Name: 의 Permeabilization의 방법 초파리 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 배우세요 Drosophila 태아의 투과성 처리 방법으로 소분자 약물 및 독소의 생물학적 활성을 테스트합니다. 표백제와 용매를 이용해 난각층을 제거하고 형광 현미경으로 조직 발달에 미치는 영향을 분석합니다.

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이 작업은 NIH/NIEHS R03ES021581(M.D.R.에 수여) 및 University of Rochester Environmental Health Center(NIH/NIEHS P30 ES001247)의 지원을 받았습니다.

1. 플라이 문화, 솔루션 및 배아의 취급 장치의 제조 <ol><li> 초파리의 가두리를 준비합니다. 10cm 포도 한천 플레이트 효모 붙여 넣기의 자리가 장착 된 인구 케이지에서 원하는 변형 500 + 짝짓기 파리를 놓습니다. 25 ° C의 습도 조절 배양기에서 문화를 유지한다. 주 : &#160; 케이지 문화가 일치 배아 누워 패턴을 얻기 위해 에어컨의 하루 이틀이 필요합니다. 효모 붙여 넣기 포도 플레이트를 조절하는 동안 아침에 한 번 저녁에 한 번 변경됩니다. </li><li> EPS를 준비합니다. 37 ° C에서 계면 활성제 (코카 미드 DEA 및 에톡 시화 알콜)의 따뜻한 솔루션 피펫 작은 교반 막대가 구비 된 유리 신틸레이션 바이알에, D-리모넨 18 밀리리터. 피펫 D-리모넨에 1 ㎖의 두 계면 활성제 (각 5 % 최종 농도)의 각. 철저하게 혼합 및 교반 막대를 제거합니다. 주 : EPS의이 원액은 실온에서 약 2 달을 위해 좋다. 솔루션37 ° C 올라가면 완전히 사용하기 전에 계면 활성제를 용해하는 소용돌이해야합니다. 그들은 시간이 지남에 따라 일부의 플라스틱을 용해하므로 EPS 및 D-리모넨은 유리 용기에 저장되어야한다. </li><li> 배아 dechorionation 솔루션, 배양 매체, 염료 및 약물 솔루션을 준비합니다. 25 ML의 H 2 O와 얕은 접시에 장소 표백제 25 ㎖를 혼합한다. 이전의 레시피 1,12에 따라 수정 기본 배양 배지 (MBIM) 및 MBIM-T를 준비합니다. 방패를 준비하고 (자료 목록을 참조하십시오) 제조 업체의 프로토콜에 따라 M3 세포 배양 배지와 PBS를 불렀다. DMSO에 10 mM의 농도에서 permeabilization 염료의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> 배아 처리 장치 및 소모품을 조립 : <ol><li> dechorionation 및 EPS 처리 바구니 (그림 1A 참조) 준비합니다. 미세 톱니 보았다 일회용 50 ㎖ 폴리 프로필렌의 원심 분리기 / 문화 튜브의 3cm 부분을 잘라. 부착 사포의 튜브 부분을 문질러서 용접 표면 세척을벤치 탑 표면에. 용접 불꽃 위에 튜브 섹션의 림을 용융 유리 접시에 메쉬에 눌러 Nitex 나일론 메쉬 튜브 섹션. 식지 여분의 메쉬를 트림. 참고 : 깎아 지른듯한 측면과 하단은 각각의 단계에서 잔류 표백제 EPS 떨어져 신속하고 완벽한 세척을 위해 수 있습니다. 용접 단계 흄 후드에서 수행되어야한다. </li><li> 개발 바구니를 준비합니다. 뚜껑의 가장자리와 같은 높이가 50 ㎖ 원심 분리기 / 문화 튜브의 상단 부분을 잘라. 제거 및도 1b에 도시 된 바와 같이 림을 따라 중앙 개구부와 노치를 절단하여 캡을 수정한다. 메시에와 차단 튜브 섹션의 스레드 캡 나사 및 여분의 메쉬 트림. 참고 : 캡은 60mm 저수지 접시 (그림 1B &#39;)에 위치 할 때 대량 매체에 확산을 허용하는 테두리에 노치가 포함되어 있습니다. </li><li> 슬라이드 챔버의 구성 요소를 준비합니다. 보다 큰 DO 막 사각형을 잘라슬라이드 챔버 개방. 개구부의 내부 입술에 진공 그리스의 매우 얇은 층을 적용하십시오. 리테이너 링 그리스에 대해 그것을 밀봉 구멍에 DO 막 부착합니다. 가까운 리테이너 링을 다시 절단하여 초과 DO 막 트림. 참고 :. 슬라이드 챔버에 대한 사양 Kiehart 등 13에서 찾을 수 있습니다이 챔버는 상업적으로 사용할 수 없습니다 및 기계 상점에 의해 정의 제조가 필요합니다. </li></ol></li></ol> 2. 준비, Dechorionation 및 태아의 EPS 치료 <ol><li> 시간을 재는 수집에 의해 배아를 준비. AM의 비행 문화 케이지에 신선한 포도 / 효모 판을 설정합니다. 