Name: 예 생체 내 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 생체 외 배양 시스템을 이용한 마우스 갑상선 발생 연구 방법입니다. E12.5-E14.5 배아에서 갑상선 원기를 분리하고 배양하여 형태 발생 및 세포 분화 과정을 관찰할 수 있습니다.

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이 연구는 Université catholique de Louvain(Action de recherché concertées)과 Fund for Scientific Medical Research(F.R.S.-FNRS, 벨기에)의 보조금으로 지원되었습니다. A.-S.D.는 A.-C.H. 텔레비의 박사 과정 연구원입니다. 벨기에 농업 재단(Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture)의 펠로우십을 받았고, M.V.는 드 듀브 연구소(de Duve Institute)의 지원을 받았으며, C.E.P.는 벨기에 F.R.S.-FNRS의 선임 연구원이다.

마우스는 대학 동물 복지위원회의 실험실 동물 관리의 원칙에 따라 제기 및 처리 하였다. 모든 절차 및 프로토콜은이위원회에 의해 승인되었다. 1. 현미경 플라스틱 문화 챔버의 코팅 참고 : 층류 후드에서 무균 조건 하에서 다음의 모든 단계를 수행합니다. 코팅의 두 종류가 기능적으로 동일하다. <ol><li> 피브로넥틴 전에 갑상선 조직을 분리 한 하루 코트 플라스틱 문화 실 : <ol><li> 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.25 ㎍ / ㎖의의 fungizone 2 MM의 글루타민 (12)와 보충 M199 배지에서 50 ㎍ / ml의 최종 농도로 멸균 피브로넥틴을 희석. </li><li> 희석 피브로넥틴의 200 μL와 우물을 덮고 4 ° C의 냉장고에 하룻밤 배양한다. </li><li> 해부의 날, M1에 한 번 우물을 씻어, 피브로넥틴을 대기음99 및 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 M199 200 μL의 최소 부피를 추가한다. </li><li> 외식을 도금 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 코팅 된 실을 남겨주세요. </li></ol></li><li> 유형 코트 플라스틱 문화 챔버 나는 갑상선 조직을 분리하기 전에 2 시간 콜라겐 : <ol><li> 나는 10 mM의 염산에 50 ㎍ / ㎖의 최종 농도 콜라겐 멸균 유형을 희석. 참고 : 얼음 콜라겐 원액을 유지합니다. </li><li> I 콜라겐 희석 타입의 200 μL와 우물을 덮고 실온 (RT)에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 내가 솔루션을 콜라겐 유형을 대기음, M199 한 번 우물을 씻어 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청으로 보충 M199 200 μL의 최소 볼륨을 추가합니다. </li><li> 외식을 도금 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 코팅 된 실을 남겨주세요. </li></ol></li></ol> 갑상선 ANLAGEN 함유 조직의 2. 해부 (E12.5) 또는 갑상선 엽 (E13.5-E14.5) 참고 : 깨끗한 해부 도구와 페트리 / 문화 판을 사용합니다. 아래에서 설명하는 일반적인 단계와 절개 E12.5 및 E14.5 배아에 대해 동일합니다. <ol><li> 원하는 배아 (E12.5에서 E14.5에) (E) 일에 시간 초과 - 임신 여성 생쥐를 희생과 해부 도구를 사용하여 자궁을 제거합니다. </li><li> HBSS를 포함하는 10cm 접시에 해부 자궁을 놓습니다. </li><li> 집게로 자궁의 한 끝단을 잡고 점진적으로 모든 배아를 해방하는 작은 가위로 자궁을 엽니 다. </li><li> 가위로 태반에서 배아를 분리하고 HBSS를 포함하는 새로운 10cm 접시에 자신의 배외 (extraembryonic) 멤브레인 배아를 전송합니다. </li><li> 난황과 양막을 제거합니다. 