Name: T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 정적 접착 분석법을 이용하여 T 림프구의 세포 접착을 정량화하는 방법을 익히세요. 형광 측정으로 치료 효과를 평가하고 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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Hirschil 신뢰, 마이클 Saperstein 의료 학자 연구 자금 및 NYU 화이트 헤드의 교제는이 작업을 지원했다.

1. 마이크로 웰스에게 코팅 참고 :이 단계의 목표는 T 세포 LFA-1에 대한 리간드 역할을하는 ICAM-1과 코트 폴리스티렌 표면에 있습니다. <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ol><li> 재현 탁하여 코팅액을 제조 재조합 ICAM-1 칼슘 (1 mm의 풍부한 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 ㎜ KH 2 PO 4, 산도 7.4)와 염화칼슘), 마그네슘 (MgCl2를 2 nm의 2). ICAM-1의 최종 농도가 0.7 ㎎ / ㎖의 원액으로 만든 및 -80 ° C 냉동고에 보관 10 ㎍ / ㎖, 있는지 확인하십시오. </li><li> 0.5 %의 인간 (또는 소) 혈청 알부민 (HSA / BSA), 2 mM의 MgCl2를, 1 mM의 염화칼슘과 PBS를 풍부하게하여 접착 솔루션을 준비합니다. </li><li> PBS에 2 mM의 MgCl2를 1 mM의 염화칼슘을 추가하여 세척 솔루션을 준비합니다. 37 모든 솔루션을 따뜻하게사용하기 전에 C를 °. </li></ol></li><li> 세척 용액 50 μL와 24 우물을 씻으십시오. 이 씻지 않은 우물, 긍정적 인 (PMA 처리 된 세포), 마이너스 (코팅 우물) 컨트롤이 포함됩니다. 각 조건은 적어도 세 개의 우물 (세중)을 설정하십시오. </li><li> 각 웰에 코팅 용액 50 μl를 추가합니다. 코팅되지 않은 제어 우물에 추가하지 마십시오. 37 ° C의 배양기 안에서 한 시간 동안 배양한다. </li><li> 팁은 웰의 바닥을 터치 할 수 있도록하지 않고, 부드럽게 도포 액을 대기음. 세척 용액을 50 μL로 한 번 씻는다. </li><li> 접착 액의 50 μl를 추가하고 37 ° C의 배양기 내에서 한 시간 동안 마이크로 플레이트를 품어. </li><li> 대기음 부드럽게 50 μL 세척 용액을 한 번 씻어. 그러나 그것은 하룻밤 4 ℃에서 보관하는 것이 가능하고, 같은 날에 플레이트를 사용하고, 다음 날을 사용합니다. </li></ol> 혈액에서 2. T 세포 분리 <ol><li> 50 μL / ㎖ O에 인간의 T 세포 농축 칵테일을 추가F 전체 혈액 (항응고제 3 ㎖ (헤파린, EDTA 또는 구연산) 전체 혈액에 대한 예를 들어, 칵테일 150 μl를 추가합니다). 잘 섞는다. </li><li> 실온에서 20 분 배양한다. </li><li> 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 3 ㎖의 혈액을 처리하고 실온에서 1 % D-글루코스와 충실 (칼슘 및 마그네슘)없이 PBS의 동일 부피를 추가한다. 파스퇴르 피펫으로 가볍게 섞는다. </li><li> 원심 분리 관에 15 ㎖의 피콜-Paque PLUS를 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 림프구 분리 매체에 혈액 샘플을 희석 6 ㎖의 레이어. </li><li> 휴식 떨어져 20 ° C에서 20 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 인터페이스에 방해받지 림프구 계층을 떠나 깨끗한 파스퇴르 피펫을 사용하여 상위 계층을 그립니다. 플라즈마의 상위 계층은 나중에 사용하기 위해 저장 될 수 있습니다. 깨끗한 파스퇴르 피펫 깨끗한 원심 분리기 튜브에 림프구 층을 전송 사용. </li><li> 림프구에 PBS의 3 권 (9 ㎖)에 추가합니다. 부드럽게하여 세포를 일시 DRA날개 그들과 파스​​퇴르 피펫 중. </li><li> 20 ℃에서 5 분 400 XG에 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 제거합니다. 림프구는 이제 응용 프로그램에 적합한 매체에서 일시 중단해야합니다. 20 ㎖의 T-75 플라스크에 배양 세포를 이동 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 RPMI 1640 매체. </li></ol> 세포의 3. 준비 참고 : 세포가 형광 시약으로 표시되어야하는 전제 조건이다. 이 프로토콜에서 발현하는 세포가 수용 가능한 대안 카르복시 플루오 레세 인 숙신 에스테르 (CFSE), 그러나 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용합니다. <ol><li> 혈구를 사용하여 2.4 × 10 6 T 세포 (각 웰에 1 × 10 5)를 계산합니다. </li><li> 혈청 (혈청 기아) 부족 배양 배지에서 세포를 Resuspend. 