예 생체 내 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

이 절차의 전반적인 목표는 생체 외 배양, 마우스, 배아 갑상선 임플란트 또는 엽을 해부하여 갑상선 발달 중에 발생하는 형태 유전 및 분화 사건을 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 이것은 먼저 배아의 날의 몸의 위턱과 아랫부분을 제거함으로써 이루어진다. E 12.5 내지 E 14.5 마우스 배아를 사용하여 배아의 목 부위를 분리한다.

두 번째 단계에서는 신경관, 측면 조직 및 혀를 제거하여 기관과 식도의 상부를 노출시킵니다. 다음으로, 갑상선 싹, 부위 또는 엽에서 원치 않는 조직을 추가로 청소합니다. 마지막 단계에서는 갑상선 임플란트를 코팅된 마이크로웰 또는 필터에서 배양하기 위해 도금합니다.

궁극적으로, 타임 랩스 이미징, 면역 염색 또는 유전자 발현 분석을 수행하여 상피 형태 형성 3차원 조직 및 여포, 임플란트의 혈관화 또는 갑상선 전구 세포 분화를 연구할 수 있습니다. 이 방법은 주요 개발 및 차별화에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 3D에서의 갑상선 상피 세포 조직, 루멘 형성, 세포 분화, 분극 및 성장에 관한 질문.

이 절차를 시연하는 사람은 대학원생인 Fidel Marcel과 박사후 연구원인 Myla LaCorte입니다. 둘 다 제 연구실의 Under sterile condition in the laminar flow hood(층류 후드의 멸균 상태)입니다. 갑상선 조직을 분리하기 2시간 전에 멸균 1형 콜라겐을 밀리리터당 50마이크로그램으로 희석합니다. 10 밀리몰의 염화수소에 최종 농도를 넣고 콜라겐을 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 플라스틱 배양 챔버의 각 웰을 200마이크로리터의 희석된 콜라겐으로 덮고 챔버를 실온에서 배양합니다.2시간 후 콜라겐을 흡인합니다. 웰을 M1 99 매체로 헹구고 각각에 최소 200마이크로리터의 배양 배지를 추가합니다. 코팅된 챔버를 인큐베이터에 잘 놓고 갑상선 박리를 진행합니다.

먼저 절개된 자궁을 HBSS가 들어 있는 10cm 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 자궁의 한쪽 끝을 잡은 다음 작은 가위로 자궁을 열어 각 배아를 연속적으로 방출합니다. 가위를 사용하여 태반에서 배아를 분리한 다음 여분의 배아 막 내에 있는 배아를 새로운 HBSS가 들어 있는 새로운 10cm 플레이트로 옮깁니다.

다음으로, 각 배아에 대해 실체 현미경으로 해부를 계속합니다. 먼저 노른자 자루와 양막을 제거합니다. 그런 다음 유리 모세관에 텅스텐 바늘을 나이프와 포크로 잡습니다.

위턱과 귀를 포함한 머리 윗부분을 제거합니다. 배아를 등에 업고 잡습니다. 그런 다음 신경관의 여분의 조각을 제거하고 배아의 아래쪽 부분, 앞쪽 팔다리 바로 아래와 심장 위를 제거합니다.

조직의 방향을 정하기 위해 혀와 목 부위를 포함하는 배아 절편을 새로운 HBSS가 들어 있는 새로운 10cm 플레이트로 옮기고 식도와 기관 뒤쪽에 있는 신경관과 조직을 제거합니다. 이제 혀의 양쪽을 따라 조직 조각을 부드럽게 잘라냅니다. 그런 다음 식도와 기관을 찾아 혀를 절개하여 식도와 기관 양쪽의 망막부 부종과 조직을 남겨둡니다.

혀를 제거한 후 식도를 절개하고 기관 복부 쪽을 위로 향하게 놓습니다. 그런 다음 흉선과 같은 원치 않는 조직과 인두궁동맥 측면에 위치한 모든 조직을 해부합니다. 그런 다음 E 13.5 또는 E 14.5 배아의 경우 기관 양쪽의 갑상선 엽을 시각화하고 기관에서 엽을 더 해부합니다.