배아가 25 ℃에서 1 시간 동안 배치 할 수 이 판을 취소하고 25 ℃에서 2 시간의 후속 배아 누워에 대한 신선한 포도 / 효모 플레이트로 교체 또한 개발 준비를위한 18 ° C의 배양기에서이 판과 장소를 수집합니다. 주 : 25 ° C에서의 개발의 1 시간은 개발의 2 시간과 동일18 ° C에서 최종 단계의 배아에서 EPS의 permeabilization을 유지하는 25 ° C에 비해 18 ° C에서 노화의 효과는 그림 2에서 볼 수 있습니다. </li><li> Dechorionation. 조심스럽게 25 ° C의 수돗물과 붓을 사용하여 메쉬 바구니에 포도 판의 오프 배아를 씻어. 멀리 수돗물의 부드러운 스트림에서 바구니에 배아를 초과하는 효모를 씻어. 2 분 동안 50 %의 표백제에 바구니를 담근다. 철저하게 수돗물의 흐름에 따라 배아를 씻으십시오. 참고 : 부드럽게 간헐적으로 플라스틱 피펫을 사용하여 배아에 표백제 용액을 분출. 2 분 완료 dechorionation 보통 충분하지만,이 배양 시간은 직접 검사에 의해 확인하고 그에 따라 조정되어야한다. 수돗물에 침지 바구니에 dechorionated 배아를 유지하고 EPS 단계로 바로 진행합니다. </li><li> EPS 치료 <ol><li> 각 PBS의 약 10 ㎖로 여섯 60mm 요리를 준비합니다. 2.925 ㎖의 MBI에 75 μL의 EPS를 용해하여 EPS 희석을 준비소용돌이와 함께 50 ㎖ 유리 비이커 M (1시 40분). 참고 :이 혼합물에서 화이트 에멀젼 형태. </li><li> 닦아 실험실과 메쉬 바구니의 바닥에서 여분의 물을 더 럽히. 비커에 희석 EPS에 바구니를 담그고 즉시 바구니의 바닥에있는 EPS 용액에 배아를 분산 소용돌이 친다. 30 초 동안 동작을 소용돌이 계속합니다. NOTE : EPS 희석 및 노출 시간은 투과성을 제어하도록 변할 수있다. 그것은 최적의 EPS 희석 및 처리 시간이 사용중인 파리의 변종으로 경험적으로 확립하는 것이 좋습니다. 60-90 초의 노출 시간을 증가 시키면 스테이지 (12)와 세 배아 유리하다. </li><li> 바구니를 제거 닦아 랩으로 초과 EPS를 멀리 얼룩. 60mm 요리에 PBS 10 ㎖ 여섯 연속 세척을 진행합니다. 부드럽게 여섯 씻어 각 PBS와 배아를 분출하기 위해 플라스틱 피펫을 사용합니다. 염색 진행 및 약물 치료의 단계. 주 : EPS는 싱크대 아래로 배치 될 수있다. </li></ol></li></ol>Permeabilized 태아의 3. 염료와 약물 치료 <ol><li> 염료 치료 <ol><li> 10 mM의 CY5 카르 복실 산 염료 * 1.5 ML의 microfuge 튜브와 혼합하는 소용돌이에 MBIM-T (50 μM 최종 농도)의 ML 1의 5 μl를 추가합니다. 주 : * 염료의 선택은 다운 스트림 분석에 따라 달라집니다. CY5 카르 복실 산 고정 및 면역 염색을 사용하여 이후의 분석에 효과적입니다. 로다 민 B는 살아있는 배아의 분석에 유용합니다. 로다 민 B의 적색 발광, 그 대사 산물 (1)의 녹색 발광 형광을 사용하여 다운 스트림 응용 프로그램과 몇 가지 합병증을 표시 할 수 있습니다. 약물 또는 독소는이 단계에서 치료를 시작하기 위해, 또는이 단계에서 펄스 ​​약물 / 독소 처리를 제한하는 염료 용액에 첨가 할 수있다. 케어 MSDS 및 환경 안전 표준에 따라 처리하고 약물과 독소를 처리하기 위해주의해야한다. </li><li> 붓을 사용하여 염료 용액에 메쉬 바구니에서 배아를 전송합니다. 튜브 캡을 보장하기 위해 반복적으로 반전배아는 염료 용액에 현탁 자유롭게 떠. 실온에서 15 분 동안 경동 로커에 튜브를 놓습니다. </li><li> nutator에서 튜브를 제거하고 배아가 정착 할 수 있습니다. 미세 피펫 염료 용액을 제거하고 씻어 MBIM-T 1 ㎖​​로 대체합니다. 완전히 배아를 다시 일시 중단 튜브를 반전. 배아가 정착하자 및 3 개의 MBIM-T 세척으로 반복합니다. 마지막 헹굼에서 모든 MBIM-T를 제거하고 배양 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 배아 개발을위한 인큐베이션 <ol><li> 개발 바구니 또는 슬라이드 실 : 두 개의 챔버 중 하나에 배아를 전송합니다. NOTE : 개발 바스켓 이상 발달 동안 바람직하고, 후속의 고정 및 면역 염색 단계가 실행되는 경우에 필요하다. 슬라이드 챔버는 높은 해상도 시간 경과 이미징을위한 최적 짧은 개발 기간 (예를 들어, 초기 배아 이벤트)에 가장 효과적이다. 