37 ° C의 배양기에서 2 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 5 분 (400 XG)에 대한 세포를 원심 분리기. 미디어를 대기음1 ml의 PBS에 재현 탁. </li><li> 1:1000 희석 (5 mm로 만들어 주)에 CFSE를 추가합니다. 빛으로부터 덮고 실온에서 13 분 동안 배양한다. </li><li> 37 ° C PBS 10 ㎖를 첨가하여 반응을 중지하고 5 분 400 XG에 스핀. </li><li> 예열 접착 용액 (50 μL 당 1 × 10 5 세포)의 1.2 ml의 세포 펠렛을 다시하면 일시 중지합니다. </li></ol> 셀의 4. 자극 주 : 접착을 개시하기 위해, 세포가 자극되어야한다. 다음 실험에서 세포를 항-CD3 항체를 사용하여 가교 결합 TCR을 통해 자극 그러나 수용성 SDF-1의 대안이 될 수있다. 실험의 목적에 따라 다양한 약리 시약은 세포 접착에 미치는 영향을 연구하기 위해 자극 전 또는 동안 첨가 될 수있다. 포르 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)는 두 번째 메신저 디아 실 글리세롤 (DAG)와 구조적으로 유사하고, 따라서 여러 키나제를 활성화 포르 볼 에스테르입니다하류 TCR (주로 단백질 키나제 C)들; 여기로는 양성 대조군으로 사용된다. <ol><li> 37 ° C로 마이크로 따뜻하게 </li><li> 8 빈 1.5 ML 튜브 (각 튜브에 150 μL), 각 조건에 대해 하나의 튜브에 세포를 나눈다. </li><li> 그에 따라 세포 치료 : <ol><li> 긍정적 인 제어를 제공하기 위해 10 NG / ML에서 PMA와 함께 하나의 튜브를 자극한다. 자극에 대한 제어 ( &quot;자극 없음&quot;), 씻지 않은 컨트롤을로드 ( &quot;아니오 세척&quot;), 및 ICAM-1 코팅 제어 ( &quot;코팅&quot;) 역할을하는, 처리되지 않은 세 개의 튜브를 유지합니다. </li><li> 항-CD3 항체의 다양한 농도 (0.1, 1, 5, 10 ㎍ / ml)로 네 개의 튜브를 자극한다. 지연하지 않고 다음 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 또한 각 빈에 자극을 세포 믹스의 나누어지는 50 μL. 웰 당 세포의 마지막 수는 1 × 10 5이다. </li><li> 15 분 동안 37 ° C의 배양기에서 마이크로 플레이트를 놓습니다. 참고 : 일부 T 세포 라인이 짧은 stimula을 필요로<html> 기 시간. 이 시간 동안, 세포는 웰의 바닥에 정착되고 표적 리간드에 밀착. </li></ol> 5. 세탁 멀리 비 부착 세포 주 :이 단계의 목적은 리간드 - 코팅 표면과 단단히 접촉을 형성 할 수 없었던 세포를 제거하는 것이다. 같은 물리적 힘이 모든 우물에 적용되어 있는지 확인하기 위해이 단계를위한 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 이는 부착 세포의 비율의 계산을 돕기 위해 씻지 표시된 대조군 웰을 유지하는 것이 중요하다. <ol><li> 각 우물에 따뜻한 접착 용액 150 μl를 추가합니다. 우물에서 매체를 제거하기 전에 몇 초 동안 부드럽게 판을 흔들어. 끝으로 우물의 바닥을 만지​​지 마십시오. </li><li> 이 과정을 세 번 반복합니다. 버퍼를 안팎으로 피펫 팅 할 때 피펫의 방향을 변경합니다. </li></ol> 6. 자기편 세포의 비율을 결정 _content &quot;&gt; 주 :이 단계에서 형광 플레이트 판독기 내에서 각 웰의 형광 강도를 측정하기 위해 사용되는 강도가 부착 세포의 수와 직접적인 상관 관계에있다.. <ol><li> 플레이트 리더를 켭니다. 바탕 화면에 바로 가기 아이콘을 클릭하여 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다. <ol><li> &quot;작업&quot;메뉴에서 새로운 프로토콜을 설정하는 &quot;새&quot;를 클릭합니다. </li><li> &quot;작업&quot;메뉴에서 &quot;읽기&quot;옵션을 선택합니다. &quot;형광 강도&quot;를 클릭하고 &quot;확인&quot;탭을 누르십시오. </li><li> 드롭 다운 메뉴에서 &quot;여기 파장 485&quot;과 &quot;방출 파장 528&quot;를 선택합니다. &quot;확인&quot;탭을 누르십시오. </li><li> &quot;눈&quot;옵션 메뉴에서 &quot;바닥&quot;을 선택하고 &quot;확인&quot;탭을 누르십시오. 다시 &quot;작업&quot;메뉴로 이동하여 37 ° C로 온도를 설정하고 &quot;확인&quot;을 클릭합니다. </li><li> 플레이트 리더로 ​​마이크로 플레이트를 삽입하고&quot;실행&quot;을 클릭합니다. 결과는 엑셀 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 다음과 같은 공식을 사용하여 부착 세포의 비율을 계산 : 자기편 세포의 백분율 = (세척 우물에서 읽을 평균 형광 강도) / (씻지 않은 세포에서 읽을 평균 형광 강도) × 100 %. </li></ol>

