Name: 1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: 배우세요 세포 부착 패치 클램프 기법을 사용하여 단일 이온 채널의 전류를 측정하는 방법을. 이 기술은 신경과학 및 세포 생물학 연구에서 이온 채널의 생물물리학적 특성을 실시간으로 관찰하고 분석하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 F31NS086765 (KAC)에 의해 지원되었다, F31NS076235 (MAP), 및 R01 NS052669 (GKP) 및 EIA9100012. 저자는 전문 지식과 분자 생물학 및 조직 문화에 대한 지원은 아일린 Kasperek 감사합니다; 제이슨 마이어스 초기 전두엽 대뇌 피질의 신경 세포에서 얻은 데이터를 공유.

1. 세포 배양 및 단백질 발현 <ol><li> HEK293 세포를 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 DMEM에서 단층 배양에서, ATCC에 의해 수행 통로를 포함 통로 (22)와 (40) 사이 (ATCC 번호 CRL-1573) 및 5 % CO 2에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 혼합물을 유지 37 ° C. 실험 사이에, 10 ㎖의 최종 부피의 5 ~ 20 배 희석에서 T25 플라스크에 통과 세포. 참고 :이 구절 동안 세포를 사용하여 최적의 인감 형성 및 패치 안정성을 위해 수 유리한 세포의 건강을 보장합니다. </li><li> 형질의 경우, 접시 당 세포 현탁액에 ~ 0.5 ~ 0.6 ㎖에 해당 ~ 10 5 세포 / 요리의 밀도, 직경 35 ㎜ 요리 HEK293 세포를 플레이트와 18 ~ 24 시간 동안 2 ㎖ 배지에서 세포를 성장. </li><li> 멸균 된 1.5 ㎖의 원심 분리 관에서, (이 순서대로)를 추가하여 네 개의 35mm 요리의 형질 전환 혼합물을 제조 : 각각의 cDNA (GluN1, GluN2A 및 GFP)의 (1) 1 μg을; (2) 315 μL의증류수 (DDH 2 O); (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 침전물을 형성하기 위해 사용된다 현명한 2.5 M 염화칼슘 드롭, (4) 35 μL - (3) 350 42 mM의 4 μL. </li><li> 소용돌이 5 초 동안 튜브 4 개의 35mm 요리의 각 형질 현탁액 175 μl를 추가 현재 50 ~ 60 %의 합류에 세포를 포함하고 2 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어 전날, 도금했다. </li><li> 형질 매체 대기음은 PBS로 세척 및 NMDA 수용체가 흥분 독성 9 매개 방지하기 위해 2 mM의 MgCl2를 보충 성장 배지 2 ㎖로 대체합니다. 주 : 세포는 전기 생리 레코딩 24-48 시간 포스트 형질 감염을 위해 사용될 수있다. </li></ol> 2. 전극의 제조 <ol><li> 수직 풀러와 붕규산 유리 튜브를 잡아 당겨 2 대칭 기록 피펫을 생성합니다. 얻어진 팁의 크기와 형상, 상기 형상 피펫에 근거폴리 셔를 사용하여. 참고 : 팁 크기 외형과 전기적으로 평가 될 수있다. 시각적 외경 1.4-5.6 μm의 범위에 있어야한다. 전기, 최적의 크기 팁, 세포 외 용액으로 가득 할 때, (그림 2B 참조) 12 ~ 24 MΩ 범위에서 저항을 생산한다. </li><li> 세포 부착 실험을 위해 최대 채널 활동과 높은 전류 진폭을 생성합니다 세포 외 환경을 나타내는 피펫 솔루션을 사용합니다. 참고 : NMDA 수용체의 경우, 이는 효능 (글루타민산, 글리신), 가의 양이온 억제제 및 차단제를 킬레이트 1 mM의 EDTA의 포화 농도를 함유하는 용액에 대응하고, 구두창 투과 이온 (나트륨의 생리적 농도 (150 mm)를 가지고 mm 단위 : 1 글루타민산, 글리신 0.1, 150의 NaCl, 2.5 KCl을, 1 N NaOH로 pH를 8.0에서 버퍼 1 EDTA, 10 HEPBS). </li></ol> 3. 세포 부착 된 패치 클램프 녹음 <ol><li> 오픈 QUB 데이터 취득 softwa 사용(www.qub.buffalo.edu)을 다시, 그리고 &#39;레이아웃&#39;에서 획득 창을 선택합니다. 라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 &#39;파일&#39;에서 &#39;새 데이터&#39;를 클릭하여 새 QUB 데이터 파일 (QDF)를 열고 다음과 같은 초기 매개 변수 입력 : 샘플링 속도, 40 kHz의를; A / D 스케일링, 3000; 출력 채널, 1; 및 A / D 데이터 크기, 2., 데이터 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 속성을 선택하고 &#39;데이터&#39;탭을 클릭하여 0.1 V / 펜실바니아에 진폭 배율을 조정합니다. 