약물이나 독소는 다양한 농도와 배아 D에서 배지에 첨가 할 수있다evelopment 표준 고정을 사용하여 프로토콜을 면역 염색 라이브 배아 또는 엔드 포인트에서 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 바구니 개발 <ol><li> 70 % 에탄올로 분출에 의해 개발 바구니를 청소, 탈 이온수로 깨끗이 씻어 닦아 실험실로 건조시킨다. 약물이나 독소를 원하는 농도로 배양 배지 6 ㎖를 준비합니다. 메쉬베이스에서 60mm 접시 돌보는에 트래핑하지 기포의 매체에 개발 바구니를 놓습니다. 참고 : 두 개의 미디어가 일반적으로 사용되는 : 50:50 혼합물 혼자 MBIM, 또는 MBIM/M3, 후자는 긴 개발 기간 동안 더 효과적. </li><li> 페인트 브러시와 바구니의베이스 표면 메시 permeabilized 배아를 전송합니다. 조심스럽게 주변 저수지에서 미디어와 배아를 분출. 그들은 메시에 단일 층에 있도록 페인트 브러시와 배아를 분산. 주 : 현미경 영상을 진행하고 홍보의 permeabilization과 생존 특성을 평가eparation (단계 4 참조). </li></ol></li><li> 슬라이드 챔버 개발 <ol><li> 슬라이드 실 전환 및 개구부의 둘레에 진공 그리스의 작은 구슬을 적용합니다. 오프닝 내 DO 막의 표면에 약물 또는 독소의 원하는 양의 매체 150 μl를 놓습니다. 참고 : 두 개의 미디어가 일반적으로 사용되는 : 50:50 혼합물 혼자 MBIM, 또는 MBIM/M3, 후자는 긴 개발 기간 동안 더 효과적. </li><li> 페인트 브러시와 미디어의 하락 permeabilized 배아를 전송합니다. 그들이 드롭 내 막에 정착하는 배아를 분산. </li><li> 조심스럽게하여 매체를 평평 입구에 25mm 원형 커버 슬립을 적용합니다. 그리스와 인감을 형성하는 커버 슬립의 주변을 따라 부드럽게 누르십시오. 주 : (4 단계 참조) 준비 permeabilization과 생존 특성을 평가하기 위해 영상을 현미경로 이동합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. IdentiPermeabilized 실행 가능한 태아의 문법을 없애는 <ol><li> permeabilized 배아를 식별합니다. 디지털 카메라를 탑재하여 표면 형광 현미경 하에서 배아를 관찰한다. 고정 현미경과 카메라 설정을 사용하여 여러 필드 (프로파일 노른자 형광도를 결정하기 위해 파란색 파장) 이미지를 획득. </li><li> 상대 형광 강도에 따라 배아의 permeabilization를 결정합니다. 바구니를 수용하고 배아의 조작을 할 수 있도록 큰 작동 거리와 입체 현미경을 사용합니다. 현미경은 프로그램 XYZ 스테이지, 표면 형광 조명 및 디지털 카메라가 장착되어야한다. 이미지는 나중에 지점에서 동일한 배아의 재평가를 가능하게 노출하고 각 배아 이미지의 무대 위치 매개 변수를 기록 돌보는 배아 (그림 3의 대표적인 결과 참조). 주 : 염료의 흡수 패턴은 사용 된 염료, 노출과 태아 연령의 길이에 따라 달라집니다. 넓은 범위의하나의 준비에서의 염료의 흡수는 전형적인하고 permeabilization의 정도의 변화를 반영한​​다. </li><li> 가능한 배아를 식별합니다. permeabilized 배아의 위치를​​ 표시 한 후, 실내 온도 25 ℃에서 배아 발달과 함께 계속 현미경 바구니 또는 슬라이드 챔버를 반환합니다. 파랑 채널 형광에서 관찰하고 이전에 확인 된 permeabilized 배아의 노른자 형광도의 이미지를 획득. 노른자 분포의 정상적인 진행에 따라 생존 능력을 평가 (랜드 등. 1과 그림 3의 대표적인 결과 참조). 주 : 명 시야 현미경으로 관찰 배아의 다른 형태의 특징 생존력을 평가하기 위해 사용될 수있다. 그것은 생존과 호환되는 투과성의 수준을 설정하면 각각의 염료 사용 파리의 변형으로 경험적으로 결정하는 것이 좋습니다. </li><li> permeabilized 가능한 배아 약물 또는 독소의 효과를 평가합니다. </li><li> proce 배아위의 프로토콜은 기존의 번호를 태세와 ssed은 약물이나 독소에 노출 이후의 분석. 분석의 여러 유형 중 일부는 아래의 설명에서 고려 직접 라이브 배아의 형태 형성의 관찰뿐만 아니라 사후 고정 면역 염색 분석을 포함한다. 이러한 방법은 모두 유전자 발현 패턴과 세포 계통 및 형태학 프로파일을 계시 중요한 염료 (예를 들면, GFP)을 사용하여 강화된다. </li></ol>