참고 :이 시점에서, 아래에서 transillumination와 실체 현미경을 작동; 해부 단계 배율을 증가시킨다. 도구를 해부로 유리 모세관에있는 텅스텐 바늘을 사용합니다. </li><li> 같은 바늘을 사용나이프와 포크는, 위 턱과 귀 (따라 절단 그림 1A)를 포함하여, 머리의 윗부분을 제거합니다. </li><li> 그 뒷면에있는 배아를 잡고 먼저 신경 튜브의 추가 조각 (B 따라 절단 그림 1A), 배 (胚)의 후 하부, 단지 전방 사지에서와 마음 (그림 1B) 이상을 제거합니다. </li><li> HBSS를 포함하는 새로운 10cm 접시에 혀 (조직의 방향을)과 목 영역을 포함하는 배아 슬라이스를 전송합니다. </li><li> 신경 튜브를 제거하고 조직 (따라 절단 그림 1C) 식도 / 기관에 후부. </li><li> 부드럽게 섹션 (B와 B &#39;를 따라 잘라 그림 1C) 혀의 양측을 따라 조직 슬라이스. </li><li> 혀의 연장에서, 식도와 기관을 찾아 (그림 1D, 따라 절단), 그리고 로봇의 조직을 팽창 조각으로 부서져을 떠나, 혀를 멀리 해부(B와 B &#39;를 따라 잘라 그림 1D) 식도 / 기관 h의 측면. </li><li> 식도를 제거하고, 그 복부면이 위로 향하게하여 기관을 배치합니다. </li><li> 이러한 흉선 (그림 1E)와 인두 아치 동맥 옆으로있는 모든 조직과 원치 않는 조직을 멀리 해부하다. (그림 1 층, 빨간 점선) E13.5 또는 E14.5 배아의 경우, 기관의 양쪽에 갑상선 엽 (叶)을 시각화하고 또한 기관에서 엽 (叶)을 해부하다. </li><li> 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 예열 된 M199 배지를 함유하는 35mm 배양 접시에 절연 E12.5 기관지 영역 또는 E13.5-E14.5 갑상선 엽 전송. P-200 마이크로 피펫에 prewetted 필터 팁을 사용하여 외식을 전송합니다. E12.5 외식의 경우, 개방을 확대하는 팁의 사지를 잘라. 참고 : 배아가 동일한 유전자형이있는 경우 정기적으로하고, 모든 배아 단계 6 및 7을 수행,N 9-11, 그리고 마지막으로 12 &amp; 13. </li></ol> 갑상선 외식 3. 도금 및 문화 <ol><li> 예열 된 배지 1 ㎖를 함유하는 24 - 웰 플레이트의 웰에 세 연속 전송으로 이식편을 워시 (= M199 항생제, 글루타민, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된). </li><li> 코팅 현미경 플라스틱 문화 실에 갑상선 엽 (叶)의 도금 : <ol><li> 코팅 챔버에서 대기음 M199 배지. </li><li> 조심스럽게, 마이크로 피펫 및 필터 팁을 사용하여 배양 챔버로 갑상선 외식을 전송합니다. 각 실의 중앙에 하나의 이식편을 놓습니다. </li><li> 초과 매체를 제거하고 조직 문화 인큐베이터에서 배양 챔버를 배치 (37 °의 C, 5 % CO 2) 2 시간 동안 외식 행렬에 부착 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 잘 각각 예열 문화 매체의 200-300 μl를 추가합니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 장기 문화를 품다. </li></ol></li><li> 도금 Osemiporous 필터에 대한 F의 기관 영역 또는 갑상선 엽 (叶) : <ol><li> 예열 된 배지 330 μL에 필요한 24 - 웰 플레이트의 우물의 수를 입력합니다. </li><li> 문화 필터 아래 기포의 포획을 방지하기 위해주의하면서 중간에 자리 필터 (예를 들어, 0.4 μm의 밀리 포아 필터). </li><li> 조심스럽게, 마이크로 피펫 및 필터 팁을 사용하면, 필터의 중심 (최대 4/filter)에 매체의 최소한의 볼륨 갑상선 외식을 전송합니다. </li><li> 텅스텐 바늘로 외식 밖으로 매체와 공간의 초과를 제거합니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 장기 문화를 품다. 