Name: 바다 칠성 장어의 간 변태 동안 담즙의 퇴보를 시각화하는 새로운 방법 명확화 ( Petromyzon 스 marinus) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 바다 칠성 장어(Petromyzon marinus) 변태 동안 담즙 퇴화를 시각화하는 수정된 CLARITY 방법을. 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 활용하여 담관 시스템의 구조적 변화를 분석하고 인간 담도 폐쇄증 연구에 통찰을 제공합니다.

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저자는 해먼드 베이 생물 역, 그레이트 레이크스 과학 센터, 미국 지질 조사국 (US Geological Survey)의 기여를 인정합니다. 우리는 또한 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 그녀의 기술 지원을위한 미시간 주립 대학의 고급 현미경을위한 센터에서 박사 멜린다 프레임을 감사합니다. 이 연구는 YWCD 및 WML에 대호 어업위원회에서 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 솔루션 준비 <ol><li> 1 L 만들기 10X 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4의) : 26.2 g 인산 나트륨 (일 염기성), 115g의 인산 나트륨 (이염 기성) 및 87.66 g의 염화나트륨을 단다. 약 800 ml의 증류수에 용해 H 2 O, 산도를 조정하고, 증류수 H 2 O로 1 L에 볼륨을 가져 <ol><li> 1 L 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (산도 7.4) 제조 업체 : 100 ML 10X PBS를 가지고, 900 ㎖의 증류수 H 2 O를 추가 </li><li> 100 ㎖의 10 배 PBS를 타고, 1 ㎖ 트리톤 X-100을 추가하고, 증류수 H 2 O로 1 L까지의 볼륨을 가지고 : 1 L 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (산도 7.4) 0.1 % 트리톤 X-100을 </li></ol></li><li> 26.2 g 인산 나트륨 (염기)과 115g 인산 나트륨 (이염을) 무게 : 1 L 배의 0.1M 인산 버퍼 (PB, 산도 7.4)을 확인합니다. 약 800 ml의 증류수에 용해 H 2 O, 산도를 조정하고, 증류수 H 2 O로 1 L에 볼륨을 가져 <ol><li> 1 L 0.1 M 인산염 완충액 (pH 7.4) 제조 업체 : 타고 100 ㎖의 10 배의 PB,와 H 2 O를 증류수 900 ㎖에 추가 </li><li> 0.1 % 트리톤 X-100 1 L 0.1 M 인산염 완충액 (pH 7.4) 제조 업체 : 100 ㎖의 10 배의 PB를 타고, 1 ㎖ 트리톤 X-100을 추가하고, 증류수 H 2 O로 1 L까지의 볼륨을 일정하게 </li></ol></li><li> 400 ㎖의 하이드로 겔 단량체 용액 (4 % 아크릴 아미드, 0.25 % 비스 - 아크릴 아미드, 4 % 파라 포름 알데히드, 0.0075 %의 황산 암모늄, 0.1 M PBS에 0.​​0005 %의 사포닌을) 확인 : 0.3 g과 황산 암모늄 0.2 g 사포닌의 무게. 210 ㎖의 증류수 H 2 O를 추가, 40 ㎖의 40 % 아크릴, 10 ㎖ 2 % 비스 - 아크릴 아미드, 40 ㎖의 10 배 PBS (산도 7.4), 100 ml의 16 % 파라 포름 알데히드, 잘 섞는다. </li><li> (0.2 M 붕산 4 % SDS) 4 L 청산 솔루션을 만들기 : SDS G 49.464 g 붕산 160의 무게를 측정. 약 3.5 L 소주 H 2 O에 용해 NaOH로 pH가 8.5가되도록 조정하고, 4 L.에 볼륨을 가져 </li><li> 1 L 80 % 글리세롤 솔루션을 만들 : 800 ml의 글리세롤을 측정 200 ㎖의 증류수 H 2 O를 추가하고 잘 섞는다. </li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 각 15 ㎖의 원심 분리기 튜브 하이드로 겔 단량체 용액과 나누어지는 10 ㎖를 준비합니다. </li><li> 전체 조직을 해부하고 4 ℃에서 2 일간 하이드로 겔 해결 하이드로 겔 솔루션은 적어도 10 배 조직의 볼륨이 있는지 확인하십시오. </li><li> 흄 후드 (15 ML의 원심 분리기 튜브) 하이드로 겔 고정 된 조직을 가지고. </li><li> , TEMED 5 μl를 추가하여 하이드로 겔 고정 된 조직을 중합 잘 섞어, 2 ~ 3 시간 동안 실온에서 흄 후드에 앉아 보자. </li><li> 철저하게 초과 젤을 제거합니다. 주의 : 여분 겔 염색시 정산 과정과 항체의 침투를 방해 할 것이다. </li><li> 조직이 투명하게 될 때까지 몇 일 동안 70 rpm으로 50 ° C로 설정 인큐베이터 통에 솔루션을 취소 10 ㎖에 고정 된 조직을 품어. 적어도 하루에 한 번 청소 솔루션을 변경하고 청소 솔루션을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다. </li><li> 70 실온에서 0.1 % 트리톤 X-100 10 ㎖ 0.1 M PB에서 조직을 헹구오후 37 ° C에서 하룻밤. 이 과정을 3 번 반복하고 완충 용액을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다. </li><li> 2 일간 70 rpm으로 37 ° C에서 0.1 % 트리톤 X-100와 함께 PB의 기본 항체 솔루션 명확히 조직을 품어. 참고 : 전체 조직을 물속에 충분한 기본 항체 솔루션을합니다. </li><li> 밤새 70 rpm으로 37 ° C에서 0.1 % 트리톤 X-100과 10 ㎖의 PB의 조직을 씻어. 이 과정을 3 번 반복하고 완충 용액을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다. </li><li> 어두운 실내 나 어두운 곳에서 다음 단계를 수행합니다. 사진 표백을 방지하기 위해 호일로 샘플을 커버. </li><li> 0.1 % 트리톤 X-100와 PB의 형광 차 항체 용액 1 일 동안 70 rpm으로 37 ° C에서 차단 혈청 정화 된 조직을 품어. </li><li> 밤새 70 rpm으로 37 ° C에서 0.1 % 트리톤 X-100과 10 ㎖의 PB의 조직을 씻어. 이 과정을 3 번 반복하고 과잉 젤 F를 제거완충액을 변경할 때 티슈 롬. </li><li> 밤새 70 rpm으로 37 ° C에서 10 ㎖ PBS에서 조직을 씻어. 이 과정을 3 번 반복하고 완충 용액을 변경하는 경우 조직에서 과잉 젤을 제거합니다. </li><li> 70 rpm으로 37 ° C에서 하룻밤에 80 % 글리세롤에 명확히 조직을 품어. </li><li> 이전의 공 초점 현미경에 4 ° C에서 형광 스테인드 조직을 저장합니다. </li></ol>