참고 : 이러한 매개 변수는 세포 부착 된 모드에서 모델 셀을 사용하여 각 설정에 정제 할 수있다. QUB 소프트웨어와 QDF 특성을 가진 데이터 수집에 대한 추가 명령은 www.qub.buffalo.edu에서 온라인입니다. </li><li> 발현 세포 이온 채널을 함유 35mm 접시를 선택하고, 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 2 ㎖의 PBS와 함께 성장 배지를 교체; 현미경 무대에 접시를 탑재하고 세포가 건강하고 잘 접시에 부착 된 것을 평가하기 위해 위상차 현미경을 사용하여 세포 분야에 초점을단일 층 패션 (그림 1A)에서. 형질 전환 (그림 1B) 성공했는지 확인하기 위해 형광 검출로 전환합니다. 참고 : 형광 농도의 범위가 단백질 발현의 조질 척도로서 사용될 수있다. </li><li> 단일 채널 녹음의 경우, 10 배에 앰프의 출력 게인 = 1 β에 패치 구성, 10 kHz의 아날로그 필터,-클램프 전압 모드를 설정 +100 MV에 전압을인가. OFF 위치에서의 전압 유지 명령으로, &#39;씰 테스트&#39;버튼을 선택합니다. </li><li> 형광 및 셀 상태에 기초하여, 패치 할 셀을 선택한다. 셀이 아니라 접시에 부착되는 위상차에 따라 검증, 패치 노출 세포 표면의 넓은 부분을 가지고 있으며, 그렇지 않으면 건강한 보인다. 참고 : 접근과 패치 클램핑 동안 셀을 표백 피하기 위해 위상 콘트라스트 조명을 유지한다. </li><li> 그것은 electrod에 닿을 수 있도록 충분히 솔루션을 갓 광택 피펫을 기입전자 가볍게 흔들어 팁에 갇혀 될 수 있습니다 공기 방울을 제거 할 수 있습니다. 피펫 홀더의 밀봉 나사를 체결하고 실버 와이어는 피펫 용액에 침지되어 있는지 확인하여 증폭기 headstage에 기록 피펫을 고정합니다. </li><li> 튜브로 피펫 홀더에 연결되는 작은 (5 CC) 플라스틱 주사기를 사용하여 부드럽게 (도 2A)를 입력하고 접근하는 동안 팁 막힘 불순물을 방지하기 위해 양압을 적용한다. </li><li> 미세 조작기를 사용하여 욕조에 피펫을 지시하고 전기 회로를 폐쇄 (그림 1C)을 패치에 대해 선택한 셀 위에 직접 위치. 앰프의 인감 테스트 신호 (그림 2B)에 해당하는 구형 파형을 표시해야하는 오실로스코프에주의하십시오. 참고 : 화장실에 진입하면, 최적의 범위 내에서 피펫 저항이 12 ~ 24 MΩ입니다. 5 MV 시험 신호에 대한, 측정 된 전류 R앤지는 ~ ~ 40 펜실바니아에 해당합니다. </li><li> 오실로스코프에 전기적으로 현미경 피펫 저항을 통해 시각적으로 피펫의 위치를 모니터링하면서, 피펫 세포에 부드럽게 충돌 할 때까지 조금씩 접근을 계속하고, 테스트 신호는 저항 증가 (그림 2B)를 나타 내기 위해 약간 감소한다. </li><li> , 시일을 형성 주사기를 들고 녹음 피펫의 끝으로 세포막을 구해 GΩ 저항 시일 (10)의 형성을 시작하는 주사기 플런저를 잡아 당겨 측면 튜브를 통해 약간의 부정적인 압력을 적용합니다. 씰 형성이 볼 만 용량 과도 (그림 2B)로, 그 완벽한 평탄화로 표시되는 오실로스코프에 테스트 신호의 파형에주의하십시오. 참고 : 신호가 완전히 평평하지 않거나 기준에 잡음이되면,이 물개의 주위에 상당한 누설 전류와 약실을 나타냅니다. 이것은 R을 방지 할하나의 채널 전류를 esolving. 이 경우, 셀로부터 피펫을 철회 멀리 조로부터, 헤드 단계에서 분리 해 버린다. 적절한 범위 (≥ 1 GΩ)에 씰을 획득 할 때까지 새로 연마 피펫 과정을 반복합니다. </li><li> 앰프에서 &#39;해제&#39;에서 &#39;도장 시험&#39;에서 외부 명령 토글 스위치; ( &#39;오프&#39;로 이전에 설정 한) 양에 전압 유지 명령을 전환; 과 X100에 이득을 증가시킨다. 존재하는 경우, 이전에 평면 기준 (그림 2C) 광장에서 위쪽으로 편향으로 표시됩니다, 채널 활동에 대한 오실로스코프를 관찰합니다. </li><li> 채널 활동이 오실로스코프에 표시되는 경우, &#39;기록&#39;버튼 뒤에 &#39;플레이&#39;버튼을 누르면, QUB에서 이전에 열린 디지털 파일로 데이터를 획득. 데이터 수집을 중단 QUB에서 정지 버튼을 눌러 쉽게 retriev을 QDF 파일을 저장하려면&#39;파일&#39;라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 &#39;저장 데이터로를 ...&#39;을 선택하여 컴퓨터 하드 드라이브의 수 없습니다. </li></ol> 4. 데이터 전처리 및 이상화 참고 : 중요 정보는 (가장 간단한 경우에, 폐쇄 또는 개방) 적절한 컨덕턴스 클래스에 각각의 데이터 포인트를 할당 통계 분석에 의해 단일 ​​채널 녹음으로부터 추출 될 수있다. 