E 12.5 배아의 경우, 혀와 식도를 절제할 때까지 방금 시연한 대로 해부를 수행할 수 있습니다. 그런 다음 인두궁동맥을 찾은 후 E 13.5 - 14.5 배아의 경우 모든 측면 조직을 제거합니다. 마지막으로, P 200 마이크로 피펫의 사전 습식 필터 팁을 사용하여 분리된 조직을 예열 배양 배지가 들어 있는 35mm 배양 플레이트로 옮깁니다.

E 13.5 to E 14.5 갑상선 X 도금 전. 먼저, 1ml의 예열 배양 배지를 포함하는 24웰 플레이트의 3웰로 연속적으로 옮겨 조직을 세척하여 엽을 사전 코팅된 챔버에 플레이트화합니다. 먼저 배양 배지를 흡인하고 여과된 팁이 있는 마이크로 피펫을 사용하여 각 배양실에 하나의 갑상선 엽을 조심스럽게 도금합니다.

여분의 배지를 제거한 다음 배양 챔버를 조직 배양 인큐베이터에 넣어 외식이 매트릭스에 부착될 수 있도록 합니다. 그런 다음 2시간 후 200-300마이크로리터의 예열 배양 배지를 각 웰에 부드럽게 추가하고 챔버를 다시 인큐베이터에 넣어 E 12.5 기관 영역 또는 갑상선 엽을 반다공성 필터에 플레이트화합니다. 먼저, 24웰 플레이트의 웰에 100마이크로리터와 30마이크로리터의 예열 배양물을 채웁니다.

매체 배치 필터는 매체에 놓습니다. 배양 필터 아래에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 여과된 팁이 있는 마이크로 피펫을 사용하여 갑상선 돌출부 또는 엽과 최소 부피의 매체를 각 필터의 중앙에 필터당 최대 4개의 엑스플랜으로 조심스럽게 옮깁니다.

X를 필터에 삽입할 때 매체가 필터 벽과 접촉하여 반월판을 생성하지 않도록 최소한의 매체로 필터 중앙으로 옮기는 것이 중요합니다. 마지막으로, 여분의 매체를 제거하고 텅스텐 바늘을 사용하여 간격을 둡니다. 그런 다음 최대 7일 동안 조직 배양 인큐베이터에 놓고 층류 후드 아래에서 격일로 배양 배지를 교체합니다.

필터에서 하루 동안 배양한 후 laa의 정중선은 상단 길이에 걸쳐 있고 기관의 양쪽에 두 개의 엽을 형성하는 길쭉한 조직으로 볼 수 있습니다. 배양을 통해 엽은 상피 세포의 형태 형성 조직을 거시적으로 볼 수 있는 여포 구조로 확장합니다. 이러한 이미지에서 입증된 바와 같이, e coherent, positive epithelial cell의 조직과 편광은 ezrin immuno labeling으로 시각화할 수 있습니다.

시간이 지남에 따라 ezrin 양성 세포 내 구조는 정점 극이 될 세포의 극과 융합되었습니다. 이 과정에서 내피 세포 양성 4 pcam이 증식하고 발달 중인 여포 주위를 조직하여 혈관 여포 단위를 형성합니다. thro, cyte 및 C cell의 분화를 정량화하기 위해 배양된 갑상선엽에서 분리된 RNA의 R-T-Q-P-C-R로 유전자 발현을 분석할 수 있습니다.

갑상선 전사 인자 NK X 2.1의 발현은 배양 중에 변하지 않지만, thy 특이적 thyroglobulin과 C cell specific calcitonin의 발현이 급격히 증가하여 기능적 분화를 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 갑상선 설명을 해부하고 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 야생형 또는 NOCO 배아를 사용하여 기능 이득 및 상실 실험을 수행할 준비가 되지 않았습니다.