Name: 루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 배우세요 루시페라제 분석법을 이용한 포유류 후각 수용체 고처리량 활성 측정 방법입니다. H3A 세포에 수용체와 루시페라제를 도입하여 다양한 냄새 자극에 따른 발광 신호를 정량화함으로써 후각 수용체-리간드 상호작용을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 R01 DC013339, R03 DC011373, 루스 L. 키르 국가 연구 서비스 상 T32 DC000014에 의해 지원되었다. 작품의 일부는 NIH-NIDCD 코어 부여 P30의 DC011735 자금에 의해 부분적으로 지원되는 모넬 화학 감각 수용체 신호 코어를 사용하여 수행 하였다. 저자는 데이터 수집에 대한 도움 C. Sezille 감사합니다.

Hana3A 세포의 1. 문화 <ol><li> 10 % (v / v) FBS가 최소 필수 배지 (MEM)를 보완하여 M10 미디어를 준비합니다. </li><li> 문화 유지 <ol><li> M10 미디어의 세포를 유지한다. 참고 : RTP1L, RTP2, REEP1, 및 G의 발현 벡터는 Hana3A 세포에 퓨로 마이신 내성을 부여 αolf하지만,이 항생제와 세포를 유지하는 것이 상당히 분석 결과에 영향을주지 않습니다. </li><li> 1시 8분 10 CM 요리 2-3 일마다의 비율로 서브 컬쳐. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol></li></ol> 형질 2. 도금 세포 <ol><li> Hana3A 세포의 100 % 합류 10cm 접시에서 대기음 매체. </li><li> 10 ㎖의 PBS를 추가 접시를 소용돌이, 그리고 PBS를 흡입하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 ㎖를 추가하고 세포가 (약 1 분) 해리까지 기다립니다. </li><li> 5 ㎖ M10를 추가하여 트립신을 비활성화하고 약 10 배 &amp;를 triturating에 의해 세포 대단히 짧은 시간을 휴식# 160; 10 ㎖ 피펫. 피펫은 조심스럽게 미디어에 공기 방울을 도입 방지 할 수 있습니다. </li><li> 각 96 - 웰 플레이트, 15 ML 원뿔 관, 5 분 200 XG에 원심 분리기로 전송 세포의 1 ㎖를, 그리고 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음하십시오. </li><li> 단계 2.5에서 전송 세포의 1 ㎖ 당 6 ㎖의 M10의 세포를 Resuspend. </li><li> 피펫 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포의 50 μL와 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어. </li></ol> 후각 수용체의 3. 형질 <ol><li> 플라스미드 DNA의 준비 <ol><li> 독소가없는 프로토콜을 통해 플라스미드 DNA를 준비합니다. 참고 : 사용 플라스미드 DNA 준비 키트 지정 &quot;독소가없는&quot;또는 플라스미드 DNA 준비 프로토콜 페놀 - 클로로포름 추출 단계를 추가합니다. </li><li> TE 버퍼에 100 NG / μL의 농도로 DNA를 희석. </li></ol></li><li> 근사치의 적절한 자랄 수 있도록 도금 셀 (단계 2.7) 관찰tely 30 ~ 50도 당 % 및 인큐베이터로 돌아갑니다. 참고 :이 포화 상태가 지질 형질 전환 시약 최적은 아니지만,이 단계에서 30 % ~ 50 %의 포화 상태가 형질 전환 후 루시 페라 제 활동 24 시간을 측정하기에 최적입니다. </li><li> 형질 믹스의 제조 <ol><li> 플라스미드 혼합하기 위해 표 1에 설명 된 볼륨 당 MEM 매체에 피펫 RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE - 루크, 그리고 pSV40-RL 플라스미드 (표시된 볼륨은 96 - 웰 플레이트 일 기준). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> 플라스미드 믹스 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 물론 당 </td><td> 96 - 웰 플레이트 당 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 μL </td></tr><tr높이 = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 NG </td><td> 480 NG </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2.5 NG </td><td> 240 NG </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> PCRE 뤽 </td><td> 10 NG </td><td> 960 NG </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 NG </td><td> 480 NG </td></tr></tbody></table> 표 1. 플라스미드 믹스의 구성 요소. 