지 RNA 또는 DNA의 별도의 검출에 비해 기술적으로 도전이다. 여기에서 우리는 프리젠타 자세한 문의는 여성 마우스 배아 줄기 세포에게 22-24 차별화에 X 염색체 불 활성화 (XCI)를 연구 할 수있다 결합, 동시에 DNA-RNA 물고기의 프로토콜입니다. XCI는 중요한 성적인 여성의 배아 발달 (25)에 대한 메커니즘 및 heterochromatinization 결과이며 따라서 여성 개인이 26 ~ 27에있는 두 개의 X 염색체 중 하나의 침묵. 이 과정에 필수적인 RNF12 22 ~ 23과 REX1 24 단백질에 의해 조절되는 비 암호화 RNA XIST 28-30가 있습니다. XIST 표현이 배아 발달 동안이나 체외에서 ES 세포 분화에 미래 비활성 X 염색체 (사이)에 상향 조절된다 와 X 염색체를 따라 확산하여 X 염색체 (31)의 전사 종료 될 염색질 리모델링 효소를 유치 할 수 있습니다. 이 XIST RNA의 확산은 X 염색체의 코팅으로 RNA FISH에 의해 시각하실 수 있습니다일부도 XIST 클라우드라고한다. 여성 ES 세포 게놈 불안정성으로 인해 자신의 X 염색체 중 하나를 잃을 수 있기 때문에, 우리는 다른 사람은 확인 만 되었으면 염색체 안정 세포가이 중요한 과정 (22), (32)의 분석에서 평가하는 것을 확인하기 위하여, XCI을 연구하기 위해 결합 된 DNA-RNA FISH를 이용했다 -34. 모든 분자 생물학 기법으로, 여러 가지 우수한 프로토콜은 35-38을 발표되었다. 여기에 우리가 할 수 있도록 마우스 ES 세포, 세포의 고정, 닉 - 번역, 고정 된 세포의 전처리에 의한 FISH 프로브의 라벨에 분화 유도에서 시작, 우리의 방법을 제시 permeabilization 이후 프로브 흡수,에 프로브의 하이브리드 타겟, 그리고 마지막으로 형광 표지 된 항체에 의해 프로브의 검출. 여기에 제시 프로토콜은 XIST RNA의 충실한 검출 이틀의 기간 내에서 X 염색체를 허용하고,이 기술의 기본 가능성이 오티에 적용 할 수 있습니다그녀의 시스템과 연구의 영역.