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이 프로토콜은 나노 다공성 겔을 형성하기 위해 폴리 아크릴 아미드와 손상 조직을 가교 결합하고 광학 투명성 고분자 투과성을 달성하기 위해 조직의 세포막을 얻어 스트립 &quot;CLARITY&quot;(12)라고하는 새로운 방법에서 수정된다. &quot;CLARITY는&quot;장거리 투사와 신경계에있는 지역의 회로 배선의 손상 -​​ 조직 이미징을 할 수 있습니다. 이 새로운 방법은 변태 중에 바다 칠성 장어 간 담즙의 전체 시스템을 시각화 할 수있다. 그것은 높은 해상도 정보를 획득하고, 전체 시스템 또는 담즙 종래 임베딩 사용 및 방법을 구획 중추 신경계 같은 복잡한 시스템으로부터 글로벌 시각을 유지하기 위해 생물학 도전이다. 이 변경됨 CLARITY 방법은 레이저 빔이 일정한 레이저 스캐닝 confoca 저전력 형광 대물 (4X)를 사용 1~2밀리미터의 두께까지 그대로 바다 칠성 장어 유생 간을 관통 할 수 있도록L 현미경. 깊은 관통은 더 진보 된 다중 광자 공 초점 현미경을 사용하여 달성 될 수있...