당 잘 RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE - 루크, 그리고 pSV40-RL 및 MEM의 96 - 웰 플레이트 볼륨 당. </li><li> 각각의 96 - 웰 플레이트, 450 μL의 MEM 배지에서 18 μL의 지질 형질 감염 시약을 희석. </li><li> 피펫 플라스미드 믹스 (단계 3.3.1에서), PCI 플라스미드 (RHO-OR-PCI)에있는 로돕신 - 태그 후각 수용체와의 복잡한 상세한 수 있도록 (단계 3.3.2에서) 지질 형질 믹스 <strong&gt; 표 2. 저작하여 용액을 혼합하고 실온에서 15 분간 배양한다. 표 2에 따라 M10를 추가하여 반응을 중지 참고 :.이 반응 시간에 민감한하고 30 분 동안 계속 허용 할 수 없습니다. 잘 + 10 % 계산은 후속 단계에 충분한 양을 확보하는 것이 중요하다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> 복잡한 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 물론 당 </td><td> 잘 + 10 % 당 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 플라스미드 믹스 </td><td> 4.2 ㎕의 </td><td> 4.58 μL </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> RHO-OR-PCI </td><td> 0.05 NG </td><td> 0.06 NG </td></tr><tr높이 = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> 지질 형질 믹스 </td><td> 4.2 ㎕의 </td><td> 4.58 μL </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41.7 μL </td><td> 45.83 μL </td></tr></tbody></table> 표 2. 복잡한 구성 요소. 당 잘 플라스미드 믹스 (표 1)도 + 10 % 볼륨 당, 후각 수용체 플라스미드 (RHO-OR-PCI) 및 지질 형질 혼합. M10을 실온에서 15 분간 인큐베이션 다음 가하여 반응을 급냉된다. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> 셀 플레이트에서 미디어를 누르십시오. </li><li> 피펫 50 개 각 단지의 μL와 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어. </li></ol> 4. 냄새 자극 <ol><li> 물론 당 50~80%의 적절한 자랄을 보장하고 인큐베이터로 돌아 형질 전환 세포를 관찰합니다. 참고 : 세포는 50 미만 경우% 합류, 반딧불 루시 페라 제와 레 닐라 루시퍼 라 아제 수치는 수용체 활성화의 측정에 너무 낮을 수 있습니다. 플레이트를 폐기하는 것이 좋습니다. </li><li> DMSO의 각 냄새의 1 M 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> CD293 매체의 냄새 자극 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 심사 실험을 위해, 100 μM로 냄새의 원액을 희석. 또한 (만 CD293) 또는 배경의 활성화를 위해 제어하기 위해 노 악취 제어를 준비합니다. 주 : 검사 실험의 경우, 각 OR / 냄새 쌍은 실험에 한 번 테스트됩니다. 우물에서 약간의 냄새 확산이 가능하기 때문에, 각 플레이트에 대해 하나의 악취 물질과 자극하는 것이 좋습니다. </li><li> 용량 반응 실험을 위해, 세중의 각 수용체에 1 ㎜부터 시작하여 냄새 원액의 7-10 배 희석으로 준비하고 있습니다. 또한 냄새 배경 활성화를 위해 제어하기 위해 빈 벡터 형질 세포에 대한 세중 같은 악취 희석을 준비합니다. NOTE : 용량 반응 실험을 위해, 각각의 ODOR 농도 처리 중으로 실시해야한다. </li></ol></li><li> 셀 플레이트에서 미디어를 누르십시오. </li><li> 피펫 (25)도 각각 냄새 자극 솔루션의 μL하고 4 시간 동안 배양한다. </li></ol> 루시 페라 제 분석을 통해 5. 측정 또는 활동 <ol><li> -80 ° C에서 제조업체의 지침과 상점 당을 Resuspend 반딧불 루시 페라 제 기판 </li><li> 96 - 웰 플레이트 당 반딧불 루시퍼 기판의 1 ml에 녹여. </li><li> 끄는 신선한 반딧불 루시 페라 제 반응을 준비하고 레 닐라 루시퍼 기판 시약 (버퍼 1 ㎖ 당 5 μL 루시퍼가 끄는 / 레 닐라 루시퍼 기판). 참고 : 시약의 약 1 ㎖를 96 - 웰 플레이트 당 필요합니다. </li><li> 발광 마이크로 플레이트 리더를 준비합니다. 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다. 시스템 아이콘 내 : <ol><li> &quot;예열&quot;탭에서 &quot;ON&quot;에 대한 확인란을 선택하고 25 °에 기계의 온도를 설정; C. </li><li> &quot;분배기&quot;탭에서, 70 % 에탄올 1,000 μL 프라임 각각의 디스펜서 증류수 1,000 μL 하였다. 참고 : 각 디스펜서 알코올과 물을 분리 분취를 사용합니다. 에탄올은 디스펜서를 살균하는 데 사용하고, 물을 잔류 에탄올을 제거한다. </li><li> 프라임 공기의 1,500 μL 각 디스펜서 (액체에서 디스펜서를 제거). 참고 : 공기로 프라이밍은 루시 페라 제 기판을 잔류 물에 희석되지 않도록합니다. </li><li> (단계 5.2) 반딧불 루시 페라 제 기판의 1,080 μL 프라임 디스펜서 1. (단계 5.3에서) 레 닐라 루시퍼 기판 프라임 디스펜서 2. 참고 : 교차 오염 루시 페라 제의 기판에주의하십시오. 