<table><tbody><tr><td>요청 시 암컷 마우스 배아 줄기세포</td><td></td><td></td><td>를 이용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>.마우스 배아 섬유아세포는</td><td></td><td></td><td>E13.5 배아에서 파생되거나 상용 소스예: Millipore</td></tr><tr><td>ES 세포 배양 배지</td><td></td><td></td><td>를 통해 파생될 수 있습니다.DMEM, 15% 태아 송아지 혈청, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 100mg/ml, 비필수 아미노산, 0.1mM &#947;-메르캅토에탄올 및 1,000U/ml LIF. 필터는 살균하고 4 &#176에 보관합니다. C는 최대 2주 동안 지속됩니다.</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>페니실린&ndash; 스트렙토마이신 (100x)</td><td>인비트로젠</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>인비트로젠</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&#947;-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>ES 세포 분화 매체</td><td></td><td></td><td>IMDM-글루타맥스, 15% 열 비활성화 태아 송아지 혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 비필수 아미노산, 37.8 &#956; l/L monothioglycerol 및 50 &#956; g/ml 아스코르브산</td></tr><tr><td>IMDM-글루타맥스</td><td>인비트로겐</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산(50mg/ml)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>모노티오글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>T25 세포 배양 접시</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 접시</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 등급 PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%(v/v) 트립신/0.2%(w/v) EDTA PBS</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 튜브</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 x 24mm 커버슬립</td><td>Menzle</td><td>780882</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>는 0.2% 젤라틴/세포 배양 PBS 용액을 준비하고 오토클레이브를 사용합니다</td>.</tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td>은 <td>0.01M HCl(pH 2.0)</td></tr><tr><td>절대 100% 에탄올</td>에 0.2%로 희석합니다<td>. Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td>은 절대 100% 에탄올 및 RNAse 무수를 사용하여 70% 및 90% 에탄올 용액을 만듭니다</td></tr>. <tr><td>RNAse 무수</td><td>Baxter</td><td>TKF7114</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 팁</td><td>Rainin Bio Clean</td><td>GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>digoxigenin 라벨링 키트 (DIG-Nick 번역)</td><td>Roche</td><td>11745816910</td><td></td></tr><tr><td>biotin 라벨링 키트 (Biotin Nick 번역)</td><td>Roche</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 주사기</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td>Eppendorf 튜브</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>효모 tRNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>마우스 cot-1 DNA 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf bench top microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>모델 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc, pH 5.6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ 혼성화 용액</td><td></td><td></td><td>50% 포름아미드, 2x SSC, 50mM 인산염 완충액 pH 7, 10% 덱스트란 설페이트 pH 7</td></tr><tr><td>포름아</td><td>미드 아크로스 유기물</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 설페이</td>트 <td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>10mM 인산염 완충액, pH 7</td><td></td><td></td><td>1 M Na2HPO4 및 42.3 ml 1 M NaH2PO4 57.7 ml를 추가하십시오. DEPC 처리 된 물 및 오토 클레이브</td></tr><tr><td>변성 완충액</td><td></td><td></td><td>사용 70 % 포름 아미드 / 2x SSC / 10 mM 인산염 완충액 pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris pH 7.5 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Saline-Tween 세척 용액 (TST)</td><td></td><td></td> <td>100 ml 10x 식염수, 50 ml 2M Tris, 500 &# 956; l Tween-20, 1 L</td></tr><tr><td>10x 식염수 용액</td><td></td><td></td>이 <td>1 L RNAse 무료 H2O에 85g NaCl을 용해</td></tr>시킬 때까지 RNAse 자유수를 추가하고 <tr><td>Tris-saline-BSA (TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 &#956을 고압증기멸균합니다. l 10x 식염수, 250 &#956; l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O</td></tr><tr><td>BSA, 정제, 100x</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>양-안티-파기 항체</td><td>Roche 진단</td><td></td><td>사용 1:500 TSBSA</td></tr><tr><td>토끼-안티 양 항체 FITC</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>사용 TSBSA</td></tr><tr><td>염소-안티 토끼 항체 FITC</td><td>Jackson 사용 실험실은</td><td></td><td>TSBSA에 희석된 1:250</td></tr><tr><td>마우스 항 비오틴 항체</td><td>Roche 진단</td><td></td><td>사용 TSBSA에 희석된 1:200</td></tr> 당<tr><td>나귀 - 항 마우스 항체 Rhodamine</td><td>Jackson 실험실은</td><td></td><td>TSBSA에 희석된 1:250</td></tr> 염소 <tr><td>항 마우스 항체 Rhodamine</td><td>Jackson 실험실은</td><td></td> TSBSA Tris-Saline 세척 용액(TS)<td>에 희석된 1:250 사용</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>10 ml 10x 식염수, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O</td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 미디어(DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>네일 바니시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 포함</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>)

결합 된 dna-rna 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 x 염색체의 불 활성화를 연구하는

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

제자리 혼성화 (FISH)에서 형광 세포의 핵산의 검출을 가능 분자 기법이다. DNA 물고기는 종종 세포 유전학과 암 진단에 사용되며, 종종 중요한 임상 적 의미를 가지고있는 게놈의 수차를 검출 할 수있다. FISH RNA는 세포에서 RNA 분자를 검출하는데 사용될 수 있으며, 유전자 발현의 조절에 중요​​한 통찰력을 제공했다. DNA FISH에 적합한 조건이 깨지기 쉬운, 단일 가닥 RNA 분자에 비해 너무 가혹한 수 있습니다와 같은 세포 내 DNA 및 RNA의 물고기를 결합하는 것은 기술적으로 도전이다. 우리는 여기에서 X 염색체에 의해 인코딩 XIST RNA와 DNA의 결합을 동시에 검출 할 수 쉽게 적용 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 이 결합 된 DNA-RNA 물고기 프로토콜 가능성이 RNA와 DNA가 탐지해야하는 다른 시스템에 적용 할 수 있습니다.