바다 칠성 장어 세 가지 생활을 통해 개발 1,2 단계입니다. 애벌레 바다 칠성 장어 (L)의 저서 필터 피더로 굴에서 대부분의 시간을 보낸다. 외부 형태와 내부 장기 3 개편에 극적인 변화의 일곱 변성 단계를 거쳐, 그 결과 청소년 (JV)는 질량 100 회 이상 몸을 증가, 그들이 호스트 물고기의 혈액과 조직 유체에 공급되는 동안의 기생 단계를 입력 . 바다 나 큰 호수에있는 호스트 물고기에 먹이 1.0-1.5 년 후, 성인은 이른 봄에 동안 수유를 중단하고 산란 하천으로 마이그레이션 한 후, 2 다이. 변형하는 동안, 바다 칠성 장어의 간은 담즙 방광 및 전체 담즙 나무, 인간의 유아 질환 담도 폐쇄증을 모방 진화 돌연변이 표현형을 잃는다. 유아 담도 폐쇄증은 4,5,6,7 심각한 의료 합병증이 드문 소아 간 질환입니다, 8,9,10 그러나 담도 폐쇄증의 발병 기전과 원인 4 대부분 알 수 있습니다. 외과 적 수술 (카사이 절차가) 5를 수행하지 않는 담도 폐쇄증 환자는 출생 후 2 년 이내에 사망합니다. 그 후,이 환자는 광범위한 임상 관리 및 자주 간 이식 6이 필요합니다. 담도 폐쇄증의 병인의 많은 이론은 바이러스 성 감염, 선천성 기형, 면역 질환, 독성 모욕으로 제안되었다. 그러나, 담도 폐쇄증의 발전에 각각의 기여는 7,8,9,10 결정적이 남아있다. 병적 인 담도 폐쇄증 고통을 유아는 달리, 바다 칠성 장어는 발달 광범위한 necroinflammation, 섬유증 또는 간경변 10 않고 담도 폐쇄증을 프로그램 받고있다. 동물이 과정 10시 과도 담즙을 경험하지만,이 발달 상태에 적응할 수있다를 통해 새로이 합성과 같은 간 11 담즙산 합성의 감소로 알려진 메커니즘뿐만 아니라 개발 담도 폐쇄증, 후 소장에서 담즙 소금의 분비. 바다 칠성 장어에서이 발달 과정은 담도 폐쇄증의 진행을 검토 할 수있는 유일한 알려져있는 기회를 제공합니다. &quot;CLARITY&quot;라는 새로 개발 된 방법은 광학적으로 투명한 나노 다공성 하이드로 겔 (12)로 그대로 조직을 변형하여 복잡한 포유 동물의 신경계에 높은 해상도의 영상을 가능하게합니다. 바다 칠성 장어의 간 및 수정 CLARITY 프로토콜을 사용하여, 담즙 변성 그대로 - 조직 영상은 간 변형을 통해 설명 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>40% 아크릴아미드&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% 비스-아크릴아미드&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>보릭 애</td>씨드 <td>시그마</td><td>B7901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>사포닌&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L337-500G</td><td></td></tr><tr><td>소듐 포스페이트 (단일성)</td><td>Sigma</td><td>04269-1KG</td><td></td></tr><tr><td>소듐 인산염 (이염성)</td><td>Sigma</td><td>S5136-1KG</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 펠릿&nbsp;</td><td>EMD</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브</td><td>어떤 브랜드</td><td></td><td></td>의</tr><tr><td>해부 도구든지;</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

바다 칠성 장어의 간 변태 동안 담즙의 퇴보를 시각화하는 새로운 방법 명확화 ( petromyzon 스 marinus)