참고 : 층류 후드에서 변경 배지 매일. 7 일까지 문화 외식. </li></ol></li></ol> 갑상선의 Explants 4. 전체 마운트 면역 형광 염색법 프로토콜 텅스텐 바늘을 사용하거나 (아래 2 단계 이후) 필터에 성장 외식을 제거미세 집게와 차 (5 단계), 제 2 (7 단계) 항체 배양 (96 - 웰 플레이트)을 제외한 모든 단계를위한 24 - 웰 플레이트에 전송. 현미경 플라스틱 실에서 배양 부착 외식의 경우, 문화 챔버의 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> 기음 M199 배지와 20 분 (24 - 잘 접시에 500 μL와 현미경 슬라이드에 300 μL)를위한 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 이식편을 고정합니다. </li><li> 트리톤과 트리스 완충 생리 식염수로 2 배 10 분 세척 (TBST, 50 mM 트리스 염산의 pH 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트리톤 X-100)를 RT에서. </li><li> -20 ℃에서 바로 외식 또는 저장 처리 주 : -20 ° C에서의 장기 저장을 위해, 서서히 100 % 메탄올에 도달하는 TBST에 메탄올 농도를 증가시킴으로써 메탄올 이식편 탈수. 준비가 면역 염색 (4 단계)를 계속하면 점차 메탄올 TBST를 추가하여 외식을 재수. </li><li> 차단 용액 (10 % TBST 정상 염소 혈청 TBST를 교체)와 실온에서 30 ~ 60 분 동안 바다를 보았다 로커에 품어. </li><li> (조건 당 100 ~ 200 μL)를 차단 솔루션 1 차 항체를 희석. 96 - 웰 플레이트에 24 - 웰 플레이트에서 &quot;필터&quot;외식을 전송합니다. 4 ℃에서 하룻밤 바다 톱 로커의 기본 항체 절편을 품어 </li><li> 다음 날, 차 항체 솔루션을 버리고 다시 24 웰 플레이트의 &quot;필터&quot;외식을 전송하고, 45 ~ 60 분 실온에서 각각 바다 톱 로커에 TBST로 5 배 이상 씻는다. </li><li> 정상 염소 혈청의 1 %가 포함 된 TBST에서 이차 항체 (1:2,000 희석 예를 들어, 염소 항 - X-알렉사 플 루어)를 희석하고 4 ° C에서와 어둠 속에서 바다를 보았다 로커에 하룻밤이 희석 외식을 배양한다. 핵 counterstaining를 들어, 함께 차 항체 솔루션 비스 - Benzimide (헥스) 1 ㎍ / ㎖의 (가) 있습니다. </li><li> 다음 날, 차 항체 솔루션을 버리고 바다 톱에 TBST로 배를 씻어45 ~ 60 분 실온에서 각각 로커. 세척하는 동안 어둠 속에서 외식을 유지합니다. </li><li> TBST 부드럽게 어둠 속에서 4 ° C에서 하룻밤 소용돌이에 추가 세척을 수행합니다. </li><li> 후위 10 분 동안 4 ° C에서 4 % PFA의 면역 염색 외식. </li><li> TBST로 2 배 10 분 씻으십시오. </li><li> -20 ° C에서 장기 저장을 위해 하나 점차 메탄올 100 %를 외식을 전송하거나 즉시 분석 할 수 있습니다. 필터에서 배양, 24 웰 플레이트에 면역 염색, 이전에 다 나 공 초점 현미경 분석 TBST 이상 형광등 설치 매체와 현미경 실 (예 : LabTek 또는 Ibidi)에 전송 외식하십시오. </li></ol> 갑상선에서 RNA의 5. 추출 RNase가없는 환경에서 작업 할 수 있습니다. 따라서, 핵산과 핵산 분해 효소 무료 피펫 팁을 사용하여 오염 물질과 RNases에서 벤치 및 장비를 모두 청소합니다. 