이 프로세스는 데이터 이상화 및 분절 K 수단 (SKM) QUB있는 방법 (11)이 아래에 설명되어있는 데이터 이상화의 간단한 설명으로 언급된다. <ol><li> QUB의 데이터 파일을 열고, &#39;레이아웃&#39;에서 &#39;사전&#39;인터페이스에서 현재의 흔적을 볼 수 있습니다. 표시된 상자를 취소하여 (디지털 필터를 제거) 여과되지 않은 녹음 파일을 표시 &#39;구단을.&#39; </li><li> 시각적으로 부정과 유물 (그림 4A)를 탐지하는 레코드를 검색합니다. 올바른 간단한 전류 스파이크 그 occuR 추적 내에서, 같은 전도성 클래스의 인접한 청정 지역을 선택이 지역을 강조, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택하여 (그림 4A) &#39;설정 지우기 버퍼를.&#39; 각각의 샘플 포인트가 표시 될 때까지 스파이크 확대, 대체 할 수있는 지역을 선택 만이 지역을 강조하고 &#39;삭제&#39;를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 삭제합니다. </li><li> 베이스 라인이 안정 레코드의 초기 부분을 선택하여 전체 레코드의 제로 전류 기준을 정의, 하이라이트, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 &#39;설정 기준&#39;을 선택합니다. 정확하게 표시 가이드 라인 (그림 4B 보라색)의 기준 레벨을 나타내는 확인 </li><li> 원시 데이터의베이스 라인 설정 기준에서 눈에 띄게 벗어나는 레코드 점을 확인합니다. 일탈 영역 내에서 기준의 작은 부분을 선택하여이 문제를 해결, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 &#39;기본 노드를 추가&#39;명령을 선택합니다. </li><li> T의 영역을 식별그는 쉽게 (그림 4C) 해결할 수없는 과도한 소음이나 유물을 포함 녹음. 폐기 할 지역을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 &#39;삭제.&#39; 참고 :이 경우 운동 정보가 손실됩니다 처리 된 기록이 단축되며 스플 라이스 시점 이후에 발생하는 지점은 프리 - 노이즈 영역과 연속으로 나타납니다. </li><li> SKM 알고리즘 (11)를 이용하여 기록을 이상화하는 오픈 이벤트를 폐쇄 모두 포함하는 추적의 일부를 선택하고 아래의 &#39;MOD&#39;인터페이스 &#39;을 입력 레이아웃.&#39; &quot;모델&quot;패널에서 검은 사각형 (닫은 상태)를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 &quot;잡아&quot;를 선택, 파일 전체 기준의 대표적인 트레이스의 깨끗한 부분을 강조 표시합니다. 열린 전도를 강조 표시하여 채널의 오프닝을 위해 동일을 할, 바로 &quot;모델&quot;패널에서 빨간색 사각형을 클릭하고 &quot;잡아&quot;를 선택합니다. </li><li> idealiza를 수행아래의 &#39;파일&#39;버튼을 선택하여 전체 레코드에 대한 기 &#39;데이터 원본.&#39; 분석을 위해 원하는 매개 변수가 올바른지 확인하고 다음을 클릭합니다 &#39;모델링&#39;섹션 아래의 &#39;이상화&#39;탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 &#39;실행.&#39; 이상화의 결과는, 전체 파일의 진폭 히스토그램과 함께 이상화의 육안 검사 (도 5)을 허용하는 데이터와 중첩된다. 주 : 부적절한 이상화는 QUB 채널의 오프닝 실제로 발생하지 않는 폐쇄를 감지하는 &#39;거짓 사건&#39;의 생성으로 이어질 수 있습니다. 증폭기의 아날로그 필터 및 샘플링 레이트에 의해 설정되어, 기록 해상도, 내 SKM 열고 닫히는 이벤트가 검출되는 해상도는 분석을위한 데드 타임을 설정하여 제어 할 수있다. 최적의 데드 타임이 시행 착오를 선택해야합니다 및 샘플링 속도에 따라 달라집니다,하지만, 엄지 손가락의 좋은 규칙은2-3 샘플 12 데드 타임 (dead time)을 선택합니다. </li><li> 이상화 정확하게 원시 데이터를 나타낸다는 것을 확인하려면, 수동으로 이상화 추적을 검사합니다. 이상화의 오류를 식별하면, 거짓 이벤트를 통해 추적을 선택, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 &#39;IDL에 가입하세요.&#39; 주 : 추가 옵션 및 QUB있는 다양한 명령 및 기능에 대한 자세한 설명은, QUB 설명서 온라인 (www.qub.buffalo.edu)를 참조하십시오. </li></ol>