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</ol>

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위의 방법은 다양한 개발 범위에 걸쳐 작은 분자 치료에 접근 가능한 Drosophila의 배아를 획득 할 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 이전에는 초기 단계의 배아에서와 같이 18 ° C에서 배아를 노화 동일한 효능과 최종 단계의 배아의 permeabilization을 가능하게하는 소설과 간단한 발견을 소개합니다. 또, 투과 표시와 같은 원적외선 염료 CY5 카르 복실 산의 사용은 포스트 픽스 애플리케이션에 효과 입증 발달 표현형을 나타 내기 위해 사용할 수있는 종래의 적색 및 녹색 형광 표식을 방해하지 않는다. 이러한 연구 결과는 크게 EPS 방법의 효능과 유틸리티를 진행. 이 방법은 생활과 고정 된 배아의 준비를 모두 분석에 대한 의무입니다. 시야 현미경 및 설정 슬라이드 챔버를 사용하여 배아 발달의 전반에 득점 전형적인 특징은 형태 발생의 움직임이다 등배반 엽, 두부 고랑 형성, germband 신장 및 germband 후퇴 1 ...

Drosophila의 배아 개발 2의 근본적인 메커니즘의 조사를 위해 최고의 모델이되고 있습니다. 이 강력한 모델은 임의의 시점에서 그리고 어떠한 현상 기관 내에 실질적으로 어떤 유전자의 조작을 허용하는 분자 유전 학적 도구의 다양한 배열에 의해지지된다. 초파리 배아의 형태 형성의 작은 크기, 빠른 개발, 다양한 특성은 기본적인 발달 경로에게 3,4를 발견했습니다 많은 것이 유전 스크린에 대한 선택의 모델을 확인합니다. Drosophila의 배아에 많은 표현형이 특징으로 쉽게 해석 할 수 있으며, 종종 비정상적인 특성에 대한 책임을 기본 분자 유전 학적 메커니즘을 식별 할 수있는 수단을 제공하고있다. 역사적으로, 플라이 배아 모델의 단점은 배아 조직에 작은 분자를 도입하는 어려움이있다. 1) 우리 :이 장애물에 대한 제한을 제기했다프로브가 발달 메커니즘을 심문하고 2) 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하는이 설립 모델을 사용하기로 알려진 생리 활성 작은 ​​분자를 주입. 결과적으로, 비행 배아의 스크리닝 전위 저분자 활성의 특성화에 미달되었다. 달걀 껍질의 1) permeabilization 2) 미세 주입 : 플라이 배아에 작은 분자의 배달은 두 가지 방법으로 달성 될 수있다. 이 문서에서는 기존의 초파리 실험의 설정에서 실행하기 쉬운 permeabilization 방법에 대한 발전을 제시한다. 이는 마이크로 유체 기술 마이크로 인젝션 방식에서 최근의 진보는 또한 배아 5,6 화합물에 도입하는 방법에 기여하는 것을 주목해야한다. 배아에 분자를 소개하는 껍질 (7)의 밀랍 층에 의해 방지 할 수있다. 초파리의 알 껍질은 5 개의 층으로 구성되어 있습니다. 부터인사이드 아웃 그들은 : 난황 막, 밀랍 층, 내부 융모막 층, endochorion 및 exochorion 8. 세 가지 외부 융모 층은 희석 표백제에있는 태아의 간단한 출현에 의해 제거 될 수있다, 단계 dechorionation라고도합니다. 그것은 내부 난황 막 쌌다 유지하면서 노출 된 왁시 층은, dechorionated 배아 투과성 렌더링 헵탄 및 옥탄 7,9 같은 유기 용매에의 노출에 의해 손상 될 수있다. 그러나 이러한 용매의 사용은 독성과 태아의 생존 능력 9,10에 뚜렷한 부정적인 영향이 둘 다 자신의 강한 permeabilizing 조치를, 조절에 어려움으로 인한 합병증을 소개합니다. 용매 조성물 칭했다 배아 permeabilization (EPS)를 사용 permeabilization의 방법은 이전에 1을 설명 하였다. 이 용매 miscibl되는 용매를 사용 D-리모넨 및 식물 유래의 계면 활성제로 구성수성 버퍼와 전자. D-리모넨 원하는 농도로 용매를 희석 할 수있는 능력의 낮은 독성이 높은 생존력으로 투과 한 배아를 생성하는 효과적인 방법을 수득했다. 그러나,이 내인성 인자는 애플리케이션에 제한을 가지고 계속했다. 첫째, 배아 관리가 가까운 개발 준비를 유지하기 위해 취해야하는 경우에도, EPS 처리 후 투과성의 이질성을 보여줍니다. 둘째, 약 8 시간보다 오래된 계란 11 누워 후 발생하는 껍질의 경화와 일치, 투과하기 어려운 입증 된 배아. 여기에 설명 된 EPS 방법의 발전은 그 : 1) 고정 및 면역 염색 단계를 실행하고 2)&gt; (늦은 발달 시점에서 8 시간, 단계 배아의 permeabilization을 활성화 한 후에도 거의 동일 permeabilized 배아를 식별하고 분석하는 데 도움이 12 세 이상). 특히, 원적외선 염료의 응용 프로그램,CY5 카르 복실 산을, 개발하는 동안 포름 알데히드 고정 후 배아에서 계속 투과성 표시기 역할이 설명되어 있습니다. 또한, 18 ° C에서 배아를 양육하는 최종 단계의 배아 (단계 12 ~ 16)의 permeabilization을 가능하게 EPS 민감한 상태에서 껍질을 유지 것을 알 수있다. 이러한 진보는 EPS 방법론에 앞서 언급 한 한계를 극복. 이 응용 프로그램은 따라서 생존 능력을 유지하면서 별개의 발달 시점에서 배아의 관심 작은 분자를 소개 할 수있는 방법으로 조사를 제공 할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>플라이 케이지</td><td>Flystuff.com</td><td>59-101</td><td>http://flystuff.com/general.php</td></tr><tr><td>코카미드 DEA [니놀 11-CM]&nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>특별 주문 요청</td><td>http://www.stepan.com/</td></tr> <tr><td>에톡실화 알코올 [Bio-soft 1-7]&nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>은 특별 주문</td><td>요청 http://www.stepan.com/</td></tr> <tr><td>d-limonene (초고순도 등급)</td><td>Florida Chemical Co.&nbsp;</td><td>특별 주문 요청</td><td>http://www.floridachemical.com/</td></tr> <tr><td>차아염소산나트륨&nbsp;</td><td>피셔</td><td>SS290-4</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr> <tr><td>트윈-20&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP337</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr> <tr><td>PBS 분말</td><td>Sigma</td><td>56064C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma</td><td>R6626</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>CY5 carboxylic acid</td><td>Lumiprobe</td><td>#23090</td><td></td></tr><tr><td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid DMSO</td><td>Sigma</td><td>472310-100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>방패와 Sang M3 미디엄</td><td>시그마</td><td>S8398</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Nitex 나일론 메쉬&nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>57-102</td><td>http://flystuff.com/misc.php</td></tr><tr><td>용존 산소(DO) 멤브레인&nbsp;</td><td>YSI</td><td>#5793</td><td>http://www.ysireagents.com/search.php</td></tr><tr><td>25mm 원형 no.1 커버 슬립&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48380-080</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr> <tr><td>포도-아가르 플레이트 믹스&nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>47-102</td><td>http://flystuff.com/media.php</td></tr><tr><td>너트 레이터</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr></tbody></table>

의 permeabilization의 방법<em&gt; 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한&gt; 태아