<ol><li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li>
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<li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li>
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</ol>

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LFA-1의 활성화 및 T 세포 접착 (12)에 신호를 연구하는 몇 가지 분석이있다. 유동 세포 계측법은 절곡 또는 LFA-1 확장 하나에 선택적으로 결합 모노클로 날 항체를 사용하여 살아있는 세포에 LFA-1의 궁합 상태를 측정하는 데 사용된다. 이 방법의 한계 중 하나는 계정에 인테그린 &#39;갈망을하지 않는다는 것입니다. 마이그레이션 분석은 유용한 도구입니다 있지만 특정 시점에서 순대 접착을하지 마이그레이션을 측정합니다. T 림프구의 이동 (예 : 피부 과민성 모델)을 연구하는 마우스 모델 그러나이 모델의 활용은 인성 및 실행하는 복잡한 생리 학적으로 적합하다. 여기에 설명 된 정적 접착 분석의 주요 장점은 간단한 방식으로 욕망과 친 화성을 모두 측정 할 수있는 기능입니다. 이 방법의 또 다른 장점은 신속하고 정확하게 세포의 작은 수를 검출하는 능력이다. 다른 방법과 비교하면 manip 훨씬 용이ulate 세포와 우리가 설명하는 하나의 기능 분석에서 다른 시약을 취급합니다. 또한, 부...