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<li>Benndorf, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenndorf%2C+K+%22chapter+in+Single-channel+recording.+2nd+edn+eds+B.+Sakmann+and+E+Neher%22">chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
</ol>

이 논문의 저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이온 채널 필드에 연구의 중요한 영역을 열거 나 채널의 게이트 메커니즘을 채널로 연결 이벤트의 순서를 이해하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 대부분 채널의 경우,이 프로세스는 복잡하고, 거시적 멀티 채널 신호로부터 도출 될 수없는 여러 운동 단계를 포함한다. 대조적으로, 실험은 단일 채널 레코드의 개방 / 폐쇄 이벤트의 시퀀스를 관찰하는 게이팅 메커니즘에 대한 더 상세한 정보를 생성 할 수있는 설계 될 수있다. 최소 침습 패치 클램프 녹음이 일정 조건에서 수행 될 수 있도록 여기에 설명 된 방법에서, NMDA 수용체에 의해 소유 외부에있는 리간드 결합 도메인이 있습니다. 이 프로토콜은 리간드와 수용체의 속성을 모두에 따라 다른 리간드 게이트 이온 채널을 연구에 적합하기 위해 적응해야 할 수도 있습니다. 단일 채널 활동 기록은 가치있는 두 가지 유형의 정보를 제공한다. 첫째,단일 전류 진폭을 직접 측정 할 수 있으므로, 실험은 채널 컨덕턴스, 투과도 및 선택과 같은 세공 속성에...

생체막 걸쳐 패스트 통신은 일반적으로 채널로 지칭 올리고머 기공 형성하는 막 단백질에 거의 전적으로 의존한다. 이 단백질은 활성화 신호 게이팅 메커니즘 및 전도성 속성에서 크게 다르다. 그 구멍 이온에 선택적인 채널 단백질은 이온 채널로 분류됩니다; 그들의 활성화를 막을 가로 질러 이온 전류를 생성하고, 그 응답은 전기 생리 기법을 사용하여 실시간으로 높은 해상도로 기록 될 수있다. 활성화 신호는 농도 기울기, 기계적 및 전기적 힘 및 온도를 포함하여 화학적 및 물리적 입력의 광범위한 어레이에 걸쳐; 따라서, 추가 리간드에 이온 채널을 분류하면, 게이트 mechanosensitive, 전압 게이트, 또는 열에 민감한 타입. 이 글에서, 프로토콜은 패치 클램프 기술을 사용하여, 리간드 게이트 채널, NMDA 수용체 및 mechanosensitive 채널, PIEZO1에서 1 채널 활동을 기록 할 수 있도록 서술되어있다.0; 패치 클램프 전기 생리학 단일 분자 1, 2의 관찰을 허용하도록 충분히 민감한 첫 번째이자 가장 널리 사용되는 실험 방법이다. 이 절묘한 감도 이외에, 그것은 크게 전기 생리 기록 의무 생물학적 제제를 확장하고 또한 양막에있는 이온 채널의 관찰을 허용했다. 클램핑 전압 및 전류의 기록이 모두 동일 전극으로 수행되기 때문에 먼저, 그것은 작은 세포 또는 세포막 패치 걸쳐 신호를 기록하는데 사용될 수있다. 이 기술은 이온 채널이 개구리의 근육, 장어 electroplaques, 또는 오징어 거대한 축삭 3, 4, 오히려 그들이 횡단 신호 전달 메커니즘의 유비쿼터스기구를 대표하고 단방향 또는 모든 세포막 유형에 본질적인 것으로의 흥분 막에 제한되지 않는 것으로 나타났다 다세포 생물, 또한 세포 세포막에. 수입antly, 단순히 그대로 셀에 유리 피펫을 부착하여 횡단 전류를 기록 할 수있는 기능은 기본 파쇄되지 않은 세포막에있는 이온 채널에서 활동을 기록 할 수있는 전례없는 기회를 제공했다. 따라서,이 프로토콜에서 설명하는 세포 부착 패치 - 클램프 기술은, 최소한 수십 또는 네이티브 환경 이상 연속 이온 채널의 활성을 모니터링 허용한다. 보통 열 변동에 따라, 이온 채널 단백질을 포함한 모든 단백질은, 사이드 체인의 움직임과 전체의 재배치로 표현 훨씬 느린, 덜 자주 변경에 의한 가능성이 가장 높은 표현하는 가장 빠르고 가장 빈번하게 재 배열로, 다양한 시간 규모에 구조적인 변화를 겪을 도메인이나 서브 유닛, 또는 포스트 번역 상 수정 또는 단백질 - 단백질 상호 작용 (5, 6)에 의해 일부의 경우. 하나의 분자에 의해 생성 된 활동의 긴 기간을 준수하면 기능을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다tional의 본래 생리 세포막에있는 이온 채널의 역학은 관찰 된 분자의 작동 메커니즘에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 세포 유형 및 발달 단계에 걸쳐 이온 채널, 네이티브 세포막 이온 채널의 분자 조성에 대한 지식의 다양성 증가 이해와 대조적으로 여전히 제한된다. 모든 이온 채널은 다중 체 단백질 및 네이티브 이온 채널의 대부분은 종종 다양한 컨덕턴스 및 게이팅 특성이 수반되는 다양한 분자 다양성의 단백질을 생산하는 여러 종류의 서브 유닛에서 조립한다. 이 때문에, 정의 분자 조성물의 이온 채널은 이종 시스템에서 발현에 다룬다. 특히, 불멸의 인간 배아 신장 세포 (7)의 클론 라인입니다 HEK293 세포는 재조합 이온 채널의 이종 식에 대한 선호 시스템으로 광범위한 수용을 얻었다. 남자 중이온 채널 전기 생리학에 대한 선택 시스템으로 HEK293 세포를 상승 Y 장점은 간편하고 배양 능력이며, 수명이 긴 안정 문화를 유지, 번역 후 폴딩, 가공, 포유 동물 단백질의 거래를 수행 할 수있는 능력, 그리고 많은 경우에 그들의 낮은 수준 또는 그 7, 8 채널의 내인성 표현의도 부재. 재조합 이온 채널을 표현하고 HEK293 세포에서의 기능적 특성을 연구하는 구조 기능의 이온 채널의 특성뿐만 아니라 이온 채널 이소 및 기본 조직에서 자신의 역할의 특정 속성에 대한 정보를 얻을 수있는 유용한 방법이 될 것을 계속한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 HEK293 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널 및 네이티브 이온 채널에 동일하게 잘 적용될 수있다. 요약하면, 전례없는 능력을 통해 패치 클램프 기술은 신호를 해결하기 위해한 분자에서의 날짜에, 단일 분자의 거동을 관찰하기위한 가장 직접적인 방법 남아있다. 그 셀에 연결된 모드에서 패치 클램프 기록을 한 분자에 대해 수행 될 때, 이온 채널의 동작에 뛰어난 통찰력을 제공 할 수있는, 긴 관측주기를 허용한다. 아래는 하나의 이온 채널 단백질을 함유하는 세포 부착 패치로부터 고해상도 현재 녹화를 얻기위한 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>화학 물질</td><td>: Sigma</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate Glass</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>명시야 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>1x51</td><td>Nikon에도 유사한 현미경이 있습니다.</td></tr> 형<tr><td>광 상자</td><td>X-cite</td><td>시리즈 120</td><td></td></tr><tr><td>액체 광 가이드</td><td>X-cite</td><td>OEX-LG15</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Tektronix</td><td>TDS1001</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>분자 장치</td><td>Axon Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>테이블</td><td>TMC</td><td>63561</td><td></td></tr><tr><td>NIDAQ 카드</td><td>National Instruments</td><td>776844-01</td><td></td></tr><tr><td>풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>폴리셔</td><td>Narishige</td><td>Microforge MF-830</td><td></td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>TMC</td><td>8133306</td><td></td></tr><tr><td>고속 압력 클램프</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA HSPC</td><td></td></tr><tr><td>압력/진공 펌프</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA PV-PUMP</td><td>FOR HSP-1</td></tr></tbody></table>