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Drosophila의 배아는 긴 개발을 제어하는 분자 유전 메커니즘을 해명하기위한 강력한 실험실 모형이다. 이 모델의 유전 조작의 용이성은 다른 동물 모델 및 세포 기반 분석에서 평범 약물 접근 방식을 대신하게했다. 여기에 우리가 개발 초파리 배아에 작은 분자의 응용 프로그램을 사용할 수있는 프로토콜의 최근의 진보에 대해 설명합니다. 이 방법은 태아의 생존 능력을 유지하면서 껍질의 불 투과성을 극복하는 단계를 자세히 설명합니다. 발달 단계의 넓은 범위에 걸쳐 달걀 껍질 permeabilization 용매 이전에 설명 D-리모넨 배아 permeabilization (1 EPS)의 응용 프로그램과 (18 ° C) 이전 치료에 감소 된 온도에서 노화의 배아에 의해 달성된다. 또한, permeabilization 표시로 원적외선 염료 (CY5)의 사용은 표준 빨간색과 녹색 독감을 포함한 다운 스트림 응용 프로그램과 호환되는, 설명라이브 및 고정 준비에 orescent 염료. 이 프로토콜은 발달 메커니즘을 조사뿐만 아니라 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하기위한 연구에하는 생리 활성 화합물을 사용하여 연구에 적용 할 수있다.

배아의 처리 장치는 위의 프로토콜에있는 조작에 대해 &quot;집에서 만든&quot;장치를 시각화 지원하기 위해 그림 1에 있습니다. 그림 2에 보이는 결과 개발 후반 단계에서 EPS로 permeabilized하는 능력에 18 ° C에서 배아를 양육의 강력한 효과를 보여줍니다. 이 조건은 프로토콜 2.1 단계에 적용된다. 일반적으로 EPS 처리 배아에서 볼 투과성의 다양한 수준을 나타 내기 위해 CY5 카르 복실 산 염료의 효과는 그림 3에서 볼 수있다. 노른자에 염료 분포의 발달 역학도 생존 능력을 평가하는 데 사용되는 기준을 공개, 그림 3에서 볼 수있다 , 프로토콜에 설명 된대로 4.2 단계. 독소 처리, 포름 알데히드 고정 및 면역 염색에 후속 배아 permeabilization을 결정 CY5 염료 유틸리티는도 4의 결과에 의해 도시된다. <p class="jov...

개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다.

의 Permeabilization의 방법<em&gt; 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한&gt; 태아