페놀 / 클로로포름를 기반으로하기 때문에이 프로토콜은, 첫 번째 단계를 수행의 화학 후드 (1 ~ 7). <ol><li> 1.5 ML 튜브에 일회용 유를 사용하여 RNA 추출 용액 300 μL로 한 갑상선 이식편 또는 두 개의 갑상선 엽 (叶)을 균질화. 의 샘플 사이에, 에탄올 다음, 물 다음, 2 % SDS에서 유를 세척한다. </li><li> RNA 추출 솔루션의 또 다른 100 μL, 소용돌이 10 초를 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 30 초 동안 소용돌이와 각 샘플의 tRNA의 20 NG를 추가합니다. </li><li> 1 분 동안 소용돌이와 클로로포름의 80 μl를 추가합니다. </li><li> 소용돌이가 격렬하게 30 초 및 RT에서 15 분 알을 품다. </li><li> 냉장 (4 ℃) 원심 분리기에서 19,000 XG에 15 분 동안 스핀. </li><li> coprecipitant으로 글리코겐의 20 μg을 함유하는 신선한 튜브에 조심스럽게 무색 위 수성 단계를 전송합니다. </li><li> 소용돌이와 100 % 이소프로판올 알코올의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 15 ~ 30 초 동안 격렬하게 소용돌이 2 ~ 3 시간 동안 -20 ° C 또는 1 시간 동안 -80 ° C에서 RNA 침전물을 할 수 있습니다. </li><li> 19,000에서 30 분 동안 스핀4 ° C에서 XG, 상층 액을 제거한다. </li><li> 펠렛을 제거하는 차가운 75 %의 에탄올과 소용돌이의 450 μL로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 4 ° C에서 19,000 XG에 10 분 동안 회전하고, 상층 액을 제거한다. </li><li> 5 분 후드 펠렛을 건조. </li><li> RNase가없는 물 10 μL로 펠렛을 재현 탁하고, 실온에서 10 분 알을 품다. </li><li> 분석 RNA 농도, -80 ° C에서 저장 또는 역방향 유전자 발현 분석을위한 표기. </li></ol>

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이 논문은 해부 갑상선 형성으로 이어지는 복잡한 이벤트를 공부하고 더 잘 이해하기 위해 갑상선 외식 (E12.5) 또는 돌출부 (E14.5)를 배양하는 방법을 설명합니다. 인해 갑상선 ANLAGEN (정중선 anlage 및이 횡 ultimobranchial 체), 및 그 작은 크기, 인두 아치 동맥 E12.5 조직 지역화 주동이의 단편, 및 기관을 포함하는, 그러나 식도의 이중 원점 microdissected 있습니다. 도시 된 바와 같이, 사일의 기간 내에,이 배양 시스템은 충실히 이후 생체 내 갑상선 발달 되풀이되었습니다 : (ⅰ) 정중선 anlage는 양측 마이그레이션 및 UB로, 좁은 지협에 의해 연결된 두 개의 갑상선 돌출부 (도 2A)를 형성하도록 해 (II) 전구체는 갑상선 여포 세포로의 질량으로부터 재구성 궁극적 소재 (III) 내피 세포가 존재하는 (도 2b 및도 3a)을 편광microdissected 조직의 증식은 갑...

갑상선 내피 모세 혈관의 밀도가 네트워크에 둘러싸여 여포라는 독립적 인 상피 분야의 모음입니다. 이 조직은 갑상선 기능 수 : 내피 모세관은 T3와 T4 호르몬 합성에 필요한 요오드와 thyrocytes를 제​​공하고, 몸 전체에 후자를 배포 할 수 있습니다. 모공과 모세 혈관 사이에 흩어져, C-세포는 1 칼시토닌 hypocalcemic 호르몬을 생산하고 있습니다. 성인 갑상선의 구조와 기능이 잘 알려져 있지만, 갑상선 배아 발달 (뿌리의 형성과 분화)에 관련된 세포 및 분자 메커니즘은 지금까지 이해되지 있습니다. 배 발생시, (C-세포의 전구 세포는 물방울 모양의 돌기로 E11.5에서 시작하는 동안 조상이 배아 일에 foregut의 내배엽의 복부 벽의 비후 (중간 선 anlage) (E) 마우스 배아에서 8.5으로 유래 thyrocytes ultimobranchial 보네 번째 인두 낭 2-6) 죽는다. 