바다 칠성 장어의 간 변태 동안 담즙의 퇴보를 시각화하는 새로운 방법 명확화 ( Petromyzon 스 marinus)

이 절차의 전반적인 목표는 변태기 C 램프레이(lamprey)의 담도 퇴행에 대한 전역적, 구조적 및 세포 분석을 위해 간 전체와 장과의 접합부를 투명화하는 것입니다. 이는 먼저 하이드로젤 단량체 용액에서 조직을 고정함으로써 수행됩니다.

다음으로, 고정된 조직과 함께 하이드로젤을 중합합니다. 그 후 고정된 조직의 세포막을 제거하면 조직이 투명해집니다. 마지막으로, 면역형광 염색을 수행하고 최종적으로 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 변태 중인 칠성장어의 담관 퇴행 과정 동안 발생하는 전반적인 구조적 및 세포적 변화를 보여줍니다.

이 방법은 중추신경계의 커넥톰이나, 본 연구의 경우 혈청점 변태 중의 담관 퇴화와 같이 생의학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 희귀 선천성 영아 질환은 혈청점 변태 중의 담관 퇴화와 유사한 특성을 공유하므로, 이 기술의 함의는 인간의 담관 질환 또는 담도 폐쇄증의 치료나 진단으로 확장될 수 있습니다. 저희는 nature의 뉴스 기사를 발견하고 실험실 회의에서 해당 절차를 시연하는 온라인 영상을 발표했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었으며, 이는 저희 실험실의 대학원생인 Ann Scott이 수행하였습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)와 인산 완충액(phosphate buffer 또는 pb)을 먼저 조제하였습니다.

흄 후드 내에서 증류수, 40% acrylamide 2% bis acrylamide 10X PBS, 16% paraformaldehyde, saponin, 그리고 ammonium per sulfate를 혼합하여 400 milliliters의 하이드로겔을 준비합니다. 4% SDS와 0.2 molar boric acid로 구성된 1 liter의 투명화 솔루션을 준비하고, 흄 후드 내에서 조직을 준비하기 위해 500 milliliters의 80% glycerol을 조제합니다. 15 milliliter 원심분리 튜브에 10 milliliters의 하이드로겔 단량체 솔루션을 분주합니다.

조직 샘플을 해부하고 각 하이드로젤 고정 튜브에 조직을 넣은 후 4 °C에서 2일 동안 보관합니다. 흄 후드 내에서 배양한 후, 5 µL의 temid를 첨가하여 고정된 조직을 중합합니다. 그 다음 잘 혼합하고 샘플을 상온에서 2~3시간 동안 배양합니다.

배양 후, 조직 샘플을 투명하게 만들기 위해 과잉 겔을 철저히 제거합니다. 각 샘플을 15 milliliters의 투명화 용액에 넣고 50 °C 및 70 RPMs에서 투명해질 때까지 수일 동안 배양합니다. 투명화 용액은 하루에 최소 한 번 교체하고 과잉 겔을 제거하십시오.

샘플을 37°C, 70 RPM 조건에서 0.1% Triton X 100이 포함된 0.1 M PB 15 mL에 넣고 하룻밤 동안 옮겨둡니다. 신선한 완충액으로 배양 과정을 두 번 더 반복합니다. 조직이 투명해지고 과잉 젤이 제거되면, 샘플을 PB Triton X 100에 희석한 1차 항체에 담그고 37°C, 70 RPM에서 이틀 동안 배양합니다. 배양이 끝난 후, 0.1% Triton X 100이 포함된 PB 15 mL를 사용하여 37°C, 70 RPM에서 하룻밤 동안 조직 샘플을 세척합니다.

마지막 세척 버퍼를 제거한 후 세척 과정을 3회 반복하고, 0.1% Trix 100 및 블로킹 혈청이 포함된 PB 내의 형광 2차 항체 용액을 첨가하여 37 °C, 70 RPM 조건의 암소에서 하루 동안 배양합니다. 37 °C, 70 RPM 조건에서 10 mL의 PB tritton X 100로 샘플을 3회 세척한 후, PBS로 하룻밤 동안 3회 세척을 수행합니다. 마지막으로 알루미늄 호일로 감싼 투명화된 조직을 80% glycerol에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.

공초점 현미경 이미징은 암실 또는 어두운 조명 아래에서 수행하지만, 본 영상에서는 시각적 확인을 위해 조명을 켜둔 상태입니다. 칠점장어의 변태 과정 중 HEPA 담도계에서는 여러 중요한 발달 사건이 일어나는데, 예를 들어 여기에서 보는 바와 같이 담관과 담낭이 세포 사멸을 거쳐 퇴화합니다. 수정된 투명화 방법을 사용하고 간세포 마커인 cytokeratin 19와 항-세포사멸 마커인 BCL two로 염색한 후, 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 손상되지 않은 간의 광학 절편 촬영을 수행하였습니다.

염색 결과, 퇴행성 과정이 변태 2단계에서 4단계 사이에 일어나는 것으로 나타났습니다. 상단 패널은 전단부이며, 하단 패널은 후단부입니다. 여기에 담관수(biliary tree)가 나타나 있으며, 간 내의 어두운 수지상 모양의 세포사멸 세포와 주변의 세관 및 도관들이 보입니다.

이 그림은 cytokeratin 19 및 BCL two 항체로 표지한 변태 2단계와 3단계 사이의 간 세 개의 공초점 Z 시리즈를 재구성한 3차원 이미지입니다. 담관 나무와 어두운 수지상 모양의 세포사멸 세포, 그리고 주변의 세관 및 도관들은 각각 흰색 및 검은색 화살표로 표시되어 있습니다. 여기에는 루멘 내에 담즙 방울이 포함된 변태 2단계와 3단계 사이 표본의 담관 공초점 광학 단면이 나타나 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 추가 영상 분석을 위해 전체 조직을 투명화하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

파라포름알데히드 및 폴리아크릴아미드 용액을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용 및 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.