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

담도 폐쇄증 대만에서 5000에있는보고 된 주파수 추정 1 15,000 미국 남동부에있는 주파수,하지만 동아시아 국가에서 일반적으로, 초기 단계의 희귀 질환이다. 많은 부분이 담도 폐쇄증의 관리에 대한 알려져 있지만, 그 기전은 아직 애매하다. 바다 칠성 장어 (Petromyzon의 스 marinus)는 담즙의 변성의 기전 및 진행 상황을 검사 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 유충, 기생, 성인 : 바다 칠성 장어는 세 개의 서로 다른 삶의 단계를 통해 개발. 유충에서 기생 청소년으로 전환하는 동안, 바다 칠성 장어는 외부 형태와 내부 장기의 극적인 개편과 개조와 변형을 받고있다. 간, 전체 담즙의 시스템은 담낭과 담도 나무를 포함하여, 손실됩니다. &quot;CLARITY&quot;라는 새로 개발 된 방법은 변성 바다 칠성 장어의 장과 전체 간 접합을 명확히하기 위해 수정되었습니다.담즙의 변성의 과정은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 시각과 바다 칠성 장어 변태시 식별되었다. 이 방법은 고유 한 동물 모델에서 담도 폐쇄증을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

몇 가지 중요한 발달 이벤트는 바다 칠성 장어 변태 동안 간담에서 발생합니다. 담관 및 담낭 세포 사멸과 퇴화 (그림 1)를 받고있다. 및 공 초점 현미경을 사용하여 항 세포 사멸 마커 Bcl2의 (cholangiocytes 및 간세포 이전과 변형 13 후 모두에 존재 CK19) 간 세포 마커 아세포 (19) 수정 된 설명 방법과 염색을 결합, 전체 담즙의 시스템은 Z 축 (함께 체포됐다 그림 2)와 3 차원 구조 (그림 3)을 재건했다. 레이저 스캐닝 공 초점 현미경은 담즙의 시스템의 대부분은 담관이 소장 들어가 접합 제외 간 내에 포함되기 때문에, 그대로 간 통해 광학적 부분을 수행하는 데 사용 하였다. 퇴행성 프로세스는 중앙의 큰 intrahep으로 주변의 작은 담즙 소관에서 시작, 변성 단계 2-4에서 발생이전 연구 (10)와 일치 ATIC 담관 (그림 2). ...

바다 칠성 장어는 변태 동안 담낭 및 담관, 인간의 담도 폐쇄증과 유사한 과정을 잃게됩니다. 새로운 고정 및 정화 방법 (CLARITY)은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 전체 담도 트리를 시각화하기 위해 수정되었다. 이 방법은 담즙의 변성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

바다 칠성 장어의 간 변태 동안 담즙의 퇴보를 시각화하는 새로운 방법 명확화 ( Petromyzon 스 marinus)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