결합 된 DNA-RNA 물고기를 위에서 언급 한 프로토콜을 사용하여, 우리는 여성의 배아 줄기 세포를 분화에 X 염색체의 불 활성화를 시각화 할 수있게되었습니다. 1 우리가 XIST (인 모두 검출 DNA-RNA FISH 실험의 대표적인 예를 보여줍니다 비활성 X 염색체에 소위 XIST RNA 구름과 액티브 X 염색체에 기초 전사 핀 포인트), 그리고 핀 포인트의 신호로 볼 수있는 X 염색체의 영역으로 볼 수. 핀 포인트 신호 중 하나가되어 XIST 구름이 참으로 따라 지역화 및 X 염색체를 코팅하는 것을 보여주는, XIST 클라우드 내에 위치하고 있습니다. 세포의 99 % 이상에서, 우리는 프로토콜 올바른 DNA 신호 (데이터 미도시)를 이용하여 검출한다. RNA-FISH에 비해 XIST 구름 변성 된 DNA가 더 큰 영역을 차지하기 위해 보인다 결합 된 DNA-RNA FISH 절차가 ...

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

이 절차의 전반적인 목적은 DNA와 RNA 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization)을 동시에 결합한 DNA-RNA FISH를 통해 분화된 암컷 생쥐 배아 줄기 세포의 X 염색체 불활성화를 연구하는 것입니다. 이는 먼저 암컷 생쥐 배아 줄기 세포에서 분화를 유도함으로써 수행됩니다. 정상적인 착상 후 배아 발달을 모방하는 이 과정 동안 X 염색체 불활성화가 시작되며, 그 결과 향후 불활성화될 X 염색체를 코딩하는 cyst RNA의 전사와 축적이 증가하게 됩니다.두 번째 단계는 파라알데하이드를 사용하여 분화된 배아줄기세포를 고정하는 것입니다. 그다음, 닉 번역법(Nick translation)을 통해 DNA 단편을 비오틴 또는 디고제닌으로 표지하여 X 염색체의 DNA와 cyst RNA를 모두 검출하기 위한 프로브를 준비합니다.마지막 단계는 DNA-RNA FISH 절차를 수행하는 것입니다. 분화된 배아줄기세포를 투과화 및 변성시킨 후, 표지된 FISH 프로브와 하이브리드화합니다. 이후 biotin 또는 diggen hapten을 검출하는 형광 결합 항체를 사용하여 이를 검출합니다. 최종적으로, 면역형광 현미경 관찰을 통해 여성 세포 내 두 염색체의 위치를 확인하고, 불활성화 과정을 거치는 X 염색체로부터 유래한 cyst RNA의 발현을 시각화합니다.RNA와 DNA를 순차적으로 검출하는 FISH 방법과 같은 다른 방식과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 본 프로토콜을 사용하여 이틀 이내에 동일한 검체 내에서 두 종류의 핵산을 동시에 검출할 수 있다는 점입니다. DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 최적 조건이 크게 다르기 때문에 DNA와 RNA를 결합한 FISH를 수행하는 것은 어려울 수 있습니다. 하지만 여기에 제시된 프로토콜을 사용하면, 분석된 거의 모든 세포에서 두 X 염색체 모두에서 유래한 RNA와 DNA의 존재를 검출할 수 있습니다.이를 통해 암컷 생쥐 배아 줄기세포의 분화 과정이나 암컷 생쥐의 비정상적 발달 과정 중에 일어나는 X 염색체 활성화 상태를 연구할 수 있었습니다. 이 방법은 초기 생쥐 배아 발달 중에 발생하는 중요하고 흥미로운 과정인 X 염색체 활성화 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 천연 염색질에서 유래한 RNA 전사체를 검출하는 것이 중요한 다른 생물학적 시스템에도 적용 가능할 것으로 보입니다. 특히 비코딩 RNA가 생물학적

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

이 프로토콜은 아닌 방사성을...

더블 형광 현장에서</em신선한 두뇌 섹션> 하이브 리다이 제이션

마우스 조직에서 데이터 수집을 최대화하기 위해 다양한 기술의 조합이 제공됩니다.

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

우리는 면역형광과 결합된 쉽게 맞춤화된 가닥 특이적 형광 FISH(in situ hybridization) 프로토콜을 개발했습니다. 이를 통해 RNA 역학을 자세히 조사하고 단일 세포 수준에서 염색질 구조, 핵 조직 및 전사 조절에 대한 통찰력을 동시에 얻을 수 있습니다.

빠른 형광 현장에서 하이브리드 프로토콜

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

배우세요 DNA-RNA 형광 현장 하이브리드화(FISH)를 이용하여 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체 불활성화를 연구하는 방법입니다. 이 기술은 동일한 시료에서 RNA와 DNA를 동시에 검출하여 유전자 조절 메커니즘을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

결합 된 DNA-RNA 형광

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