중간 선 봉오리는, 내배엽에서 분리 기관의 각 측면에 ultimobranchial기구와 E13.5에서 융합 양측으로 확장됩니다. 마지막으로, thyrocytes는 여포로 구성하고 C-세포는 분화. 갑상선 형성에 대한 현재의 지식은 주로 고정 된 조직의 조직 학적 분석을 제공하지만 갑상선 형성에 관여 형태 발생 이벤트는 매우 동적이며 다른 종류의 세포 사이의 세포 외 기질 (extracellular matrix)과의 통신 및 상호 작용을 포함한다. 최근 작품은 thyrocyte 전구 세포가 개발 갑상선에 내피 세포를 보충하는 VEGF의 높은 수준을 생산하고, 차례 차례로, 내피 세포가 모낭의 형성을 촉진하고 C-세포의 분화 7 모집 것으로 나타났다. 갑상선에있는 대부분의 생체 연구는 어느 차원 조직 배양 플라스틱 D에게 성장, 고립 된 성인의 갑상선 유래 세포에 수행 된ishes 또는 3D 행렬에. 문화의 이러한 유형의 차별화 된 모낭 세포 편광 유지하고 여포로 구성하거나 3D 조직 8-10을 다시 가져 오기를 사용하여. 그러나, 그들의 생리적 환경에서 외식 및 2D에서 배양 이러한 순수 상피 세포는, 세포 외 기질, 시토 킨, 성장 인자와 함께 그들이 일반적으로 생체 내에서 발생할 같은 내피 또는 신경 세포와 같은 다른 세포 유형의 상호 작용을 무시한다. 아주 좋은 연구는 최근 3 차원 매트 리겔 (11)에서 최종 배양 단계를 사용하여 갑상선 여포에 ES 세포의 분화 프로토콜을 설명했다. 그러나, 이러한 3 차원 배양은 다른 세포 유형과의 접촉이 부족하다. 췌장과 타액에 대한 이전의 전문 지식을 바탕으로 기관 배양 12-14, 마우스 배아 갑상선 ANLAGEN을 해부하고 semiporous 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드에 외식을 배양하는 방법을 동맥이 개발되었다. 언제E12.5 배아 작업, 갑상선 ANLAGEN (중간 선 anlage 두 측면 ultimobranchial 기관)의 이중 기원은 조직의 큰 조각의 미세 절제를 부과했다. 이것은 기관 아니지만 식도를 포함하고, 조각으로 부서져 종기까지 인두 아치 동맥으로부터 연장. 필터상에서 배양하면 그들은 여전히​​ 좁은 지협에 의해 접속이 갑상선 돌출부를 형성하도록 ultimobranchial 체와 융합 여기서 정중선 anlage은 기관의 각 측면에 횡 방향으로 연장된다. 문화, 상피 세포 증식, 모낭에 정리하고 자신의 기원에 따라 thyrocytes와 C-세포로 분화. microdissected 조직에 포함 된 내피 세포는 증식하고 마지막으로 독립적으로 혈액의 흐름 또는 순환 요인의 상피 모낭 구조와 밀접하게 연관 갑상선 엽 (叶)에 침입. 외식의 개발은 충실하게 개발 생체 내에서 되풀이되었습니다으로, 표준이 문화 시스템은 형태 발생과 갑상선 개발 과정에서 발생하는 차별 사건을 연구하기에 최적입니다. 갑상선 조직은 야생형 녹아웃 또는 형광 형질 전환 배아로부터 수득 될 수 있고, 배양 시스템은 손실 및 기능 획득 실험 의무이다. 마지막으로, 현미경 플라스틱 접시에 형광 표지 갑상선 외식의 시간 경과 영상은 더 나은 생체 내에서 발생하는 반응 속도와 형태 형성 운동의 연속성을 조사하기 위해 악용 될 수 있습니다. 시간 경과 영상은 이미 췌장 15, 16 또는 ureteric 버드 (17)의 분기 형태 형성을 연구하는 데 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>&마이크로;-슬라이드 8 웰, ibiTreat, 조직 배양 처리, 멸균</td><td>proxylab</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 I, 쥐 꼬리</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈장에서 추출한 피브로</td><td>넥틴 Invitrogen</td><td># 33010-018</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 