T 림프구의 접착은 면역 반응 1에 근본적인 과정이다. 그것은 주사 항원 표적 세포 (2)와 림프절 내의 세포 (APC)를 제시하고, 면역 시냅스 형성 (IS)에 대한 내피 세포가 모세관 벽 장식과 T 세포 상호 작용을 위해 요구된다. 이러한 요구 사항은 기능과 역학적으로 구별된다. 림프구의 혈관 외 유출의 과정은 chemoattraction, 압연, 밀착성, 그리고 윤회로 구성되어 있습니다. 접착 성을 굳게하기 위해 롤링의 전환이 빠르게 G 단백질 결합 수용체의 신호에 응답하는 T 세포를 필요로합니다. 이 응답은 롤링 셀 3을 느리게하고 체포 인테 리간드 상호 작용을 얻을 수 있습니다. 인테 욕망의 즉각적인 변화는이 과정을 매개한다. 마이그레이션은 &#39;프론트 엔드&#39;에서 유착의 형성과 &#39;후부&#39;에서 유착의 파손 동적 상호 작용의 betweenTcells과 내피 세포가 필요합니다성형 및 4를 깨는 사이의 분 정도의 간격으로. IS는 inminutes를 형성하지만, 시간 6에 그대로 유지해야합니다. 흥미롭게도, 하나의 접착 분자는 인테그린 회원 림프구 기능 관련 항원 (LFA) - 1,이 모든 과정 5 필수적이다. LFA-1가 면역 글로불린 수퍼 패밀리의 다양한 구성원과의 상호 작용을 통해 부착을 매개한다. LFA-1로 가장 높은 선호도가 가장 광범위하게 연구 리간드는 세포 간 접착 분자 (ICAM) -1입니다. 비 활성화 순환 림프구 따라서 세포 표면에 LFA-1 및 ICAM-1-코팅 된 표면에 부착 할 수없는 낮은 선호도를 표현한다. LFA-1 궁합 변수와 같은 G 단백질 결합 수용체 활성화, 사이토킨 자극 및 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 매개되는 신호와 같은 여러 시그널링 이벤트에 의해 조절된다. LFA-1은 세포 외 공간에 세포 내 활성을 전달의 결과 선호도가 높은 포름 티ICAM-1의 hrough의 상호 작용. 이 통로는 7 신호 내부 아웃이라고한다. 마찬가지로, 세포 외 공간에서 LFA-1을 통해 신호는 외부에서 신호라고합니다. 인사이드 - 아웃 및 신호 외부 -에 참여 폭포 신호 세포는 현재의 연구의 주요 초점이다. 작은 GTPase의 RAP1는 최근 그 TCR 내고 8 신호 사이토 카인의 공통 신호 내부 아웃의 핵심 구성 요소로 떠오르고있다. T 세포 접착이 지배적 부정적인 RAP1 9의 발현에 의해 차단되는 반면 인테 활성화에 RAP1의 중요한 역할은, RAP1의 과발현은 T 세포의 인테 의존 접착을 자극 발견에 의해 강조 표시됩니다. RAP1으로 인테 규제에 대한 우리의 이해의 이러한 발전은 체외 도구로 사용하여 수행되었다. 그 중 여기에 설명 된 정적 접착 분석이다. 이 방법의 전반적인 목표는 T를 연구하는 것입니다ICAM-1 코팅 표면에 세포 접착. 구체적으로는 객관적으로 측정하고 다른 조건에서 실시간으로 살아있는 세포에서의 카운터 리간드쪽으로 LFA-1 친화력을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 기술은 T 세포와 상호 작용하는 세포 표면을 모방하는 ICAM-1로 코팅 폴리스티렌 웰을 사용한다. 많은 전술 정적 T 세포 부착 분석법 실험적 복잡한되었습니다. 주로 T 세포에 필요한 이러한 분석은 방사성 레이블 T 세포 접착 용 기판 등의 세포 외 기질 (extracellular matrix)을 만들 배양 소 각막 세포를 이용, 또는 T 세포 접착 (10)을 촉진하기 위해 확장 된 기간 동안 비 생리적 인 T 세포 자극을 요구한다. 많은 다른 분석 시스템 (11)에서 이용되는 것처럼, 계측법 및 현미경 흐르게 비해 접착 배양 다음 T 세포를 정량화하는 형광 측정의 사용은 정량보다 민감하고 정확한 방법이다. 또한, 단일 세포 microscop인테그린 지역화 IC 분석은 형광 측정과 동일한 방식으로 광범위한 인구 기반 분석을 허용하지 않는다. 활성화 상태 별 LFA-1 항체가 상업적으로 사용할 수 있지만,이 항체는 여기에 설명 된 방법에 상대적으로 낮은 감도를 제공합니다. 대체 기술을 통해 가장 큰 장점은 단순하고 동시에 여러 실험 조건을 검사 할 수있는 기능입니다. 특정 응용 프로그램에 대해이 방법을 고려할 때, 하나는 T 세포가 부정적으로 선택한 갓 격리 및 형광 마커로 표시되어야 함을 고려한다.

