2014년 6월 6일
바다 칠성 장어는 변태 동안 담낭 및 담관, 인간의 담도 폐쇄증과 유사한 과정을 잃게됩니다. 새로운 고정 및 정화 방법 (CLARITY)은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 전체 담도 트리를 시각화하기 위해 수정되었다. 이 방법은 담즙의 변성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 담즙 퇴행의 전반적, 구조적 및 세포 분석을 위해 전체 간과 장과의 접합부를 명확히 하는 것입니다. 변성 C lamprey에서. 이는 먼저 하이드로겔 단량체 용액에서 조직을 고정함으로써 수행됩니다.
다음으로, 하이드로겔은 고정 조직과 중합됩니다. 그런 다음 고정 된 조직의 원형질막이 제거되고 조직이 투명해집니다. 마지막으로, 면역형광 염색은 궁극적으로 레이저 스킨을 수행하며 컨포칼 현미경 검사는 변성 c Lampry에서 담즙 변성 동안 전반적인 구조 및 세포 변화를 보여주는 데 사용됩니다.
이 방법은 중추 신경계의 커넥톰(connectomes)과 같은 생물 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 우리의 경우 혈청점 변성 중 담도 변성(biliary degeneration)에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 인간 담즙 또는 폐쇄증의 치료 또는 진단으로 확장되는데, 그 이유는 이 희귀한 선천성 유아 질환이 혈청점 변성 중 구좌 퇴행과 유사한 특성을 공유하기 때문입니다. 우리는 네이처(Nature)에서 뉴스 기사를 발견하고 실험실 회의에서 텍스트 프로토콜에 따라 인산염 완충 식염수와 인산염 완충액 또는 pb를 만든 후 우리 실험실의 대학원생인 앤 스콧(Ann Scott)이 절차를 시연하는 온라인 비디오를 발표했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.
흄 후드에서 증류수, 아크릴아미드 40%, 아크릴아미드 2%, 비스 아크릴아미드 10XPBS, 파라폼 16%, 알데히드, 사포닌 및 황산염당 암모늄을 결합하여 400ml의 하이드로겔을 준비합니다. 4% SDS와 0.2 몰 붕산으로 구성된 투명화 용액 1리터를 준비하고 80% 글리세롤 500ml를 만들어 흄 후드의 조직을 준비합니다. Eloqua 10ml의 하이드로겔 단량체 용액을 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다.
조직 샘플을 해부하고 조직을 섭씨 4도의 하이드로겔 고정물의 각 튜브에 2일 동안 놓습니다. 흄 후드 아래에서 배양 후 5마이크로리터의 테미드를 첨가하여 고정 조직을 중합합니다. 그런 다음 잘 섞고 샘플을 실온에서 2-3시간 동안 배양합니다.
배양 후 여분의 젤을 철저히 제거하여 조직 샘플을 제거합니다. 각각 15ml의 세척 용액에 넣고 투명해질 때까지 섭씨 50도 및 70RPM에서 며칠 동안 배양합니다. 적어도 하루에 한 번 클리어링 용액을 교체하고 여분의 젤을 제거하십시오.
15 밀리리터의 0.1 몰 PB로 섭씨 37도 및 70 RPM에서 0.1 % Triton X 100으로 밤새 샘플을 옮깁니다. 새로운 버퍼로 배양을 두 번 더 반복합니다. 이제 조직이 투명해지고 과도한 겔이 제거되었으므로 PB tritton X 100의 1차 항체에 샘플을 담그고 배양 후 2일 동안 섭씨 37도 및 70RPM에서 배양하고 0.1% tritton X 100이 포함된 PB 15ml를 사용하여 조직 샘플을 섭씨 37도 및 70RPM에서 밤새 세척합니다.
최종 세척 완충액을 제거한 후 세척을 3회 반복하고 0.1%Trix 100 및 차단 세럼이 포함된 PB에 형광 2차 항체 용액을 첨가한 후 어둠 속에서 섭씨 37도, 70RPM으로 하루 동안 배양합니다. 섭씨 37도 및 70RPM에서 10밀리리터의 PB tritton X 100으로 샘플을 하룻밤 동안 세 번 세척한 후 PBS에서 밤새 세 번 세척합니다. 마지막으로, 정화된 조직을 호일로 덮인 80% 글리세롤로 하룻밤 동안 배양합니다.
그런 다음 컨포칼 현미경 이미징은 어둡거나 어두운 곳에서 수행되지만 이 비디오에서는 시각화를 위해 조명이 켜져 있습니다. 예를 들어, 여기에서 볼 수 있듯이 담관과 담낭은 세포사멸을 겪고 퇴화하는 동안 HEPA 담즙계에서 몇 가지 중요한 발달 사건이 발생합니다. 변형된 정화법을 사용하고 간 세포 마커 cytokeratin 19 anti anti apoptotic marker로 염색한 후 BCL 2 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 온전한 간을 통한 광학 절단을 수행했습니다.
염색 결과 퇴행성 과정이 변성 단계 2에서 4단계에서 발생한다는 것이 밝혀졌습니다. 상단 패널은 앞쪽에서 왔고 아래쪽 패널은 뒤쪽 끝에서 왔습니다. 여기에 보이는 것은 담즙 나무이고 여기에는 어두운 수상돌기처럼 보이는 세포사멸 세포와 간의 주변 운관 및 관 도구가 있습니다.
이 그림은 시토케라틴 19 및 BCL 2에 대한 항체로 표지된 변성 단계 2와 3 사이의 3개의 간으로 구성된 컨포칼 Z 시리즈를 재구성한 3차원 이미지를 나타내며, 담즙나무와 어두운 수상돌기처럼 보이는 세포사멸 세포와 주변 이관 및 관 도구는 각각 흰색과 검은색 화살표로 표시되어 있습니다. 여기에 보이는 것은 내강에 담즙 방울이 있는 변성 단계 2와 3 사이의 표본의 담관의 컨포칼 광학 단면입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 추가 이미징 분석을 위해 전체 조직을 정화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
파라폼, 알데히드 및 폴리 아크릴아미드 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑을 착용하고 흄 후드를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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이 연구는 변태 중 바다 램프리의 담낭과 담관의 상실을 조사하여 인간의 담도 폐쇄증과 비교합니다. 수정된 CLARITY 방법을 사용하여 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 담도 나무를 시각화하여 담도 퇴행에 대한 통찰력을 제공합니다.
Clarifying and visualizing biliary degeneration in sea lamprey using a modified CLARITY protocol enables high-resolution, three-dimensional analysis of tissue remodeling relevant to rare human diseases such as biliary atresia. This approach supports mechanistic de-risking and target validation in early discovery by providing a unique comparative model for hepatic and biliary system degeneration. The method enhances predictive confidence for translational research by enabling quantitative, reproducible imaging of complex tissue changes.
This modified CLARITY protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven imaging of tissue degeneration, supporting both mechanistic studies and translational biomarker research.