와이어</td><td>Goodfellow</td><td>LS237450</td><td></td></tr><tr><td>배양 플레이트 인서트 (직경 12mm)</td> <td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>610182</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-661-P1</td><td>1/400</td></tr><tr><td>PECAM</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>1/100</td></tr>년<tr><td>Hoechst</td><td>시그마</td><td>B2261</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

갑상선은 갑상선 호르몬 T3, T4, 그리고 칼시토닌을 생산, 목의 기지에서 지역화 bilobated 내분비 선입니다. 칼시토닌은 모공과 모세 혈관의 밀도가 네트워크 사이에 산재 C-세포에 의해 합성되는 동안 T3와 T4는 여포라는 폐쇄 된 분야로 구성 차별화 thyrocytes에 의해 생성된다. 성인 갑상선 아키텍처 및 기능은 광범위하게 기술되고 연구되어 왔지만, &quot;angio-모낭&quot;단위, 실질에서 C-세포의 분포 및 상피와 내피 세포 사이의 주변 분비 통신의 형성은 작게 이해되는 것이다. 이 방법은 semiporous 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드에 마우스 배아 갑상선 ANLAGEN 해부와 문화의 순차적 단계를 설명합니다. 사일의 기간 내에,이 배양 시스템은 생체 충실히 갑상선 발달 되풀이되었습니다. 사실, (I) 억원기관의 obation는 (E12.5 외식을 위해)가 발생, (II) 전구체는 여포로 구성하고 극화 (III) thyrocytes와 C-세포가 분화하고, (ⅳ) microdissected 조직의 증식에 존재하는 내피 세포가로 마이그레이션 thyrocytes 그들은 생체 내에서와 마찬가지로 밀접하게 갑상선 엽 (叶), 그리고, 상피 세포와 연결합니다. 갑상선 조직은 야생형, 녹아웃 또는 형광 유전자 변형 배아에서 얻을 수 있습니다. 또한, 면역 염색 및 RT-qPCR에 의해 생체 외 개발이 실시간으로 분석 할 수있다. 문화 항체, 성장 인자, 또는 세포 또는 배양 상청을 차단 억제제의 첨가에 의해 조작 될 수 이식편 또는 배양 언제든지. 하류 전체 마운트 또는 섹션 이미징 및 유전자 발현 프로파일 링 갑상선 O의 형태 형성과 분화 사건을 조작하고 공부를위한 강력한 시스템을 제공에 결합 된 결론, 갑상선 이식편 문화rganogenesis.

갑상선 anlages (중간 선 및 UB 함께 주위 조직과), 갑상선 엽 (叶)은 각각 E12.5 및 e13.5/e14.5에서 마우스 배아 (그림 1)에서 해부된다. 필터에 문화에서 하나의 하루를 보낸 후, 중간 선 anlage는 기관의 상단에 걸쳐 연장 된 조직으로 (그림 2A)를 볼 수 있습니다. 그것은 점진적으로 기관의 각 측면에 두 개의 엽 (叶)을 형성한다. 고립 된 갑상선 엽 (叶) (E13.5 또는 E14.5)이 배양, 그들은 확장 형태 형성과 상피 세포가 거시적으로 볼 여포 구조 (그림 2B)로 구성됩니다 받게 될 것이다. 조직 및 E-cadherin의 레이블이 상피 세포의 편광, ezrin의 immunolabeling (그림 3A)에 의해 시각하실 수 있습니다. Ezrin 양성 세포 내 구조를 점진적으로, 그리고 공동의 방법으로, 꼭대기의 ...

이 프로토콜은 쥐 배아 갑상선 항라겐의 해부와 반다공성 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드의 외식자리 배양을 설명합니다. 이 시스템은 야생형 또는 녹아웃 배아의 갑상선 발달 과정에서 발생하는 형태발생학적 또는 분화 현상을 연구하는 데 이상적이며, 이득 및 기능 상실 실험에 적합합니다.