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

다음 실험의 전반적인 목표는 도입된 저분자 화합물 약물이나 독소의 생물학적 활성을 테스트하기 위해 투과성 난각을 가진 생존 가능한 초파리 배아를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 발달 단계별 배아를 희석된 표백제로 처리하여 외부의 융모막 난각 층을 제거함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 저분자 용질을 차단하는 얇은 왁스성 난각 층을 제거하는 용매로 배아를 투과시키는 것입니다.세 번째 단계는 배아를 약물 또는 독소 및 염료로 처리하여 난각의 투과성을 동시에 측정하고 관심 화합물을 도입하는 것입니다. 추가로 발달시킨 후, 배아를 직접 이미징하거나 면역조직화학 염색을 위해 처리할 수 있습니다. 최종적으로, 면역 시약 또는 생체 염색을 이용한 형광 현미경 관찰을 통해 조직 발달에 미치는 약물 또는 독소의 활성을 확인할 수 있습니다.오늘은 저분자 화합물의 활성 분석을 위해 초파리 배아를 투과시키는 저희의 방법을 소개하겠습니다. 헵탄과 같은 일반적인 유기 용매를 사용하여 난각을 투과시키는 기존 방법과 비교했을 때, 이 기술의 주요 장점은 저희의 배아 투과 용매(EPS)가 물과 혼합 가능하며 독성이 상대적으로 낮다는 점입니다.이러한 특성은 용매 노출을 더 정밀하게 제어할 수 있고 생리학적으로 적절한 배지에서 처리를 수행할 수 있게 하여, 결과적으로 배아의 생존율을 높이는 배아 처리 과정을 용이하게 합니다. 저는 달걀 껍질의 왁스 층을 어떻게 제거할지 고민하던 중 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 스키어로서, 스키 바닥에 남은 왁스를 제거하기 위해 시트러스 용매를 흔히 사용하는 점에 착안하게 되었습니다.이로 인해 저는 이 응용 방법을 초파리 배아 난각에 적용하게 되었으며, 몇 번의 시행착오 끝에 EPS 조성을 분석할 수 있었습니다. 원하는 계통의 교배 가능 연령 초파리 500마리 이상이 포함된 개체군 케이지를 준비하십시오. 케이지에는 10 centimeter 포도 주스를 배치해야 합니다. 효모 페이스트를 약간 발라 통기성을 확보하십시오.이 플레이트들을 하루에 두 번 교체하십시오. 며칠 후면 파리들이 배양 환경에 적응하여 더 규칙적으로 배아를 낳게 됩니다. EPS는 계면활성제와 제한 용매 용액으로 만들어지며 두 달 동안 사용할 수 있습니다.실온에서 보관한 경우, 새로운 EPS를 조제할 때 계면활성제를 37 °C로 가온하십시오. EPS 처리를 위해 배아는 3 cm 길이의 50 mL 폴리프로필렌 튜브와 나일론 메쉬로 만든 바스켓을 사용하여 취급합니다. 플라스틱 가장자리는 이후의 발달 단계 동안 메쉬에 더 쉽게 녹아 붙습니다. 또한 50 mL 튜브의 캡으로 만든 바스켓을 사용하여 배아를 취급하기도 합니다.캡에 구멍을 뚫고 홈을 내며, 캡과 튜브 사이의 나사산으로 메쉬를 고정합니다. 또는, 국소적으로 제작된 슬라이드 챔버를 사용하며, 리테이너 링으로 개구부 위에 산소 투과성 막 조각을 고정하여 배아를 수집할 수 있도록 준비합니다.아침에 배양액 위에 효모 페이스트가 도포된 신선한 포도판을 설치하십시오. 한 시간 후, 판을 교체하고 처음 수집된 판은 폐기하십시오. 두 번째 판에서 25 °C로 2시간 동안 배아를 수집하십시오.그런 다음 플레이트를 수거하여 18 °C로 옮깁니다. 배아가 원하는 단계까지 발달하도록 둡니다. 배아가 준비되면 EPS 처리 전에 탈피각(decoat) 시킵니다.붓을 사용하여 물로 플레이트에서 매쉬 바스켓으로 씻어냅니다. 둘째, 완만하게 흐르는 물에 헹구어 이물질을 제거합니다. 셋째, 50% bleach 용액에 2분 동안 담그고, 중간중간 용액을 주기적으로 순환시킵니다.그 다음 즉시 흐르는 물로 씻어냅니다. 이제 60 millimeter 디쉬 6개에 각각 10 milliliters의 PBS를 채워 세척조로 사용하고, MBIM에서 EPS 스톡을 1:40으로 희석한 후 혼합물을 소용돌이치듯 섞어줍니다. 흰색 유탁액이 형성되면 와이프로 메쉬 바스켓 바닥의 과도한 물기를 닦아내고, 지속적으로 소용돌이치는 동작과 함께 배아를 EPS 희석액에 담급니다.배아를 EPS에서 30초 동안 회전시킨 후, 배아를 꺼내어 과량의 용액을 닦아냅니다. 그런 다음 바스켓을 6개의 PBS 세척조 사이로 옮기며 부드럽게 분사하여 헹구고, 염색 및 약물 처리를 진행합니다. 