1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

이 절차의 전반적인 목표는 단일 이온 채널을 통해 전류를 측정하는 것입니다. 이는 작업하기 쉽고 실험 목표에 도움이 되는 세포에서 관심 이온 채널을 먼저 이종(heterologous)으로 발현함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 방화 피펫을 사용하여 세포막을 안정적으로 밀봉

다음으로 실험자는 패치에 존재하는 채널의 수를 결정해야 하며, 단일 채널 레코드 전류인 경우 마지막 단계는 데이터를 처리하고 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 단일 이온 채널의 전류를 기록하는 것은 이러한 막 단백질이 작용하는 생물물리학적 특성을 조사하는 데 사용되며, 이는 신경 세포와 기타 흥분성 세포가 통신하는 방법의 기초를 형성합니다. 여러 활성 이온 채널을 통해 전류를 측정할 수 있는 방법과 달리, 이 접근 방식의 장점은 개별 이온 채널을 통해 전류를 측정하면 특정 채널에 내재된 광범위한 응답 패턴을 시각화하고 분리할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 생리학적 및 치료적 조절제가 뉴런 간의 통신에 영향을 미치는 것과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 사용하는 개인은 단일 이온 채널만 포함하는 저노이즈 기록을 얻기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법을 처음 시도할 때, 이 방법에서 가장 중요한 것인 매우 안정적인 밀봉을 얻기 위해서는 특정 각도로 세포에 부드럽게 접근해야 하고, 가장 중요한 것은 끈기가 있어야 하기 때문에 누군가가 하는 것을 보는 것이 정말 유용합니다.

HEK 2 93 셀은 하루 전에 35mm 접시에 도금되어 멸균 튜브에서 50-60% 합류합니다. 형질주입 혼합물을 준비합니다. 관심 있는 각 CDNA 1마이크로그램, 이중 증류수 315마이크로리터 및 42밀리몰 힙 350마이크로리터를 추가합니다.

마지막으로 35마이크로리터의 염화칼슘을 적방울로 첨가하여 침전물을 형성합니다. 튜브를 5초 동안 소용돌이치고 4개의 접시 각각에 175마이크로리터의 형질 주입 현탁액을 추가합니다. 전날 도금했습니다.

세포를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. 다음으로, MDA 수용체 매개 흥분독성을 방지하기 위해 2밀리몰 염화마그네슘이 보충된 2밀리리터의 성장 배지를 추가합니다.

먼저 수직 풀러를 사용하여 소년 규산염 유리에서 두 개의 대칭 기록 피펫을 당깁니다. 다음으로, 적절한 직경과 저항을 얻기 위해 화재 연마가 필요합니다. 다음으로 QUB 데이터 수집 소프트웨어를 열고 수집 창을 선택하여 기록을 설정합니다.

레이아웃 아래. 새 데이터를 클릭하여 새 QUB 데이터 파일을 열고 사용할 실험 매개변수를 입력합니다. 데이터 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 속성을 선택한 다음 데이터 탭을 클릭하여 진폭 스케일링을 피코 암페어당 0.1볼트로 조정합니다.

배지를 칼슘과 마그네슘이 함유된 2mL의 PBS로 교체한 후 세포 접시를 현미경 스테이지에 장착합니다. 위상차 현미경을 사용하여 세포장에 초점을 맞춰 세포가 건강하고 단층 방식으로 접시에 잘 부착되어 있는지 평가합니다. 형광 검출로 전환하여 transfection이 성공적이었는지 확인합니다.

다음으로 단일 채널 녹음을 위한 매개변수를 설정합니다. 볼륨을 볼륨으로 설정합니다.tage clamp 및 적용된 볼륨tage 유지 명령을 사용하여 플러스 100m볼트입니다. 꺼짐 위치에서 형광 및 전반적인 모양에 따라 밀봉 테스트 버튼을 선택합니다.