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

본 절차의 전반적인 목적은 엑스 비보(ex vivo) 배양 중인 생쥐 배아 갑상선 이식물 또는 엽을 해부하여 갑상선 발달 과정에서 일어나는 형태 형성 및 분화 사건을 연구하는 것입니다. 이를 위해 우선 배아일 E 12.5에서 E 14.5 사이의 생쥐 배아에서 상악과 신체 하부를 제거하여 배아의 목 부위를 분리합니다.두 번째 단계에서는 기관 및 식도의 상단부를 노출시키기 위해 신경관, 외측 조직 및 혀를 제거합니다. 다음으로, 갑상선 싹, 영역 또는 엽에서 원하지 않는 조직을 추가로 깨끗이 제거합니다. 마지막 단계에서는 갑상선 이식편을 코팅된 마이크로웰이나 필터 위에 배양을 위해 플레이팅합니다.최종적으로, 타임랩스 이미징, 면역 염색 또는 유전자 발현 분석을 수행하여 상피 형태 형성의 3차원 구조와 여포, 이식물의 혈관 형성 또는 갑상선 전구세포 분화를 연구할 수 있습니다. 이 방법은 3D 환경에서의 갑상선 상피세포 조직화, 루멘 형성, 세포 분화, 극성 및 성장과 관련된 핵심적인 발생 및 분화 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.실험 절차는 층류 후드(laminar flow hood) 내의 무균 조건 하에서, 본 연구실의 대학원생인 Fidel Marcel과 박사후 연구원 Myla LaCorte가 시연하겠습니다. 갑상선 조직을 분리하기 2시간 전에 멸균된 Type one collagen을 10 millimolar hydrogen chloride에 희석하여 최종 농도가 50 microgram per milliliter가 되도록 조제한 후, 콜라겐을 얼음에 보관하십시오.그런 다음 플라스틱 배양 챔버의 각 웰에 희석된 콜라겐 200 µL를 덮고 챔버를 상온에서 배양합니다. 2시간 후, 콜라겐을 흡입하여 제거합니다. 웰을 M1 99 배지로 헹구고 각 웰에 최소 200 µL의 배양액을 추가합니다. 코팅된 챔버를 인큐베이터에 넣은 다음 갑상선 절제 과정을 진행합니다.먼저, 적출한 자궁을 HBSS가 담긴 10 centimeter 플레이트에 넣습니다. 다음으로, 포셉을 사용하여 자궁의 한쪽 끝을 잡고 작은 가위로 자궁을 절개하여 배아를 하나씩 순차적으로 꺼냅니다. 가위를 사용하여 배아를 태반에서 분리한 후, 배아를 배외막과 함께 신선한 HBSS가 담긴 새로운 10 centimeter 플레이트로 옮깁니다.다음으로, 각 배아에 대해 실체 현미경 하에서 해부를 계속합니다. 먼저, 난황낭과 양막을 제거합니다. 그런 다음 유리 모세관에 삽입된 텅스텐 바늘을 칼과 포크처럼 사용하여 잡습니다.상악과 귀를 포함하여 머리의 윗부분을 제거합니다. 배아를 등 쪽이 아래로 가도록 잡습니다. 그런 다음 신경관의 일부를 추가로 제거하고, 앞다리 바로 아래이자 심장 윗부분에 해당하는 배아의 하단부를 제거합니다.조직의 방향을 잡기 위해, 혀와 목 부위가 포함된 배아 절편을 신선한 HBSS가 담긴 새로운 10 centimeter 플레이트로 옮기고, 신경관과 식도 및 기관 뒤쪽의 조직을 제거합니다. 이제 혀의 양측을 따라 조직 절편을 조심스럽게 절단합니다. 그런 다음 식도와 기관의 위치를 찾아 혀를 박리하여 제거하고, 레티노이드 팽대(retinoid swelling)와 식도 및 기관 양측의 조직만 남깁니다.혀를 제거한 후, 식도를 박리하고 기관을 복측이 위로 오게 놓습니다. 그런 다음 흉선 및 인두궁 동맥의 외측에 위치한 모든 조직과 같이 불필요한 조직들을 박리합니다. 이어서 E 13.5 또는 E 14.5 배아의 경우, 기관 양측의 갑상선 엽을 확인하고 기관에서 엽을 추가로 박리합니다.E 12.5 배아의 경우, 혀와 식도를 절제할 때까지는 방금 시연한 방식대로 해부를 수행합니다. 