루시 페라 제 기판과 프라이밍 시약 디스펜서의 죽은 공간을 채 웁니다. </li></ol></li><li> 모두 개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 발광을 읽을 수있는 다음과 같은 프로토콜을 설정합니다. 마이크로 플레이트 리더, UN과 관련된 소프트웨어 내&quot;파일&quot;메뉴를 데르, &quot;새 작업&quot;을 클릭합니다. &quot;프로토콜&quot;을 선택하고 &quot;새로 만들기&quot;를 클릭합니다. 다음 창에서, 다음 &quot;표준 프로토콜&quot;에 원을 선택해야합니다. &quot;OK&quot;를 클릭하십시오. 화면의 왼쪽에 &quot;절차&quot;를 두 번 클릭합니다. <ol><li> 디스펜서를 사용하여 모든 우물에 반딧불 루시 페라 제 기판의 10 μl를 분배합니다. &quot;작업&quot;메뉴에서 &quot;분배&quot;를 클릭합니다. &quot;분배 단계&quot;창에서 설정 : 없음, 10 μL에 &quot;분배 량&quot;225 μL / 초 &quot;속도&quot;에 &quot;마중물&quot; &quot;분배기&quot;1. &quot;OK&quot;를 클릭합니다. </li><li> 30 초 동안 판을 흔들어. &quot;작업&quot;메뉴에서 &quot;떨림&quot;을 클릭합니다. SS : &quot;흔들어 단계&quot;창에서, 중간 및 0시 반 MM에 &quot;시간&quot;을 &quot;강도&quot;로 설정합니다. &quot;OK&quot;를 클릭합니다. </li><li> 물론 당 0.5 초에 대한 모든 우물의 발광을 읽어보십시오. &quot;작업&quot;메뉴에서 &quot;보기&quot;를 클릭합니다;. &quot;읽기 단계&quot;창에서 설정 : 발광에 &quot;검출 방법&quot;, 0시 0분 50초 MM에, 엔드 포인트에 &quot;통합 시간&quot;을 &quot;유형을 읽기&quot;: SS : 초, &quot;필터 세트&quot;1, &quot;방출&quot; 홀에, Top 호텔 &quot;광학의 위치&quot;, 135 &quot;이득&quot;및 1.00 mm로 &quot;높이 읽기&quot;. &quot;OK&quot;를 클릭합니다. </li><li> 디스펜서 2를 사용하는 모든 우물에 레 닐라 루시퍼 기판의 10 μl를 분배합니다. 세트 &quot;분배기&quot;2를 제외하고, 단계 5.6.1에서와 같이 조건을 설정합니다. </li><li> 30 초 동안 판을 흔들어. 5.6.2 단계에있는 등의 조건을 설정합니다. </li><li> 0.5 초에 대한 모든 우물의 발광을 읽고 잘 당. 5.6.3 단계에있는 등의 조건을 설정합니다. </li></ol></li><li> 96 - 웰 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 마이크로 플레이트 리더에 접시를 놓습니다. 플레이트 발광을 읽는 단계 5.5에서 설정 프로그램을 시작합니다. </li><li> 시약 디스펜서 펌프를 청소합니다. &quot;분배기&quot;탭에서 시스템 아이콘에서 : <ol><li> F 1000 μl를 제거복구 튜브에 반딧불 루시 페라 디스펜서에서 irefly 루시 페라 제의 기판. 참고 : 반딧불 루시 페라 제는 -80 ° C에서 저장 및 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 프라임은 70 % 에탄올 1,000 μL에 증류수 1,000 μL,, 그리고 마지막으로 공기의 1,500 μL 각 디스펜서 (액체에서 디스펜서를 제거). 참고 : 물이 시약 펌프, 에탄올 소독, 공기가 잔류 에탄올 건조에서 루시 페라 제의 기판을 제거합니다. </li></ol></li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> 데이터 내보내기 <ol><li> 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어, 화면의 왼쪽에있는 &quot;보고서 / 내보내기 건축&quot;을 두 번 클릭합니다. </li><li> 버튼 &quot;Excel로 새로운 수출&quot;을 클릭하고 &quot;확인&quot;을 클릭합니다. </li><li> EXPORT1을 선택하고 &quot;편집&quot;을 클릭합니다. <ol><li> &quot;콘텐츠&quot;의 &quot;시스템 설명&quot;확인 &quot;절차&quot;, &quot;플레이트 설명&quot;및 &quot;플레이트 레이아웃 매트릭스&quot;에서. &quot;원시 데이터&quot;를 포함ND &quot;데이터를 계산&quot;. </li><li> &quot;워크 플로&quot;에서 &quot;절차의 완료시 자동 실행&quot;을 확인합니다. 수출 모드에서, &quot;모두 같은 통합 문서에있는 판&quot;과 &quot;새 워크 시트로&quot;를 확인합니다. </li><li> &quot;파일&quot;파일 이름 형식 및 파일 위치를 선택하고 &quot;확인&quot;을 클릭에서. </li><li> &quot;보고서 / 내보내기 빌더&quot;창을 닫습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 정규화 루시 페라 제 값을 얻으려면, 각 웰의 레 닐라 발광 읽기 (단계 5.6.6)에 의해 각 웰의 반딧불 루시 페라 제 발광 읽기 (단계 5.6.3)를 나눕니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