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

이온 채널 단백질은 생물의 세포막에 걸쳐 빠른 통신을위한 보편적 인 장치입니다. 그들이 생성하는 이온 플럭스의 시간 서명은 각 채널 단백질뿐 아니라 생성하고 제어하는​​ 메커니즘에 대한 고유 특성에 따라 현재 연구의 중요한 영역을 나타냅니다. 이온 채널 단백질의 동역학 연산에 대한 정보는 단일 분자에 의해 생성 된 전류의 긴 뻗기를 관찰함으로써 수득 될 수있다. 리간드 게이트 이온 채널, NMDA 수용체에 대한 하나의 채널 세포 부착 된 패치 클램프 현재 녹음을 얻기위한 프로토콜이 여기에 설명, 대뇌 피질의 신경 세포 HEK293 세포 또는 기본적으로 발현 된. 또한 메카에 민감한 채널 PIEZO1의 예를 제시하여 관심의 다른 이온 채널에 방법을 적용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 방법은 채널의 전도도 특성 및 OPE의 시간적 순서에 관한 데이터를 제공 할 수 있습니다따라서 건강과 질병에서의 기능을 이해하는 데 도움이 채널의 활성화 메커니즘을 구성하는 N-폐쇄 입체 형태.

재조합 NMDA 수용체 NMDA 수용체 결합과 두 개의 공동 작용제의 수반하는 작업에 응답 글루타민산과 글리신. 그들은 GluN1 서브 유닛과 GluN2 서브 유닛을 바인딩 두 글루타민산 바인딩 두 글리신 heterotetramers로 조립합니다. GluN2 서브 유닛은 뇌에서 가장 널리 전사 형태의 청소년 동물 성인 GluN2B에 GluN2A 4 개의 유전자 (AD)에 의해 이들의 인코딩된다. 때문에 (도 1a) 서브 유닛 조성의 제어뿐만 아니라, 미세하게 연마 된 유리 피펫 (도 1C)를 사용하여 채널에서의 전류를 기록하는 기능을 허용 HEK293 세포 수용체를 발현하는 천연 제제에서 NMDA 수용체 아형의 다양성. 피펫 셀 닿아 일단 테스트 펄스 파형의 진폭의 감소는 클리어 시일을 형성 할 수있는 능력을 나타낸다 (...