투과성과 생존율을 최적화하는 것이 이 프로토콜에서 가장 까다로운 부분입니다.투과성은 배아의 발달 단계에 따라 민감하게 반응합니다. 배아를 노화시키는 온도는 초파리의 개별 계통 간에도 크게 다를 수 있습니다. EPS 희석 및 노출 시간에 대한 최적의 파라미터는 실험적으로 결정해야 합니다.먼저, M-B-I-M-T에서 50 µM 농도의 sci-fi carboxylic acid 염료 용액을 준비하며, 마이크로 튜브에 1 mL 정도면 충분합니다. 급성 처리를 위해 이 단계에서 독소나 약물을 추가할 수 있으며, 볼텍싱하여 혼합합니다. 붓을 사용하여 바스켓에서 투과성 배아를 마이크로 튜브로 옮깁니다.튜브 캡을 닫고 여러 번 뒤집어 섞습니다. 그런 다음 튜브를 뮤테이터(mutator)에 장착하고 15분 동안 배양합니다. 배아가 가라앉으면 피펫으로 염료를 제거하고, 세척을 위해 M-B-I-M-T 1 mL를 다시 첨가합니다. 재현탁합니다.배아를 현탁시킨 후 가라앉을 때까지 기다렸다가 M-B-I-M-T를 교체합니다. 이 과정을 세 번째와 네 번째까지 반복합니다. 네 번째 세척이 완료되면 M-B-I-M-T를 모두 제거하고 배아를 장기 배양용 발달 바스켓으로 옮깁니다.먼저 배양 바스켓을 70% ethanol과 그 다음 DI water로 헹구어 준비하고, 실험실용 와이프로 닦아 건조합니다. 완료되면, 바스켓을 원하는 약물이나 독소가 포함된 6mL의 배양 배지가 들어 있는 60mm 디쉬로 옮깁니다.붓을 사용하여 배아를 바스켓 내의 메쉬로 옮기되, 배아 위에 배양액을 부드럽게 떨어뜨려 배아들이 단층으로 퍼지게 합니다. 메쉬 아래에 공기 방울이 갇히지 않도록 주의하십시오. 슬라이드 챔버를 먼저 사용하려면, 먼저 챔버를 준비하고 슬라이드 챔버를 뒤집어 입구 가장자리를 따라 진공 그리스를 얇게 도포합니다.다음으로, 개구부 내의 도(do) 막 표면에 원하는 배지 150 µL를 로딩합니다. 이제 붓을 사용하여 배아를 배지로 옮긴 후 막 위에 분산시킵니다. 마지막으로 25 mm 원형 커버 슬립을 덮어 배지를 평평하게 펴줍니다.밀봉을 확실히 하기 위해 주변부에 가벼운 압력을 가합니다. 배아를 18 °C에서 배양하는 것은 EPS 투과 능력과 발달 후기 단계의 염료 흡수 능력에 강력한 영향을 미칩니다. 이는 25 °C에서 배양된 EPS 처리 배아에서 Rumine BD 흡수가 나타나지 않는 것으로 확인할 수 있으며, 여기서 빨간색으로 표시된 carboxylic acid 염료 흡수는 EPS 처리 배아에서 일반적으로 관찰되는 다양한 수준의 투과성을 보여줍니다.발달 과정 중 원적색 sci-fi 염료의 동적 분포와, 청색 자가형광으로 확인되는 발달된 장 내 난황으로의 응집은 생존력을 평가하는 기준으로 활용됩니다. sci-fi 염료는 또한 포르말린 고정 및 면역 염색 이후의 배아 투과성을 결정할 수 있습니다. EPS 배아를 sci-fi 염료와 메틸수은 독소로 처리한 후, 운동 신경세포를 표지하기 위해 녹색의 Antifa two로, 신경세포체를 표지하기 위해 적색의 anti E lab으로 염색합니다.Sci-fi 염료는 파란색으로 가상 색상 처리되었습니다. 메틸 수은은 대조군 처리 배아에서 화살표로 표시된 cortone 신경세포체의 패턴 형성에 영향을 미칩니다. 이 신경세포들은 더 질서 있는 다발 구조를 가지며, 여기에서 흰색으로 표시된 부분은 화살표 머리로 표시된 대조군 처리군의 분절 신경의 정상적인 분지 형태를 보여줍니다.이와 대조적으로, 메틸수은 처리는 실선 초록색 화살표로 표시된 바와 같이 분지 패턴을 변화시킵니다. 빈 초록색 화살표는 분지가 변위된 위치를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 배아 투과 처리를 적절하게 수행했을 때 약 30분에서 40분 정도에 완료할 수 있습니다.이 절차 이후에 배아의 고정과 면역 염색과 같은 다른 방법들을 수행하여, 발달 과정 중 특정 약물이나 독소가 어떤 조직을 표적으로 하는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 절차 영상을 시청해주셔서 감사드리며, 여러분의 실험실에서 이 방법들을 성공적으로 적용하시길 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 특정 genotypes의 Drosophila의 배아의 "등심"준비 창출을위한 능률적인 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 화면의 다양한 효율적인 실행을 허용합니다. 또한 후반 배아의 구조 우수 시각화 수 있습니다.