악취 물질 ID는 후각 수용체 활성화 패턴에 의해 인코딩되어 있지만 수용체가 활성화되고 어느 정도에하는 등의 수용체 활성화 패턴은, 인간의 후각 수용체 1-11 미만 6 % 알려져있다. 후각 수용체를 특성화하기위한 노력이 후각 수용체 가족 17,23,24,33,34의 서브 세트 만에 자신의 노동 집약적 인 방법이나 적용에 의해 제한되었다. Hana3A 이종 발현 시스템은 시험 후각 수용체의 대부분의 강력한 발현을 지원하고 후각 수용체 활성화 19,26,27을 모니터링하는 cAMP에 응답하여 루시퍼 라제 리포터 시스템과 함께 사용될 수있다. 96 - 웰 포맷이 분석의 성능은 상호 작용을 확인하기 위하여 취제 / 후각 수용체 쌍 및 투여 량 - 반응 곡선에 대한 가능성 후보를 결정하고, 수용체 활성화 수준 AF 얼마나 평가하는 스크린을 포함하여 높은 처리량 실험 디자인의 수를 지원인트라 및 인터 - 특정 변형에 의해 인해 영향받은. 화면에 높은 활성 값으로 악취 물질 / ...

포유 동물의 후각 시스템은 탐지 및 취기 수천 차별을 허용 악취 자극의 광대 한 수에 응답 할 수있는 능력을 갖는다. 후각 (논리합)는 후각 상피 (12)에서 후각 감각 뉴런에 의해 표현 분자 센서이다. 포유 동물의 냄새를 인식 취기에 의한 관찰 보고서의 차등 활성화를 통해 발생하고 또는 유전자 가족은 대략 1,000 쥐 400 인간의 수용체 12-16으로 광범위하다. 후각 신경 세포 및 이종 세포에서 관찰 보고서의 이전 기능 분석은 다른 냄새 물질은 고유 한 인식하는 것으로 나타났습니다하지만, 관찰 보고서 10,17-20의 앙상블을 겹쳐있다. 관찰 보고서에 리간드를 매칭 후각 코드와 후각의 실행 가능한 모델을 구축하기위한 핵심을 이해하는 것이 중요합니다. 인해 취기 및 논리합 모두의 다수뿐만 아니라 이종 시스템에서 논리합을 표현하는 어려움이 데이터는 F에서 큰폭 결석왔다ield; 참으로, 인간의 관찰 보고서 미만 6 % 게시 된 리간드 1-11있다. 이 프로토콜은 취제 / OR 상호 작용을 특성화하는 루시페라아제 분석의 사용을 설명한다. 이 분석은 논리합의 높은 처리량 특성화 취제 / OR 상호 작용을 이해뿐만 아니라 악취 코딩 모델을 개발에 필수적인 작업을 가능하게한다. 관찰 보고서의 높은 처리량 연구는 세 가지 주요 과제에 직면하고 있습니다. 첫째, 이종 세포에서 발현 관찰 보고서는 ER에 유지하고, 이후 분석 시스템 23-25에서 냄새 물질과 상호 작용에서 관찰 보고서 방지, 프로 테아 솜 (21, 22)에서 분해. 이 문제는 논리합 19,26,27 광범위한 안정된 세포 표면 발현을 촉진 소품 단백질의 발견에 의해 해결되었다. 수용체 - 수송 - 단백질 1과 2 (RTP1 2) 쇼핑 후각 자극 (19)에 대한 응답으로 세포 표면 발현 및 활성화. 본 작업에 기초하여, HEK293T 세포되었습니다안정적으로 Hana3A 세포주 19,27 결과 RTP1 긴 (RTP1L) 및 RTP2, 수용체 발현을 향상시키는 단백질 1, 및 G의 αolf을 표현하기 위해 수정. 또, 분류 3 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체 (M3-R)는 세포 표면에서 관찰 보고서와 상호 작용 및 취기 제 (26)에 응답하여 활성화를 향상시킨다. 세포 표면 27에서 관찰 보고서의 넓은 범위의 강력한 일관성 및 기능 식 Hana3A 세포 결과에 RTP1S와 M3-R와 OR의 공동 형질. 둘째, 포유 동물 또는 레퍼토리는 매우 크다. 인간에서는, 예를 들면, OR 레퍼토리는 미각 수용체 레퍼토리보다 다양한 크기의 순서이며, 시각 수용체 레퍼토리보다 다양한 크기의이 순서. 하나의 복제 또는 것은 비교적 간단한 프로토콜이지만, 중요한 선행 노력이 포괄적 인 라이브러리를 생성하기 위해 필요합니다. 우리는 비전을 알고 있지만, 셋째, 파장은 색상으로 변환하고오디션 주파수 피치로 변환에, 냄새의 조직은 가난 어려운 연구자의 냄새 물질의 대표 샘플에서 보간하기 위해 만드는 이해된다. 