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

이 절차의 전반적인 목표는 단일 이온 채널을 통해 흐르는 전류를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 실험 목적에 적합하고 다루기 쉬운 세포에 관심 대상인 이온 채널을 이종 발현시켜 수행합니다. 두 번째 단계는 화염 연마된 피펫을 사용하여 세포막에 안정적인 씰(seal)을 형성하는 것입니다.다음으로, 실험자는 패치에 존재하는 채널 수를 결정해야 하며, 단일 채널 전류 기록인 경우 마지막 단계로 데이터를 처리하고 분석합니다. 궁극적으로, 단일 이온 채널의 전류를 기록하는 것은 이러한 막 단백질이 작동하는 생물물리학적 특성을 조사하는 데 사용되며, 이는 뉴런 및 기타 흥분성 세포가 소통하는 방식의 기초가 됩니다. 여러 개의 활성 이온 채널을 통해 흐르는 전류를 측정하는 방법과 달리, 이 접근법의 장점은 개별 이온 채널을 통해 전류를 측정함으로써 특정 채널 고유의 광범위한 반응 패턴을 시각화하고 분리할 수 있다는 점입니다.이 방법은 생리학적 및 치료적 조절제가 뉴런 간의 통신에 어떤 영향을 미치는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 단일 이온 채널만 포함하는 저잡음 기록을 얻는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법을 처음 시도할 때는 누군가 수행하는 것을 보는 것이 매우 유용한데, 이 방법에서 가장 중요한 요소인 매우 안정적인 씰(seal)을 형성하려면 특정 각도로 세포에 조심스럽게 접근해야 하며, 무엇보다 끈기 있게 시도해야 하기 때문입니다. 형질전환(transfection)을 준비하십시오.HEK 293 세포를 35 mm 디쉬에 하루 전에 플레이팅하여 멸균 튜브 내에서 50~60%의 합류도(confluence)에 도달하게 합니다. transfection 혼합물을 준비합니다. 관심 있는 각 cDNA 1 µg, 2중 증류수 315 µL 및 42 mM HEPES 350 µL를 첨가합니다.마지막으로, 침전물을 형성하기 위해 35 µL의 calcium chloride를 한 방울씩 첨가합니다. 튜브를 5초 동안 볼텍싱한 후, 전날 플레이팅한 4개의 디쉬 각각에 175 µL의 transfection suspension을 첨가합니다.세포를 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. 다음으로, MDA 수용체 매개 흥분성 독성을 방지하기 위해 2 mM magnesium chloride가 첨가된 성장 배지 2 mL를 추가합니다.먼저 수직 풀러(vertical puller)를 사용하여 붕규산 유리로부터 대칭형 기록 피펫 두 개를 뽑아냅니다. 다음으로, 적절한 직경과 저항을 얻기 위해 화염 연마(fire polishing) 과정이 필요합니다. 이어서 QUB 데이터 수집 소프트웨어를 실행하고 수집 창을 선택하여 기록 설정을 완료합니다.Layout 메뉴에서 'new data'를 클릭하여 새로운 QUB 데이터 파일을 열고, 사용할 실험 매개변수를 입력하십시오. 데이터 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 후 'properties'를 선택하고 'data' 탭을 클릭하여 진폭 스케일링(amplitude scaling)을 0.1 volts per pico amp로 조정하십시오.칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS 2 mL로 배지를 교체한 후, 세포가 담긴 디쉬를 현미경 스테이지 위에 올립니다. 위상차 현미경을 사용하여 세포 영역의 초점을 맞추고, 세포가 건강하게 단층 형태로 디쉬에 잘 부착되었는지 확인합니다. 형광 검출 모드로 전환하여 형질전환이 성공적으로 이루어졌는지 확인합니다.다음으로, 단일 채널 기록을 위한 파라미터를 설정합니다. 모드를 voltage clamp로 설정하고, voltage holding 명령을 사용하여 인가 전압을 +100 mV로 설정합니다. off 위치에서 형광 및 전체적인 외관을 바탕으로 seal test 버튼을 선택하십시오.위상차 현미경 하에서 디시에 잘 부착되어 있고, 패칭을 위해 세포 표면의 상당 부분이 노출되어 있으며, 전반적으로 건강해 보이는 세포를 선택합니다. 새로 연마한 피펫에 NMDA 수용체 및 cell-attached 실험에 적합한 용액을 채우고, 가볍게 튕겨 기포를 제거합니다. 기록용 피펫을 앰플리파이어 헤드 스테이지에 고정하고, 배양액이 피펫 내부로 유입되는 것을 방지하기 위해 은선(silver wire)이 피펫 용액에 잠겨 있는지 확인합니다.접근 과정에서 피펫 홀더에 연결된 소형 플라스틱 시린지를 사용하여 양압을 부드럽게 가합니다. 다음으로, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 배스(bath) 내부로 안내합니다. 전기 회로를 폐쇄한 후, 패칭(patching) 대상으로 선택한 세포 바로 위에 피펫을 위치시킵니다.욕조(bath)에 진입할 때 오실로스코프를 확인하십시오. 현미경으로 피펫의 위치를 시각적으로 모니터링하는 동시에 오실로스코프로 전기적 저항을 모니터링하며, 피펫 저항이 최적 범위 내에 있는지 확인해야 합니다. 피펫이 세포에 부드럽게 닿을 때까지 조금씩 접근을 계속하십시오.저항이 증가했음을 나타내기 위해 테스트 신호가 약간 감소합니다. 밀봉을 형성하려면 시린지를 잡고 측면 튜브를 통해 약간의 음압을 조심스럽게 가합니다. 시린지 플런저를 당겼을 때 오실로스코프상의 테스트 신호 파형이 완전히 평평해지면 밀봉이 형성된 것입니다.증폭기에서 외부 명령 토글 스위치를 seal test에서 off로 전환합니다. 전압 유지 명령 스위치를 off에서 positive로 전환하고, 게인을 10 x에서 100 x로 높입니다.오실로스코프에서 채널 활성도를 관찰하십시오. 활성도가 있는 경우, 이전에 평평했던 기선(baseline)으로부터 아래쪽으로 향하는 사각형 모양의 편향으로 표시됩니다. 오실로스코프에 채널 활성도가 표시되면, QUB의 재생 버튼을 누른 후 기록 버튼을 눌러 이전에 열어둔 디지털 파일에 데이터 수집을 시작하십시오. 