<table><tbody><tr><td>플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 하이브리드</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>Fisher</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>광학 바닥이 있는 96웰 마이크로플레이트</td><td>Corning Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>재조합 ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>ADP4-050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 항체</td><td>Ancell</td><td>144-020</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS containing calcium and magnesium</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>말초 림프구</td><td>예: 마우스 또는 인간</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Open Gen 5 소프트웨어</td><td>BioTek</td><td>버전 2.01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>15 및 50 ml 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>352099, 352070</td><td></td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>T-75 배양 플라스크</td><td>Fisher</td><td>50-754-1366</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep T 세포 enricment kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr></tbody></table>

t 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T 림프구의 접착 염증과 항원 제시 세포와 면역 시냅스의 형성 사이트로 이동을 포함하여 다수의 T 세포 기능이 필요합니다. T 세포는 인테그린, 파트너 세포 나 세포 외 매트릭스에서 표적 분자와 상호 작용하는 막 횡단 단백질의 이종이 쌍으로 이루어지는 세포 접착 분자의 수준의 접착 성을 제어함으로써 조절 된 접착을 달성. 가장 눈에 띄는 T 세포 인테는 그 대상 세포 접착 분자 (ICAM) -1 소단위 αL 및 β2, 구성, 림프구 기능 관련 항원 (LFA) -1이다. 접착 성을 제어하는​​ T 세포의 능력은 각각의 인테그린의 궁합 상태를 조절하는 능력에서 유래. 인사이드 아웃 신호는 세포 내부 신호가 인테그린의 외부 도메인이 활성화 된 상태를 가정하는 원인이된다 과정에 대해 설명합니다. 이러한 복잡한 현상에 대한 우리의 지식의 대부분은 기계 론적 기반으로연구는 체외 모델 시스템의 단순화에서 수행. 여기에 설명 된 T 림프구 접착 분석은 T 세포가 정적 조건 하에서, 표적 분자에 부착 허용하고 점착성을 정량화하는 형광 플레이트 판독기를 이용하여 우수한 공구이다. 이 분석은 림프구에 작용 접착 자극 또는 억제 물질을 정의뿐만 아니라 관련된 시그널링 이벤트 특성화에 유용왔다. LFA-1에 여기에서 설명하지만 - ICAM-1 매개 접착; 이 분석은 용이하게 다른 접착제 상호 작용 (- 피브로넥틴 예 VLA-4)의 조사를 허용하도록 구성 될 수있다.

아래의 항-CD3 항체의 다양한 농도로 자극 일차 T 세포를 사용하여 접착 분석의 예이다. 그것은 씻지 않은 세포의 형광 (즉, 전체로드)를 알고 있으면 유용합니다. 비자극 세포는 대조군 역할을하고 PMA 처리 된 세포는 항-CD3 항체에 대한 양성 대조군 있습니다. 코팅되지 않은 우물에서 도금 세포는 ICAM-1에 대한 제어 역할을합니다. 비자극 세포의 비율은 10 % ~ 5 % 사이에있는 동안 전형적인 실험에서 부착 PMA 처리 된 세포의 비율은 50 ~ 40 % 사이이다. 세포 접착 성을 정량화하는 다른 방법은 비자극 세포의 이상 각 조건에서 형광 강도의 계산 배 증가입니다. 표 1은 CFSE의 형광 강도가 일차 T 세포 용해 항 CD3 항체의 상이한 투여로 자극 및 ICAM-1 코팅 된 웰에 도금 표지 나타낸다.도 1은 대표적인 IM을 도시유사한 실험의 나이. 세포는 부정적인 말초 혈액에서 선...