일부 진전이 전면 10,28에 만들어진 있지만, 후각 풍경의지도가 불완전 남아있다. 관찰 보고서의 수백에 수십 분자의 수천을 상영하는 것은 어려운 작업입니다; 이 도메인의 높은 처리량 화면을주의 깊게 정의 캠페인을 필요로한다. 주요 남은 문제는 오히려 기술에 내재 된 문제보다 물류 비용의 사람입니다. 이종 스크리닝 폭넓게 학술기로 리간드를 식별하는 데 사용되지 않았지만, 개인 회사 100 인간 논리합 29 대한 리간드를 식별하는 동일한 기술을 사용하고있다. 불행하게도, 이러한 데이터 독점 남아있다. 여기에 설명 높은 처리량 루시 페라 제 분석은 평가 또는 활성화하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 비록 respon기본 후각 감각 뉴런의 SES는 전기 생리학과 칼슘 이미징을 사용하여 측정 된이 기술은 어려움으로 인해 후각 신경 세포에 대한 응답 특성의 중첩에 신경 세포의 반응에 이르게 또는 떨어져 괴롭 히고있다. , GFP - 라벨 수용체 타입 (30, 31)에서 노킹 (32, 33) 후각 신경 세포를 생쥐에 아데노 바이러스를 통해 특정 수용체를 제공, 또는 17,24,33 단일 수용체의 종류에 녹음을 링크 할 수 있습니다 녹음 한 후 RT-PCR을 수행,이 방법은 있지만 낮은 처리량과 대형 화면에 적합하지 않습니다. 이종 검사 시스템은 확장 성, 그리고 두 가지 주요 형태는 문헌에서 찾을 수 있습니다 : 캠프 통로 기자 이노시톨 인산염 (IP3) 통로 기자. 냄새 자극에, 관찰 보고서는 고리 AMP (캠프) 12의 생산 결과 G의 αolf 전달 신호 폭포를 활성화합니다. AC의 제어 하에서 반딧불 루시퍼 라제 리포터 유전자를 공동 형질 작성자AMP 반응 요소 (CRE), 루시퍼 라제 생산 부량 OR 활성화를 허용 악취 응답의 함수로서 측정 될 수있다. 또는 활성화 또한 G α15/16 또는 G의 α15-OLF 키메라 24,25,34 등의 G-단백질을 공동으로 표현하여 IP3 경로에 연결할 수 있습니다. 우리는 세 가지 요인에 따라 여기에 제시된 분석을 선택했습니다 : RHO-태그 후각 수용체와 RTP1 (1) 공동 발현 세포 표면 19,27의 후각 수용체의 발현을 향상을; (2) 캠프 응답 리포터 유전자의 사용은 측정 또는 정규 두 번째 메신저 경로를 통해 활성화 할 수 있습니다; (3) 분석은 높은 처리량 스크린에 매우 적합하다. 이것은 높은 처리량 루시퍼 라제 분석은 후각의 분야에 유용한 다양한 연구에 적용 할 수있다. 우선, 관찰 보고서의 다수의 SP에 대한 수용체 활성화 패턴을 결정하기 위해 단일 ​​취제에 대해 스크리닝 할 수있다ecific 악취 물질. 이런 종류의 연구는 스테로이드 악취 물질 androstenone 8에 응답 또는 책임으로 OR7D4을 확인했다. 반대로, 하나의 OR은 수용체 응답 프로파일 (10)을 결정하기 위해 방향제의 패널에 대해 스크리닝 할 수있다. 후보 후각의 취제 / OR 쌍이 이러한 화면을 통해 확인 될 때​​, 상호 작용의 증가 취제 농도 OR의 응답을 검사하는 투여 량 반응 실험을 수행함으로써 확인 될 수있다. 용량 반응 곡선은 OR에있는 유전 변이가 체외 후각 응답 8,9,11,35에 미치는 영향을 평가할 수 있으며, 이러한 연구는 진화의 종류 및 원인 돌연변이를 통해 수용체 진화의 시험을 허용, 종간 또는 변화에 확장 될 수있다 36, 37는, 마지막으로,이 분석은 길항 할 수 또는 알려진 후각 / 수용체 쌍 (38, 39)에 대한 특정 악취 물질에 대한 응답이다 냄새 길항제에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 요약하면, 이러한 높은처리량 루시페라아제 분석법 특성화 OR 활성화 패턴 및 후각 시스템에서 악취 코딩의 더 나은 이해를 제공 할 것이다 연구의 범위에 적용 가능하다.