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

아주 늦은 단계 Drosophila의 배아의 배아 표피 빠른 찔린 상처의 응답 분석을위한 생체 시스템을 제공하고, 포유 동물 모델로 번역 상처 치료에 대한 연구를 진행하기 위하여 유전자 조작 물질 또는 화학 물질 미세 주입 치료와 결합 될 수있다.

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

혈액-뇌 장벽 무결성은 신경계 기능에 매우 중요합니다. Drosophila melanogaster에서는,혈액 두뇌 방벽은 늦은 배아 발생 도중 신경교 세포에 의해 형성됩니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 태아 및 제 3 instar 애벌레에 있는 혈액 두뇌 방벽 대형 및 유지보수를 위한 분석하는 방법을 기술합니다.

초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

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초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

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여기에서는 기존의 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 초고해상도 이미징을 달성하기 위해 초기 초파리 배아에서 확장 현미경을 구현하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초고해상도 이미징을 위해 확장 현미경을 사용하여 전체 마운트 초파리 배아를 물리적으로 확대

이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입

이 프로토콜들은 대조군과 돌연변이 초파리 배아 상피에서 주름 격격 접합부의 조직 및 폐쇄 기능을 어떻게 특성화할 수 있는지 개괄합니다.

초파리 배아 상피에서 코어 주름 부분 격지 접합 단백질을 규명하기 위한 면역염색 및 염료 침투 실험

배우세요 Drosophila 태아의 투과성 처리 방법으로 소분자 약물 및 독소의 생물학적 활성을 테스트합니다. 표백제와 용매를 이용해 난각층을 제거하고 형광 현미경으로 조직 발달에 미치는 영향을 분석합니다.

의 Permeabilization의 방법

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