데이터 수집을 중단하려면 QUB의 정지 버튼을 누르고 QDF 파일을 저장하십시오. 신호가 완전히 평평해지지 않거나 기선이 노이즈가 많고 불안정해지는 경우 씰(seal)이 약함을 나타낼 수 있습니다.이 경우, 피펫을 제거하여 폐기하고 적절한 밀봉이 이루어질 때까지 새 피펫으로 다음 단계들을 반복하십시오. 데이터 분석 과정을 시작하려면, QUB에서 기록된 데이터 파일을 열고 pre 인터페이스에서 현재 트레이스를 검토하십시오. 레이아웃(layout) 항목 아래에서 확인하십시오.fc라고 표시된 확인란의 체크를 해제하여 디지털 필터를 제거하고 기록된 트레이스를 전체 대역폭으로 표시합니다. 트레이스를 시각적으로 스캔하여 불규칙한 부분과 일시적인 아티팩트를 찾습니다. 전류 스파이크는 동일한 전도도 클래스의 인접한 깨끗한 영역을 강조 표시하여 수정할 수 있습니다.마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 먼저 'set erase buffer'를 선택한 다음, 개별 샘플 포인트가 보일 때까지 스파이크 부분을 확대합니다. 교체할 영역을 하이라이트하여 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 'erase'를 선택하여 전체 기록의 베이스라인을 수정합니다.베이스라인이 안정적인 기록의 초기 부분을 선택하여 0전류 베이스라인을 정의하십시오. 해당 부분을 강조 표시한 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 'set baseline'을 선택하십시오. 베이스라인 가이드라인이 나타나면, 시각적 검사를 통해 베이스라인 수준이 정확하게 표시되는지 확인하십시오.기록에서 원시 데이터 베이스라인이 설정된 베이스라인으로부터 눈에 띄게 벗어나는 지점을 확인하십시오. 편차가 발생하는 영역 내에서 베이스라인의 작은 섹션을 선택하여 이를 수정하십시오. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 베이스라인 노드 추가 명령을 선택하십시오.쉽게 수정할 수 없는 과도한 노이즈나 아티팩트가 간헐적으로 포함된 기록이 있는 경우, 해당 부분은 삭제해야 하며, 이를 위해 먼저 연속적인 세그먼트로 분할해야 합니다. 삭제할 영역의 바로 앞부분을 하이라이트하십시오. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 세그먼트 분할(break segment)을 선택하십시오.그 다음, 삭제할 섹션을 하이라이트한 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고, select, delete를 선택한 뒤 enter 키를 눌러 기록을 이상화합니다. 레이아웃의 MOD 인터페이스로 전환하십시오. 데이터 표시 패널에서 폐쇄 및 개방 이벤트가 모두 포함된 기록의 일부분을 선택합니다.커서를 아래의 고해상도 패널로 이동한 다음, 선택된 트레이스 내에서 기저선을 대표하는 깨끗한 구간을 하이라이트하십시오. 커서를 아래의 모델 패널로 이동하여 닫힘 상태를 나타내는 검은색 사각형을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 grab을 선택하십시오. 채널 열림의 경우, 오픈 컨덕턴스를 나타내는 트레이스의 일부를 하이라이트하여 동일한 절차를 반복하십시오.모델 패널에서 빨간색 사각형을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 grab을 선택하십시오. 데이터 소스의 SEL 버튼을 선택하여 레코드의 선택된 부분에 대해 이상화를 수행하십시오. 그런 다음 팝아웃 패널의 모델링 섹션 아래에 있는 idealized 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오.분석을 위한 설정 파라미터가 정확한지 확인한 후 실행(run)을 클릭합니다. 선택한 영역에 대한 이상화(idealization) 결과와 진폭 히스토그램이 데이터 위에 겹쳐져 표시되므로, 이를 통해 이상화 상태를 시각적으로 검토할 수 있습니다. 필요한 경우, 최적의 결과를 얻기 위해 이상화 파라미터를 조정한 후 다시 수행하십시오. 데이터 소스(data source) 아래의 파일(file) 버튼을 선택하면 파일 전체에 대해 이상화를 수행할 수 있습니다.그런 다음 idealized 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 run을 클릭하십시오. 전체 파일에 대한 결과가 표시됩니다. 데이터 위에 겹쳐진 상태에서 idealized 트레이스와 기록된 데이터 사이의 일치 여부를 주의 깊게 점검하십시오.때때로 이상적인 트레이스(trace)에서 제외되어야 할 이벤트가 잘못 식별될 수 있습니다. 잘못 식별된 이벤트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 join IDL을 선택하십시오. 여기에는 HEK 2 93 세포 내 단일 NMDA 수용체를 통해 흐르는 칼슘 이온 전용 전류가 표시되어 있습니다.세포 부착 패치 클램프 기술을 사용하여 데이터를 이상화하면 진폭 히스토그램이 생성되며, 이 세포에서는 두 개의 뚜렷한 전도도 클래스에 잘 부합합니다. HEK 293 세포의 부착 기록에서, 전압을 일정하게 가하는 동안 패치 피펫을 통해 -20 mM 수은 압력에 의해 하나의 Meno 민감성 채널이 활성화됩니다.빨간색 점선은 전류 제로 레벨을 나타냅니다. 천연 채널(native channels)에서 얻은 이 기록들은 쥐 배아의 전전두엽 피질에서 분리하여 5일 또는 27일 동안 배양한 뉴런의 세포체(soma)에서 기록된 지속적인 NMDA 수용체 활성을 보여줍니다. 이 절차에 숙달되면, 기록 시간에 따라 30분에서 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라, 채널의 게이팅 메커니즘을 결정하고 반응 속도를 추정하기 위해 키네틱 분석 및 상태 모델링과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 단일 이온 채널 단백질을 통과하는 전류를 기록하고 분석을 시작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