패치를 적용할 세포를 선택하고, 위상차 아래에서 세포가 접시에 잘 부착되어 있는지, 세포 표면의 많은 부분이 패치를 위해 노출되어 있는지, 그렇지 않으면 건강해 보이는지 확인합니다. 갓 연마한 피펫에 NMDA 수용체 및 세포 부착 실험에 적합한 용액을 채우고 부드럽게 두드려 기포를 제거합니다. 녹음 피펫을 ampliifier 헤드 stage를 선택하고 수조 용액이 피펫에 들어가는 것을 방지하기 위해 은색 와이어가 피펫 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오.

접근하는 동안 피펫 홀더에 연결된 작은 플라스틱 주사기를 사용하여 부드럽게 양압을 가합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 수조로 향하게 합니다. 전기 회로를 닫고 패치를 위해 선택한 셀 바로 위에 놓습니다.

욕조에 들어갈 때 오실로스코프를 기록해 두십시오. 파이펫 저항은 최적의 범위 내에 있어야 하며, 현미경에서 파이프의 위치를 육안으로 모니터링하고 오실로스코프에서 전기적으로 파이프의 저항을 모니터링해야 합니다. 피펫이 세포에 부드럽게 충돌할 때까지 조금씩 접근을 계속합니다.

테스트 신호는 저항이 증가했음을 나타내기 위해 약간 감소합니다. 밀봉을 형성하려면 주사기를 집어 들고 측면 튜브를 통해 약간의 음압을 부드럽게 가합니다. 주사기 플런저를 당기면 오실로스코프의 테스트 신호 파형이 완전히 평평해지는 것으로 밀봉 형성을 알 수 있습니다.

에 amp리퍼. 외부 명령 토글을 밀봉 테스트에서 끄기로 전환합니다. 전압 유지 명령을 꺼짐에서 양수로 전환하고 게인을 10배에서 100배로 높입니다.

오실로스코프에서 채널 활동을 관찰하며, 채널 활동이 있는 경우 이전에 평평한 기준선에서 정사각형 하향 편향으로 표시됩니다. 채널 활동이 오실로스코프에 표시되면 재생 버튼을 누른 다음 녹음 버튼을 눌러 QUB에서 이전에 열었던 디지털 파일로 데이터 수집을 시작합니다. 데이터 수집을 중지하려면 QUB의 중지 버튼을 누르고 QDF 파일을 저장하거나, 신호가 완전히 평평해지지 않거나, 노이즈가 발생하고 불안정해지는 베이스라인이 약한 밀봉을 나타낼 수 있습니다.

이 경우 피펫을 제거하여 폐기하고 적절한 밀봉이 얻어질 때까지 새 피펫으로 진행 단계를 반복합니다. 데이터 분석 프로세스를 시작하려면 QUB에서 기록된 데이터 파일을 열고 사전 인터페이스에서 현재 추적을 검사합니다. 레이아웃 아래.

fc라고 표시된 상자를 선택 취소하여 기록된 추적을 전체 대역폭으로 표시하려면 디지털 필터를 제거합니다. 흔적을 육안으로 스캔하여 불규칙성과 아티팩트를 찾아냅니다. 현재 스파이크는 동일한 컨덕턴스 등급의 인접한 청정 영역을 강조 표시하여 수정할 수 있습니다.

마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 set erase buffer first를 선택하고 개별 샘플 포인트가 표시될 때까지 스파이크를 확대합니다. 이 영역만 강조 표시하여 바꿀 영역을 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 지우기를 선택하여 전체 레코드에 대한 기준선을 수정합니다.

기준이 안정적인 레코드의 초기 부분을 선택하여 현재 0 기준선을 정의합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 강조 표시하고 기준선 설정을 선택합니다. 기본 가이드라인이 나타나면 육안 검사를 통해 기준선 수준을 정확하게 나타내는지 확인합니다.