정적 점착 분석은 T 림프구 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 상호 작용 플레이트 판독기가 직렬 세척 다음 부착 세포의 수를 정량화하는 데 사용되는 반면, 부착 분자로 코팅 된 웰에 표지 된 T 세포를 주입함으로써 생성된다.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포 접착력을 정량화하는 것입니다. 이는 두 번째 단계에서 96-웰 마이크로플레이트를 접착 분자로 코팅함으로써 달성됩니다. 일차 인간 T 세포를 혈액에서 분리하고 CFSE로 표지합니다.다음으로, T 세포의 부착성에 영향을 주기 위해 처리물을 통해 T 세포를 자극합니다. 마지막 단계에서는 처리된 세포를 마이크로플레이트에 첨가하고 부착이 일어나도록 합니다. 최종적으로, 웰당 형광량을 측정하여 처리 조건별 부착 세포의 백분율을 결정할 수 있습니다.이 기술이 모델 및 anterium에 T-세포를 추가하는 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 T-세포와 erl 세포의 공동 배양이 필요하지 않다는 점입니다. 이 방법은 특정 약물이 림프구 부착에 어떤 영향을 미치는가와 같이 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 line foot 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 호중구와 같은 다른 maie 세포에도 적용될 수 있습니다.단계별 과정의 숙달이 어렵고 정밀한 기술이 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 접착 분자로 마이크로플레이트를 코팅하려면, 먼저 96웰 플레이트의 24개 웰을 50 µL의 세척액으로 세척합니다. 그 다음, 코팅하지 않은 대조군 웰을 제외한 각 웰에 50 µL의 코팅 용액을 넣고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 피펫 팁이 웰 바닥에 닿지 않도록 주의하며 코팅 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이후 50 µL의 세척액으로 웰을 다시 세척한 후, 웰당 50 µL의 접착 용액을 넣고 마이크로플레이트를 배양합니다.다시 37 °C에서 배양합니다. 1시간 후, 부착 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 50 µL의 세척 용액으로 웰을 한 번 더 세척합니다. T 세포를 분리하기 위해 먼저 전혈 1 mL당 50 µL의 인간 T 세포 농축 칵테일을 넣어 충분히 혼합한 후, 처리된 혈액을 상온에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 상온에서 50 mL 원심 분리관에 처리된 혈액 6 mL와 1% D-glucose가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 제거 PBS를 동일한 부피로 넣고 용액을 부드럽게 혼합합니다.그 다음, 새로운 50 milliliter 원심분리관에 15 milliliters의 lympho prep을 넣고, 희석된 혈액 샘플을 림프구 분리 배지 위에 조심스럽게 층을 이루도록 쌓습니다. 브레이크 설정을 해제한 상태에서 400 times G, 20 degrees Celsius 조건으로 20분간 원심분리하여 세포층을 분리합니다. 그 후, 새로운 파스퇴르 피펫을 사용하여 인터페이스에 있는 림프구 층이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다.새 페스처 피펫(paster pipette)을 사용하여 림프구 층을 새로운 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 림프구에 9 mL의 PBS를 추가한 다음, 피펫팅을 통해 세포를 현탁액 전체에 고르게 분산시킵니다. 세포를 원심 분리한 후, 펠렛을 배지에 다시 현탁합니다.그 다음 세포를 T 75 배양 플라스크에 분주합니다. 적절한 배양 기간 후 세포를 자극하기 위해 20 milliliters의 배양 배지를 넣습니다. 먼저, 2.4 times 10 to the six 개의 T 세포에 무혈청 배지를 첨가한 후, 37 degrees Celsius 인큐베이터에서 세포를 혈청 결핍 상태로 유지합니다.2시간 후, 세포를 원심 분리하여 가라앉히고 펠렛을 재현탁합니다. 1 mL의 PBS 내에서 상온의 암소 상태로 8분 동안 형광 마커로 세포를 표지한 후, 37 °C의 PBS 10 mL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 그 다음 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 펠렛을 미리 데워둔 접착 용액 1.2 mL에 재현탁합니다.코팅된 마이크로플레이트를 37 °C로 가온한 후, 세포를 1.5 mL 튜브 8개에 150 µL씩 분할하여 넣습니다. 양성 대조군으로 사용하기 위해 튜브 하나를 10 ng/mL의 PMA로 자극합니다. 세 개의 튜브는 자극 대조군, 세척하지 않은 로딩 대조군, 그리고 ICAM-1 코팅 대조군으로 사용하기 위해 처리하지 않은 상태로 둡니다. 나머지 네 개의 튜브는 서로 다른 농도의 anti-CD3 항체로 자극합니다.그다음, 자극된 세포 혼합물 중 웰당 1 × 10⁵ cells의 농도로 50 µL씩을 마이크로플레이트의 적절한 웰에 즉시 분주하고, 플레이트를 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 부착 세포의 백분율을 결정하려면, 먼저 각 웰을 150 µL의 따뜻한 부착 용액으로 세척합니다. 플레이트를 몇 초 동안 부드럽게 흔든 다음, 피펫 팁이 웰 바닥에 닿지 않도록 주의하며 각 웰에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.흡입할 때마다 피펫의 각도를 바꿔가며 세척 과정을 3회 반복하십시오. 그 다음 플레이트 리더의 전원을 켜고 작업 메뉴에서 플레이트 판독 소프트웨어를 실행하십시오. 'New'를 클릭하여 새로운 프로토콜을 설정하십시오.그런 다음 작업(actions) 메뉴에서 읽기(read) 옵션을 선택하십시오. 형광 강도(fluorescent intensity)를 클릭하고 확인을 누릅니다. 들뜸 파장은 485로, 방출 파장은 528로 입력하십시오.그런 다음 optic 옵션 메뉴에서 bottom을 선택하고 Okay를 클릭합니다. 이어서 actions 메뉴로 돌아가 온도를 37 °C로 설정하고 okay를 클릭합니다. 마지막으로 마이크로플레이트를 로드하고 run을 클릭합니다.결과를 스프레드시트로 내보낸 후, 수식을 사용하여 이 이미지들 내 부착 세포의 백분율을 계산하십시오. 다양한 농도의 anti CD three 항체로 자극한 일차 T 세포를 이용한 부착 분석 예시가 나와 있습니다. 자극하지 않은 세포는 음성 대조군으로 사용됩니다.PMA 처리 세포는 양성 대조군으로 사용됩니다. anti CD3 항체의 경우, 표는 CFSE의 상대적 형광 강도를 나타냅니다. 서로 다른 농도의 가용성 anti CD3 항체로 자극하여 IAM 1이 코팅된 웰에 분주한 표지된 일차 T 세포들을 분석하였습니다. 모든 조건에 대해, 3반복 웰의 평균 강도를 계산하고 이를 총 로딩 세포 수 대비 상대적 백분율로 변환할 수 있습니다.일반적인 실험에서 PMA 처리된 부착 세포의 비율은 40~50% 사이인 반면, 자극되지 않은 세포의 비율은 5~10% 사이입니다. 자극에 사용된 anti CD3 항체의 농도가 증가함에 따라 부착 세포의 비율이 증가한다는 점에 유의하십시오. 이 기술에 숙달되면 적절히 수행했을 때 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 형광 입력값을 결정하기 위해 세척하지 않은 웰의 형광을 측정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.데이터 분석에서의 임계값입니다. 이 영상을 시청한 후에는 정적 세포 부착을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인혈액 샘플을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복과 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을...

