의 Permeabilization의 방법 초파리 태아

다음 실험의 전반적인 목표는 투과성 난자 껍질을 가진 생존 가능한 초파리 배아를 준비하여 도입된 소분자 약물 또는 독소의 생체 활성을 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 발달 단계에 있는 배아를 희석된 표백제로 처리하여 외부 융모성 난각층을 제거함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 저분자 용질을 차단하는 얇은 밀랍 같은 달걀 껍질 층을 고갈시키는 용매로 배아를 침투시키는 것입니다.

세 번째 단계는 약물 또는 독소와 염료로 배아를 처리하여 난자 껍질의 투과성을 동시에 측정하고 관심 화합물을 도입하는 것입니다. 추가 발달 후, 배아는 직접 이미징하거나 면역조직화학을 위해 처리할 수 있습니다. 궁극적으로, 결과는 면역 시약 또는 중요한 유대를 사용한 형광 현미경 검사에 의해 결정된 조직 발달에 대한 약물 또는 독소의 활성을 보여줄 수 있습니다.

오늘 저는 소분자 활성의 분석을 위해 초파리 배아를 투과하는 방법을 발표할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 헵탄과 같은 기존 유기 용매를 사용하는 것과 같은 기존 방법에 비해 있습니다. 달걀 껍질은 우리의 배아 투과 용매 또는 EPS가 물을 놓칠 수 있고 상대적으로 독성이 없다는 것입니다.

이러한 특성은 배아 처리를 용이하게 하여 용매 노출을 보다 정밀하게 제어할 수 있고 생리학적으로 관련된 배지에서 수행할 수 있으며, 이 두 가지 모두 배아 생존력을 높입니다. 달걀 껍질의 밀랍 층을 제거하는 방법을 고민했을 때 이 방법에 대한 아이디어가 처음 떠올랐습니다. 스키어로서 저는 스키 바닥에서 잔류 왁스를 제거하기 위해 감귤류 용제를 일반적으로 사용하는 것에 대해 곰곰이 생각해 보았습니다.

이로 인해 이 응용 프로그램을 파리 배아 알 껍질로 번역하게 되었고, 몇 번의 시행착오 끝에 EPS 구성을 해결하여 원하는 균주의 최소 500마리의 짝짓기 연령 파리가 있는 개체군 케이지를 준비합니다. 케이지에는 10cm 포도 주스가 맞아야 합니다. 약간의 효모 페이스트로 공기가 통합니다.

이 플레이트는 하루에 두 번 교체하십시오. 며칠이 지나면 파리는 배양에 적응하고 더 규칙적으로 배아를 낳습니다. EPS는 계면활성제와 제한용제 용액으로 만들어지며 2개월 동안 유효합니다.

실온에서 보관하는 경우, 신선한 EPS를 혼합할 때 계면활성제를 섭씨 37도까지 따뜻하게 합니다.EPS 치료의 경우 배아는 3cm의 바구니로 처리하기 때문에 50ml의 폴리프로필렌 튜브와 나일론 메쉬를 거칠게 만듭니다. 플라스틱 가장자리는 이후 개발 단계에서 메쉬에 더 쉽게 녹습니다. 배아는 또한 50밀리리터 튜브의 뚜껑으로 만든 바구니로 처리됩니다.

캡은 드릴로 뚫고 노치를 파내며 캡과 튜브 사이의 나사산은 메쉬를 고정합니다. 또는 국부적으로 기계 슬라이드 챔버를 사용하고 산소 투과성 조각으로 준비합니다. 배아를 적출하기 위해 리테이너 링으로 개구부 위에 멤브레인을 고정합니다.

아침에 배양액에 효모 페이스트를 곁들인 신선한 포도 접시를 놓습니다. 한 시간 후 접시를 교체하고 처음 수집된 접시를 버리십시오. 두 번째 플레이트가 섭씨 25도에서 2시간 동안 배아를 수집하도록 합니다.

그런 다음 플레이트를 모아 섭씨 18도로 옮깁니다. 배아가 원하는 단계로 발달하도록 합니다. 배아가 준비되면 EPS 처리 전에 코팅

접시에서 물과 붓을 사용하여 매시 바구니에 헹굽니다. 둘째, 흐르는 물에 부드럽게 헹구어 이물질을 제거합니다. 셋째, 표백제 용액을 주기적으로 순환시켜 50% 표백제에 2분 동안 담그십시오.

그런 다음 즉시 흐르는 물로 헹굽니다. 이제 60mm 접시 6개에 각각 10ml의 PBS를 채워 욕조 역할을 하고 MBIM에서 EPS 스톡을 1-40 희석하여 혼합물을 소용돌이치게 합니다. 화이트 에멀젼은 메쉬 바구니 바닥의 여분의 물을 닦아내고 일정한 소용돌이 동작으로 배아를 EPS 희석액에 담그는 형태를 형성합니다.