기록에서 원시 데이터 기준선이 설정된 기준선에서 눈에 띄게 벗어나는 지점을 식별합니다. 편차 영역 내에서 기준선의 작은 부분을 선택하여 이 문제를 해결합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 기준선 노드 추가 명령을 선택합니다.

레코드에 쉽게 수정할 수 없는 과도한 노이즈 또는 아티팩트가 가끔 포함된 경우 이러한 부분을 삭제해야 하지만 먼저 연속적인 세그먼트로 나누어야 합니다. 삭제할 영역 바로 앞을 강조 표시합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 세그먼트 끊기를 선택합니다.

그런 다음 폐기할 섹션을 강조 표시하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 선택하고 삭제한 다음 Enter 키를 눌러 레코드를 이상화합니다. 레이아웃에서 MOD 인터페이스로 전환합니다. 데이터 표시 패널에서 닫힌 이벤트와 열린 이벤트를 모두 포함하는 레코드의 작은 부분을 선택합니다.

커서를 아래의 고해상도 패널로 이동하고 선택한 추적 내에서 기준선을 나타내는 깨끗한 세그먼트를 강조 표시합니다. 커서를 아래의 모델 패널로 이동하고 닫힌 상태를 나타내는 검은색 사각형을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 잡기를 선택합니다. 개방 컨덕턴스를 나타내는 트레이트의 일부를 강조 표시하여 채널 개방에 대한 절차를 반복합니다.

모델 패널에서 빨간색 사각형을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 grab을 선택합니다. data source(데이터 소스) 아래에서 SEL 버튼을 선택하여 레코드의 선택한 부분에 대한 이상화를 수행합니다. 그런 다음 팝업 패널의 모델링 섹션 아래에 있는 이상적인 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.

분석에 원하는 매개변수가 올바른지 확인한 다음 실행을 클릭합니다. 선택한 부분에 대한 진폭 히스토그램과 함께 이상화의 결과는 이상화의 시각적 검사를 허용하기 위해 데이터와 중첩됩니다. 필요한 경우 최상의 결과를 위해 이상화 매개 변수를 조정하고 반복하고 데이터 소스에서 파일 버튼을 선택하여 전체 파일에 대한 이상화를 수행합니다.

그런 다음 이상적인 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 실행을 클릭합니다. 전체 파일에 대한 결과가 표시됩니다. 데이터와 겹쳐서 이상화된 추적과 기록된 데이터 간의 일치 항목을 주의 깊게 검사합니다.

경우에 따라 이상화된 추적에서 제외할 수 있는 이벤트가 잘못 식별됩니다. 거짓 이벤트를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 IDL 가입을 선택합니다. 여기에 표시된 것은 HEK 2 93 세포에서 단일 NMDA 수용체를 통한 칼슘 이온 전용 전류입니다.

셀 부착 패치 클램프 기술을 사용하여 데이터 이상화는 이 셀의 두 가지 별개의 전도도 클래스에 잘 맞는 진폭 히스토그램을 생성합니다. HEK 2 93 세포의 첨부 기록, 하나의 메노 민감 채널은 영하 20mm까지 활성화됩니다. 전압이 지속적으로 적용되는 동안 패치 피펫을 통한 수은 압력.

빨간색 점선은 0 전류 수준을 나타냅니다. 네이티브 채널의 이러한 기록은 쥐 배아의 전전두엽 피질에서 해리되고 5일 또는 27일 동안 배양에서 유지된 뉴런의 소마에서 기록된 지속적인 NMDA 수용체 활성을 보여줍니다. 일단 마스터하면 이 절차는 녹음 시간에 따라 30분에서 1시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 kinetic analysis 및 state modeling과 같은 다른 방법을 수행하여 채널의 게이팅 메커니즘을 결정하고 반응 속도를 추정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 하나의 이온 채널 단백질을 통해 전류를 기록하고 분석을 시작하는 방법을 꽤 잘 이해하게 될 것입니다.