<table><tbody><tr><td>Hana3A 세포</td>는 <td>요청</td><td></td><td></td>시 Matsunami 실험실에서 사용 가능</tr><tr><td>RTP1S-pCI</td><td>요청</td><td></td><td></td>시 Matsunami 실험실에서 사용 가능</tr><tr><td>M3-R-pCI</td><td>요청</td><td></td><td></td>시 Matsunami 실험실에서 사용 가능</tr><tr><td>pCRE-luc</td><td>애질런트</td><td>219076</td><td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td></tr><tr><td>pSV40-RL</td><td>Promega</td><td>E2231</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td></tr><tr><td>Minimum 필수 매체, Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4655</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp; region=US">MEM</a></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044? ICID=search-16000044">FBS</a></td></tr><tr><td>PBS (Ca2+ 및 Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><<td>a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td></tr><tr><td>Trypsin (0.05% Trypsin EDTA</td> 제외<td>)Life Technologies</td><td>25300</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054? ICID=search-product">트립신</a></td></tr><tr><td>CD293</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>11913-019</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019? ICID=search-11913019">CD293</a></td></tr><tr><td>96-well PDL white/clear plate</td><td>BD BioCoat</td><td>356693</td><td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td></tr><tr><td>Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019? ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td></tr><tr><td>반딧불이 루시페라제 기질, 반딧불이 루시페라제 담금질제/Renilla 루시페라제 기질: Dual-Glo Assay</td><td>Promega</td><td>E2980</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&__utmx=-&__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">듀얼 글로</a></td></tr><tr><td>시너지 S2&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>SLAD</td><<td>a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더 소프트웨어: Gen5 데이터 분석 소프트웨어</td><td>BioTek</td><td>Gen5</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td></tr><tr><td>BIOSTACK</td><td>BioTek</td><td>BIOSTACK2WR</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td></tr><tr><td>Multiflo</td><td>BioTek</td><td>MFP</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a</td></tr><tr><td>>12.5 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4414</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips ViaFlo96</td><td>Integra</td><td>6433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ 팁</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips 384 XYZ</td><td>Integra</td><td>6403</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ 팁</a></td></tr><tr><td>384ViaFlo</td><td>Integra</td><td>6030</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>Macherey Nagel</td><td>740797.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마 알드리치</td><td>D2650-100ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp; region=US">DMSO</a></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN100-0010</td><td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td></tr></tbody></table>