EPS에서 배아를 30초 동안 소용돌이친 후 제거하고 여분의 용액을 닦아냅니다. 그런 다음 6개의 PBS 욕조 사이에서 바구니를 이동하고 부드럽게 분출하여 헹구고 염료와 약물 치료를 진행합니다. 투과성과 생존력을 최적화하는 것은 이 프로토콜에서 가장 까다로운 부분입니다.

투과성은 배아 발달 단계에 민감합니다. 배아가 노화되는 온도이며 파리의 개별 균주에 따라 크게 다를 수 있습니다. EPS 희석 및 노출 시간에 대한 최상의 매개변수는 경험적으로 도출되어야 합니다.

먼저, M-B-I-M-T에 공상 과학 카르복실산 염료의 50 마이크로 몰 용액을 준비하십시오 마이크로 피시 튜브에 1 밀리리터로 충분합니다. 이 단계에서 급성 치료 소용돌이가 혼합되도록 독소나 약물을 추가할 수 있습니다. 페인트 브러시를 사용하여 바구니에서 perme 배아를 마이크로 fuge 튜브로 옮깁니다.

튜브에 뚜껑을 씌우고 여러 번 뒤집습니다. 그런 다음 튜브를 돌연변이원에 넣고 15분 동안 배양시킵니다. 배아가 가라앉은 후 피펫으로 염료를 제거하고 M-B-I-M-T 1ml를 다시 첨가하여 세척합니다. 소생.

배아를 매달아 정착시키고 M-B-I-M-T를 교체하십시오. 그런 다음 세 번째와 네 번째로 이것을 수행하십시오. 네 번째 세척이 완료되면 모든 M-B-I-M-T를 제거하고 배아를 긴 발달 기간 동안 개발 바구니로 이동합니다.

개발 바구니의 경우 먼저 70% 에탄올을 헹구어 바구니를 준비한 다음 물을 추출하고 실험실 물티슈로 혈액을 건조시킵니다. 완료되면. 다음으로, 원하는 약물 또는 독소가 들어있는 60 밀리리터의 배양 배지가있는 60mm 접시로 바구니를 옮깁니다.

배양 매체를 부드럽게 떨어뜨려 페인트 브러시를 사용하여 배아를 바구니의 메쉬로 옮기고 배아를 단층으로 분산시킵니다. 메쉬 아래에 기포가 끼지 않도록 주의하십시오. 슬라이드 챔버를 사용하려면 먼저 챔버를 준비하고 슬라이드 챔버를 뒤집고 개구부 가장자리에 얇은 진공 그리스 비드를 놓습니다.

다음으로, 원하는 매체 150 마이크로 리터를 개구부 내의 do 멤브레인 표면에 로드합니다. 이제 페인트 브러시를 사용하여 배아를 배지로 옮기고 멤브레인 위에 분산시킵니다. 25mm 원형 커버 슬립을 적용하여 매체를 평평하게 하여 마무리합니다.

밀봉을 보장하기 위해 둘레에 가벼운 압력을 가하십시오. 섭씨 18도에서 배아를 사육하는 것은 EPS에 의해 투과되고 발달 후기 단계에서 염료를 흡수하는 능력에 강력한 효과가 있습니다. 이는 섭씨 25도에서 자란 EPS 처리 배아에서 Rumine BD 흡수가 없는 것으로 설명되며, 여기에서 빨간색으로 표시된 공상 과학 카르복실산 염료 흡수는 EPS 처리된 배아에서 일반적으로 볼 수 있는 다양한 수준의 투과성을 나타냅니다.

개발 과정에서 원적색 공상 과학 염료의 동적 분포와 파란색 자가형광으로 보이는 개발된 장 내 노른자에서의 통합은 생존 능력을 평가하는 데 사용되는 기준을 보여줍니다. 공상 과학 염료는 또한 포름알데히드 고정 및 면역 염색 후 이전 배아 투과성을 결정할 수 있습니다. EPS 배아를 공상 과학 염료와 메틸 수은 독소로 처리한 후, 운동 뉴런을 표시하기 위해 녹색으로 표시된 Antifa 2로 염색하고 뉴런 세포체를 표시하기 위해 빨간색으로 anti E lab을 염색합니다.

공상 과학 염료는 파란색으로 가짜색입니다. 메틸 수은은 대조군 치료 배아에서 화살표로 표시된 피톤 뉴런 세포체의 패턴화에 영향을 미칩니다. 이 뉴런은 더 질서 정연하고 근막을 가지고 있으며, 여기에 흰색으로 표시된 2 개는 화살촉으로 표시된 대조 치료에서 분절 뉴런의 정상적인 분기를 보여줍니다.

이에 비해 메틸 수은 처리는 녹색 실선 화살표로 표시된 분기 패턴을 변경합니다. 속이 빈 녹색 화살표는 분기가 이동된 위치를 표시합니다. 이 기술을 통한 배아 투과 치료는 제대로 수행되면 약 30분 또는 40분 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 배아의 고정 및 면역 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 발달 중 약물 또는 독소가 어떤 특정 조직을 표적으로 삼는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 절차를 지켜봐 주셔서 감사드리며 귀하의 실험실에서 이러한 방법을 사용하는 데 행운을 빕니다.