one-channel-cell-attached-patch-clamp-recording

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

우리는 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 패치 클램프 녹음 (CRAC) 말초 혈액 mononuclear 세포 - 파생 인간 T의 lymphocytes의 전류에 대한 단계별 절차를 제공합니다.

인간의 T Lymphocytes에서 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 기록 (CRAC) 해류

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

이 비디오는 뉴런 발화 패턴을 분석하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 척수 절편의 SG(substantia gelatinosa) 뉴런에서 전기생리학적 기록을 수행하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 척수의 SG 뉴런의 자극에 대한 신경 반응을 연구할 수 있습니다.

척수 절편의 실질체 젤라티노사 뉴런에서 기록하는 전체 세포 패치 클램프

이 비디오는 패치 클램프 기술을 사용하여 유변기저와 막 전위를 측정하고 증분 전류 주입에 대한 뉴런의 반응을 분석하여 등쪽 신경절의 감각 뉴런 흥분성을 검사하는 방법을 보여줍니다.

온전한 쥐 등쪽 뿌리 신경절에 대한 전체 세포 패치 클램프 기록

우리는 zebrafish의 배아에서 MAUTHNER 뉴런과 다른 reticulospinal 세포 패치 클램프 녹음을 통해 전기적 활동을 기록하고 모니터링 할 수있는 그대로 뇌 - 척수 준비를 개발했습니다. 따라서, 우리는 배아의 주요 신경 세포에서 흥분성과 억제 성 시냅스 전류, 전압 문 채널 활동 및 활동 전위를 기록 할 수 있습니다.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

이 원고는 패치 클램프 기록을 위해 온전한 등쪽 뿌리 신경절을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 제제는 뉴런과 위성 신경교세포의 미세환경을 유지하여 해리된 DRG 뉴런에서 볼 수 있는 표현형 및 기능적 변화를 방지합니다.

성인 쥐에서 본래 등쪽 뿌리 신경절에 패치 클램프 녹음

이 기사에서는 HEK293 세포를 사용한 전기생리학적 전체 세포 패치 클램프 기록으로 채널로돕신의 이온 선택도를 측정하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 음이온 선택성 채널로돕신의 염화물 선택성을 조사하기 위한 실험 절차를 설명합니다. 그러나 이 절차는 뚜렷한 선택성을 가진 다른 채널로돕신으로 이전할 수 있습니다.

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

배우세요 세포 부착 패치 클램프 기법을 사용하여 단일 이온 채널의 전류를 측정하는 방법을. 이 기술은 신경과학 및 세포 생물학 연구에서 이온 채널의 생물물리학적 특성을 실시간으로 관찰하고 분석하는 데 활용됩니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

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