루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

취기 약 1,000 쥐 400 인간의 수용체의 가족이 냄새 물질의 수천을 인식 할 수 있도록, 후각 수용체 활성화의 독특하고 중복 패턴을 만들 수 있습니다. 악취 물질 리간드는 인간의 수용체 1-11 미만 6 %에 발표되었다. 데이터의 부족은 일부 기능 이종 시스템에서이 수용체를 발현하는 어려움 때문이다. 여기서, 우리는 루시퍼 라제 리포터 분석을 이용하여 후각 수용체 활성화의 높은 처리량 평가 하였다 Hana3A 세포 후각 수용체 패밀리의 대부분을 표현하기위한 방법을 설명한다. 이 분석은 후각 수용체의 패널에 대하여 취기 (1)의 화면 패널에 사용될 수있다; (2) 용량 반응 곡선을 통해 취제 / 수용체 상호 작용을 확인; (3) 수용체 변이체 구비 수용체 활성화 수준을 비교한다. 우리의 샘플 데이터에서 328 후각 수용체 (26)의 냄새 물질에 상영되었다. 다양한 응답 점수 후각 / 수용체 쌍 SELEC했다테드 및 용량 반응 시험. 이 데이터는 화면이, 악취 물질에 대한 선의의 진실 반응이, 즉 수용체를 용량 반응 실험을 통과 할 후각 / 수용체 쌍에 대해 풍부하게 할 수있는 효과적인 방법임을 나타냅니다. 따라서, 이러한 높은 처리량 루시페라아제 분석법은 포유 동물의 후각 시스템 악취 코딩 모델 향해 후각 수용체-필수적인 단계를 특성화하는 효과적인 방법이다.

기본 화면이 100 μM의 농도에서 26 냄새에 328 관찰 보고서를 테스트했다. 이 냄새의 농도를 효과적으로 알려진 리간드 (10)와 관찰 보고서의 큰 비율을 활성화하기 위해 입증되었습니다. 먼저 정규화 루시퍼 라제 활성은 레 닐라 루시퍼 라제 판독함으로써 반딧불 루시페라아제 판독 나누어 계산 하였다. 다음으로,베이스 라인 값은 각 웰 (그림 1)에 대한 표준화 된 루시 페라 제 수치의 냄새 컨트롤의 정규화 루시 페라 제 수치를 차감하여 계산 하였다. 용량 반응 곡선은 48 악취 물질에 대해 수행 / 또는 쌍을 무작위로베이스 라인 값의 범위에 걸쳐 분포하고, 그림 1의 색 막대로 표시된. 관찰 보고서가 1 ㎜에 1 nm의에 걸쳐 악취 물질의 7 농도로 처리하고, 결과 응답이 맞는지했다 비선형 회귀를 이용하여 S 자형 곡선. 이 세 가지 기준을 충족하는 경우 악취 물질 / OR은 작용제 간주되었다 : (1) 표준 오차의logEC <...

후각 수용체 활성화 패턴 악취 ID를 인코딩하지만, 포유 동물의 후각 수용체 리간드 취제를 식별 발행 데이터의 부족은 악취 코딩의 광범위한 정보 모델의 개발을 방해한다. 이 프로토콜은 후각 수용체 리간드 및 수용체 활성화의 정량 높은 처리량의 식별을 용이하게하는 방법을 설명한다.