이 절차의 전반적인 목표는 변태기 C 램프레이(lamprey)의 담도 퇴행에 대한 전역적, 구조적 및 세포 분석을 위해 간 전체와 장과의 접합부를 투명화하는 것입니다. 이는 먼저 하이드로젤 단량체 용액에서 조직을 고정함으로써 수행됩니다.다음으로, 고정된 조직과 함께 하이드로젤을 중합합니다. 그 후 고정된 조직의 세포막을 제거하면 조직이 투명해집니다. 마지막으로, 면역형광 염색을 수행하고 최종적으로 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 변태 중인 칠성장어의 담관 퇴행 과정 동안 발생하는 전반적인 구조적 및 세포적 변화를 보여줍니다.이 방법은 중추신경계의 커넥톰이나, 본 연구의 경우 혈청점 변태 중의 담관 퇴화와 같이 생의학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 희귀 선천성 영아 질환은 혈청점 변태 중의 담관 퇴화와 유사한 특성을 공유하므로, 이 기술의 함의는 인간의 담관 질환 또는 담도 폐쇄증의 치료나 진단으로 확장될 수 있습니다. 저희는 nature의 뉴스 기사를 발견하고 실험실 회의에서 해당 절차를 시연하는 온라인 영상을 발표했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었으며, 이는 저희 실험실의 대학원생인 Ann Scott이 수행하였습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)와 인산 완충액(phosphate buffer 또는 pb)을 먼저 조제하였습니다.흄 후드 내에서 증류수, 40% acrylamide 2% bis acrylamide 10X PBS, 16% paraformaldehyde, saponin, 그리고 ammonium per sulfate를 혼합하여 400 milliliters의 하이드로겔을 준비합니다. 4% SDS와 0.2 molar boric acid로 구성된 1 liter의 투명화 솔루션을 준비하고, 흄 후드 내에서 조직을 준비하기 위해 500 milliliters의 80% glycerol을 조제합니다. 15 milliliter 원심분리 튜브에 10 milliliters의 하이드로겔 단량체 솔루션을 분주합니다.조직 샘플을 해부하고 각 하이드로젤 고정 튜브에 조직을 넣은 후 4 °C에서 2일 동안 보관합니다. 흄 후드 내에서 배양한 후, 5 µL의 temid를 첨가하여 고정된 조직을 중합합니다. 그 다음 잘 혼합하고 샘플을 상온에서 2~3시간 동안 배양합니다.배양 후, 조직 샘플을 투명하게 만들기 위해 과잉 겔을 철저히 제거합니다. 각 샘플을 15 milliliters의 투명화 용액에 넣고 50 °C 및 70 RPMs에서 투명해질 때까지 수일 동안 배양합니다. 투명화 용액은 하루에 최소 한 번 교체하고 과잉 겔을 제거하십시오.샘플을 37°C, 70 RPM 조건에서 0.1% Triton X 100이 포함된 0.1 M PB 15 mL에 넣고 하룻밤 동안 옮겨둡니다. 신선한 완충액으로 배양 과정을 두 번 더 반복합니다. 조직이 투명해지고 과잉 젤이 제거되면, 샘플을 PB Triton X 100에 희석한 1차 항체에 담그고 37°C, 70 RPM에서 이틀 동안 배양합니다. 배양이 끝난 후, 0.1% Triton X 100이 포함된 PB 15 mL를 사용하여 37°C, 70 RPM에서 하룻밤 동안 조직 샘플을 세척합니다.마지막 세척 버퍼를 제거한 후 세척 과정을 3회 반복하고, 0.1% Trix 100 및 블로킹 혈청이 포함된 PB 내의 형광 2차 항체 용액을 첨가하여 37 °C, 70 RPM 조건의 암소에서 하루 동안 배양합니다. 37 °C, 70 RPM 조건에서 10 mL의 PB tritton X 100로 샘플을 3회 세척한 후, PBS로 하룻밤 동안 3회 세척을 수행합니다. 마지막으로 알루미늄 호일로 감싼 투명화된 조직을 80% glycerol에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.공초점 현미경 이미징은 암실 또는 어두운 조명 아래에서 수행하지만, 본 영상에서는 시각적 확인을 위해 조명을 켜둔 상태입니다. 칠점장어의 변태 과정 중 HEPA 담도계에서는 여러 중요한 발달 사건이 일어나는데, 예를 들어 여기에서 보는 바와 같이 담관과 담낭이 세포 사멸을 거쳐 퇴화합니다. 수정된 투명화 방법을 사용하고 간세포 마커인 cytokeratin 19와 항-세포사멸 마커인 BCL two로 염색한 후, 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 손상되지 않은 간의 광학 절편 촬영을 수행하였습니다.염색 결과, 퇴행성 과정이 변태 2단계에서 4단계 사이에 일어나는 것으로 나타났습니다. 상단 패널은 전단부이며, 하단 패널은 후단부입니다. 여기에 담관수(biliary tree)가 나타나 있으며, 간 내의 어두운 수지상 모양의 세포사멸 세포와 주변의 세관 및 도관들이 보입니다.이 그림은 cytokeratin 19 및 BCL two 항체로 표지한 변태 2단계와 3단계 사이의 간 세 개의 공초점 Z 시리즈를 재구성한 3차원 이미지입니다. 담관 나무와 어두운 수지상 모양의 세포사멸 세포, 그리고 주변의 세관 및 도관들은 각각 흰색 및 검은색 화살표로 표시되어 있습니다. 여기에는 루멘 내에 담즙 방울이 포함된 변태 2단계와 3단계 사이 표본의 담관 공초점 광학 단면이 나타나 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 추가 영상 분석을 위해 전체 조직을 투명화하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.파라포름알데히드 및 폴리아크릴아미드 용액을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용 및 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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배우세요 바다 칠성 장어(Petromyzon marinus) 변태 동안 담즙 퇴화를 시각화하는 수정된 CLARITY 방법을. 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 활용하여 담관 시스템의 구조적 변화를 분석하고 인간 담도 폐쇄증 연구에 통찰을 제공합니다.

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