그 후 인두궁 동맥의 위치를 확인하고, E 13.5에서 14.5 배아와 마찬가지로 모든 외측 조직을 제거합니다. 마지막으로, P 200 마이크로 피펫에 미리 적신 필터 팁을 사용하여 분리된 조직을 미리 데워둔 배양액이 들어 있는 35 millimeter 배양 플레이트로 옮깁니다.E 13.5에서 E 14.5 사이의 갑상선 외식편(explant)을 도말하기 전, 먼저 1 mL의 예열된 배지가 담긴 24웰 플레이트의 웰 세 개에 조직을 차례로 옮겨 세척한 후, 코팅된 챔버에 엽(lobe)을 도말합니다. 먼저 배지를 흡입하여 제거하고, 필터 팁이 장착된 마이크로 피펫을 사용하여 각 배양 챔버에 갑상선 엽을 하나씩 조심스럽게 도말합니다.과잉 배지를 제거한 다음, 배양 챔버를 조직 배양 인큐베이터에 넣어 외식편이 매트릭스에 부착되도록 합니다. 2시간 후, 각 웰에 미리 데워둔 배지 200 to 300 µL를 천천히 첨가하고 챔버를 다시 인큐베이터에 넣어 E 12.5 기관 영역 또는 갑상선 엽을 반투과성 필터 위에 도말합니다. 먼저, 24웰 플레이트의 각 웰에 미리 데워둔 배지 130 µL를 채웁니다.배지를 사용하여 필터를 배지 위에 배치합니다. 이때 배양 필터 아래에 공기 방울이 갇히지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 필터 팁이 장착된 마이크로 파이펫을 사용하여 갑상선 절편 또는 엽과 최소량의 배지를 각 필터의 중앙으로 조심스럽게 옮기며, 필터당 최대 4개의 절편까지 배치합니다.X를 필터 위에 떨어뜨릴 때, 배지가 필터 벽에 닿아 메니스커스(meniscus)가 형성되는 것을 방지하기 위해 최소한의 배지를 사용하여 중심부로 옮기는 것이 중요합니다. 마지막으로, 과도한 배지를 제거하고 텅스텐 바늘을 사용하여 이들의 간격을 넓혀줍니다. 그 후, 층류 후드 내에서 이틀마다 배지를 교체하며 조직 배양 인큐베이터에 최대 7일 동안 배양합니다.필터 위에서 하루 동안 배양한 후, laa의 중앙선은 상단 길이를 가로지르며 기관 양측에 두 개의 엽을 형성하는 길쭉한 조직으로 나타납니다. 배양 과정에서 엽이 확장되며 상피 세포가 거시적으로 보이는 여포 구조로 형태 형성 조직화를 거칩니다. 이 이미지들에서 보여주듯이, 응집된 양성 상피 세포의 조직화와 극성은 ezrin 면역 표지로 시각화할 수 있습니다.시간이 지남에 따라, ezrin 양성 세포 내 구조들은 세포의 극 중 나중에 정단극(apical pole)이 될 부위와 융합되었습니다. 이 과정 동안, pcam 양성 혈관 내피 세포들이 증식하고 발달 중인 여포 주변으로 배열되어 혈관 여포 단위(angio follicular units)를 형성합니다. 갑상선 세포(thyrocytes)와 C 세포의 분화 정도를 정량화하기 위해, 배양된 갑상선 엽에서 분리한 RNA를 이용하여 RT-qPCR로 유전자 발현을 분석할 수 있습니다.갑상선 전사 인자인 NK X 2.1의 발현은 배양 과정 동안 변하지 않지만, 갑상선 특이적 thyroglobulin과 C 세포 특이적 calcitonin의 발현이 급격히 증가하는 것은 기능적 분화가 일어났음을 나타냅니다. 이 영상을 시청하고 나면 갑상선 조직편을 박리하고 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이제 야생형 또는 NOCO 배아를 이용한 기능 획득 및 상실 실험을 수행할 준비가 되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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