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

다음 실험의 전반적인 목표는 루시퍼라제 분석을 통해 후각 수용체 활성화에 대한 고처리량 측정을 수행하는 것입니다. 이는 다른 후각 수용체를 발현하기 위해 H 3 A 세포를 보조 단백질, 반딧불이 및 바닐라 루시페라아제, 후각 수용체를 포함하는 벡터로 transection함으로써 달성됩니다. 96웰 플레이트의 각 웰에서.두 번째 단계로, 세포는 냄새로 자극됩니다. 다음으로 루시페라제 기질을 첨가하여 루시페라제 효소를 생성한 세포가 발광하도록 하여 후각 수용체 활성화를 위한 리포터 역할을 합니다. 궁극적으로, 결과는 플레이트에 있는 각 웰의 발광을 기반으로 냄새에 대한 후각 수용체 집단의 반응을 보여줍니다.아데노바이러스, 네이티브 뉴런 형질도입 또는 칼슘 이미징과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 고처리량 스크리닝으로 확장되고 네이티브 CM 매개 2차 메신저 경로를 활용하여 후각 수용체 활성화를 검사한다는 것입니다. 이 방법은 냄새 리간드, 즉 후각 수용체를 일치시키고 후각 수용체 활성화에 대한 유전적 변이의 영향을 조사하는 것과 같은 후각 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 Hanna three A cell은 섭씨 37도의 M 10 배지에서 5%CO2로 유지되며, 10cm 세포 세척 접시에서 transfection 흡인 배지를 위한 세포를 플레이트링하기 위해 100% confluent여야 합니다.10ml의 PBS를 첨가하고 접시를 휘젓고 PBS를 흡인하여 0.05% tripsin EDTA를 3mL 첨가하고 세포가 실온에서 해리될 때까지 약 1분 동안 기다립니다. 5ml의 M 10 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화하면 10ml 피펫으로 약 10회 트라이 등급으로 세포 덩어리가 분해됩니다. 기포가 매체에 유입되지 않도록 조심스럽게 피펫을 삐걱거립니다.각 96웰 플레이트에 대해 1밀리리터의 세포를 15밀리리터 원추형 튜브로 이동합니다. 중력의 200배에서 5분 동안 원심분리기를 하고 세포 펠릿 해상도를 방해하지 않고 상층액을 흡인합니다. 12ml의 M, 10 피펫, 50 마이크로리터의 세포를 96개의 웰 플레이트의 각 웰에 현탁시키고 섭씨 37도에서 5%CO2로 하룻밤 동안 배양합니다.이 절차를 시작하기 전에 전날에 도말한 세포를 관찰하여 웰당 약 30-50%의 적절한 co-fluency를 확인하십시오. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 계속 진행하십시오

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기, 우리는 Promega에서 듀얼 GloTM 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

우리가 편리하게 HEK293T 세포의 표면에 odorant 수용체를 감지하는 데 사용할 수있는 라이브 세포 얼룩을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한, 그것은 또한 다른 chemosensory 수용체 또는 GPCRs의 표면 표현 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

Heterologous 셀에 Chemosensory 수용체의 표면 표현을 시금

이 동영상은 루시페라아제 태그가 지정된 단백질을 정량화하는 데 사용되는 루시페라아제 분석을 보여줍니다. 이 분석은 관심 단백질과 접합된 작은 단편과 결합하는 큰 단편으로 구성된 엔지니어링된 루시페라아제 효소를 사용합니다. 결합된 소단위체는 기질이 있을 때 발광 신호를 방출하는 활성 효소를 형성합니다. 그런 다음 이 신호는 광도계를 사용하여 정량화됩니다.

Luciferase Assay: 엔지니어링된 Nanoluciferase 시스템 기반 바이오리포터를 사용하여 발광 신호를 측정하는 고처리량 분석

이 동영상은 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 바이오센서 및 발광 검출을 사용하여 형질 주입된 세포에서 냄새 수용체 활성화를 측정하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 후각 뉴런의 수용체-리간드 상호 작용 및 신호 경로를 연구하는 데 적용됩니다.

Real-Time Cyclic Adenosine Monophosphate Assay를 사용한 Odorant Receptor Activation 측정

출처: de March, C. A. et. al., 증기 단계에서 냄새 물질에 의한 냄새 수용체 활성화의 실시간 체외 모니터링. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 발광 측정을 사용하여 재조합 포유류 세포에서 냄새 수용체의 실시간 활성화를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 냄새 물질 결합은 G-단백질 활성화 및 cAMP 생산을 유발하여 기질 결합 시 발광을 방출하는 글로센서 단백질을 활성화하여 수용체 반응의 정량적 측정을 제공합니다.

재조합 세포에서 Odorant Receptor 활성화에 대한 실시간 모니터링

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Odorant 수용 체의 기능을 특성화 deorphanization 과정에서 필수적인 부분을 제공 합니다. 우리 캠프 분석 결과 사용 하 여 실시간으로에서 odorant 수용 체의 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

순수, odorant 수용 체 odorant 분자 수증기 단계에서 흡입에 의해 활성화 됩니다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 시스템 활용 액체 단계 odorant 자극. 여기, 선물이 odorant 자극 기상에 따라 odorant 수용 체 활성화의 실시간 생체 외에서 모니터링 수 방법.

실시간 체 외 Odorant 수용 체 활성화는 Odorant 수증기 단계에서의 모니터링

배우세요 루시페라제 분석법을 이용한 포유류 후각 수용체 고처리량 활성 측정 방법입니다. H3A 세포에 수용체와 루시페라제를 도입하여 다양한 냄새 자극에 따른 발광 신호를 정량화함으로써 후각 수용체-리간드 상호작용을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석

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