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

여기에서는 추정 세포 접착 분자의 고유 접착 특성을 특성화하기 위한 간단하고 빠른 방법을 제시합니다.  세포 접착 분자의 분비된 에피토프 태그가 붙은 엑토도메인(ectodomain)은 작고 균일한 기능화된 비드의 배양 배지에서 캡처됩니다.  그런 다음 이러한 beads를 간단한 bead aggregation assay에 즉시 사용할 수 있습니다.

상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

Integrin 긴장 다양 한 세포 기능에 중요 한 역할을 담당합니다. 통합 긴장 센서 integrin 긴장은 picoNewton (pN) 감도 보정와 서브 마이크론 해상도 몇 군데.

Integrin 긴장과 셀룰러 힘 통합 긴장 센서와 서브 마이크론 해상도 이미징

TGT 표면은 성장 인자 - 인테그린 누화를 연구하는 혁신적인 플랫폼입니다. 유연한 프로브 설계, 부착 리간드의 특이성, 자극 조건의 정밀한 조절은 EGFR-인테그린 인터플레이의 강력한 정량적 평가를 가능하게 한다. 결과는 EGFR을 '메카노-조직자' 튜닝 인테그린 역학으로 강조하여 초점 접착 어셈블리 및 세포 확산에 영향을 미칩니다.

성장 인자 매개 인테그린 역학 및 접착력을 정량화하기 위한 장력 게이지 테더 프로브

이 프로토콜은 인간 호중구에서 β2 인테그린 활성화를 억제하는 저분자 약물을 식별하기 위한 유세포 분석 기반의 고처리량 스크리닝 방법을 설명합니다.

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

조정 가능한 밀도를 가진 RGD 기능화된 avidin-biotin tethers를 사용하여 단일 이동 혈소판을 이미징하기 위한 자세한 프로토콜이 제공되어 혈소판이 avidin-biotin 결합을 파열하기에 충분한 힘을 생성한다는 것을 밝혔습니다.

RGD 기능성 Avidin-Biotin 테더를 사용한 혈소판 이동을 연구하기 위한 In vitro 분석

배우세요 정적 접착 분석법을 이용하여 T 림프구의 세포 접착을 정량화하는 방법을 익히세요. 형광 측정으로 치료 효과를 평가하고 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

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