삼투 물 투수 계수 (P 측정 _F) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

다음 실험의 전반적인 목표는 식물 원형질체의 삼투압 투과성 계수(PF)를 결정하여 아쿠아포린의 기능에 대해 알아보는 것입니다. 축 방향 표피가 없는 잎에서 조각을 잘라내어 등장성 용액에 올려 놓습니다. 조각을 효소 용액에 옮기고 섭씨 28도에서 20분 동안 배양한 다음 새로운 등장성 용액으로 배양합니다.

다음으로, 팁이 잘린 용액을 함유한 프로토플라스트를 수집합니다. 두 번째 단계로 실험실을 준비합니다. 실리콘 그리스를 사용하여 슬라이드 바닥에 커버 슬립을 부착합니다.

그런 다음 챔버 바닥을 양전하를 띤 접착제로 코팅하고 챔버를 등장성 용액으로 채웁니다. 그런 다음 분리된 원형질체를 챔버에 추가하고 챔버를 현미경 스테이지에 섬세하게 배치합니다. 그 후, 원형질체는 저장성 용액에 노출되는 동안 부종 시간 경과를 포착하기 위해 비디오를 녹화합니다.

다음으로, 팽윤 시간 경과를 cur fitting 절차를 포함한 소프트웨어에 의해 수치적으로 분석하고, 예를 들어, 다른 아쿠아포린 유전자의 발현에 의해 유도된 PF의 차이를 나타내는 수치 분석 결과를 기반으로 각 protoplast의 PF를 결정한다. 이 방법은 아쿠아포린의 기능 조절과 같은 세포막 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 토착 또는 유전자 변형 식물 수생 식물의 투과성, matic water에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

또한 ide에 노출된 관심 출처와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에 필요한 등장성 및 고긴장 용액을 준비하고 삼투압을 확인하십시오. OSM oter를 사용하여 각 솔루션의 삼투압은 목표 값의 3% 이내여야 합니다.

10cm 페트리 접시에 등장성 용액 약 6방울을 채웁니다. ABBA 바다표범을 벗기거나 토끼 잎 표피를 내리고 껍질을 벗긴 잎을 약 4 x 4mm의 정사각형으로 자릅니다. 등장성 용액 위에 작은 조각을 놓고 노출 된 축 방향 면이 아래를 향하게하고 용액에 닿도록 떨어 뜨립니다.

다음으로, 1.5 밀리리터 튜브에 165 마이크로리터의 등장성 용액에 5.7 밀리그램의 효소 혼합물을 용해시키고 용해될 때까지 1분 정도 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 동일한 페트리 접시에 유사한 효소 용액을 여러 방울 떨어뜨립니다. 잎 조각을 효소 용액에 옮깁니다. 방울.

접시를 닫고 퍼필 한 라운드로 뚜껑을 밀봉합니다. 섭씨 28도로 설정된 수조에 접시를 20분 동안 띄웁니다. 20분 후, 집게를 사용하여 접시에 등장성 용액을 몇 방울 더 떨어뜨립니다.

각 잎 조각을 가장자리로 들어 올려 새로운 등장 용액 Drop으로 옮긴 다음 순차적으로 두 번째 방울로 옮깁니다. 두 번째 방울에서 잎 조각을 흔들어 100마이크로리터 피펫 팁을 잘라 원형체를 방출합니다. 프로토플라스트가 있는 방울을 1.5ml 튜브에 모읍니다.

한 컬럼에 등장성 용액을 채우고 다른 컬럼에 저장성 용액을 채워 풍성 시스템을 준비합니다. 밸브를 열어 약간의 저장성 용액이 흐르도록 하여 튜브를 입구 매니폴드까지 채웁니다. 갇힌 기포가 없는지 확인한 후 밸브를 닫으십시오.

등장성 용액에 대해 반복합니다. 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하여 플렉시 유리 슬라이드 내의 챔버 바닥을 만들고 챔버 바닥을 프로토플라스트에 대해 끈적하게 만들고 프로타민 설페이트 또는 폴리 L 라이신이 함유된 양전하로 코팅합니다. 피펫 팁을 사용하여 이 접착제를 커버 슬립에 펴 바릅니다.

1-2분 정도 기다립니다. 등장성 용액으로 3-4회 헹구고 남은 용액을 털어냅니다. 등장성 용액으로 챔버를 채웁니다.

그런 다음 잘라낸 피펫 팁을 사용하여 용액이 포함된 프로토플라스트 한 방울을 챔버에 추가합니다. 그리고 원형질체가 가라앉을 때까지 3-4분 정도 기다립니다. 용액 표면에 닿는 투명 덮개로 챔버를 덮습니다.

아래에 기포가 갇히지 않도록 하십시오. 도립 현미경 테이블 위에 슬라이드를 부드럽게 놓고 관류 시스템과 튜브의 기포를 보호하는 펌프에 연결합니다. 분당 1밀리리터로 일정한 관류를 위해 등장성 용액 흐름을 켭니다.

볼륨 변화를 기록하려면 가능한 한 많은 구형 셀이 있고 가장 큰 둘레에 초점이 잘 잡힌 셀 윤곽이 있는 보기 필드를 선택합니다. 선택된 움직이지 않는 원형질체의 62번째 비디오를 초당 1개 이미지 또는 1헤르츠의 속도로 녹화합니다. 등장계 용액을 15초 동안 세척하는 것으로 녹음을 시작하고 45초 동안 긴장성 용액으로 전환합니다.

Tiff 형식으로 동영상 저장팽창 세포의 일련의 이미지를 분석하려면 이미지 J 소프트웨어에서 이미지 탐색기 및 프로토플라스트 분석기 플러그인을 사용합니다. 이미지를 시작 J.To 동영상을 열고 이미지 J 패널에서 파일을 클릭한 다음 가져오기를 펼칠 때 드롭다운 메뉴를 연속적으로 클릭합니다. 그런 다음 이미지 탐색기.

선택한 동영상을 강조 표시합니다. 그것을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 왼쪽. protoplasts 분석기를 클릭합니다.

첫 번째 이미지에서 마우스를 사용하여 선택한 원형질체 주위에 원을 그립니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. protoplasts 감지 알고리즘을 시작하는 것으로 보이는 검출 매개변수 표에서 protoplasts 이미지의 상단 패널에 있는 local을 클릭합니다.

그런 다음 처리합니다. 드롭다운 메뉴에서 동영상 전체에서 선택한 원형질체 주위의 녹색 원을 검사합니다. 하단 슬라이더를 사용하여 결과를 Excel 파일에 저장합니다.

분석은 프레임 단위로 수행됩니다. 따라서 셀이 두 개 이상인 경우 Here의 각 셀에 속하는 선을 분리하기 위해 정렬이 필요합니다. 세 가지 시간 코스는 픽셀에서 제곱 마이크로미터로 변환된 면적 값으로 정렬하기 전과 후에 Excel 시트에 표시됩니다.

그런 다음 각 시간 코스를 별도의 텍스트 파일로 내보냅니다. 이 절차를 시작하려면 챔버를 관류 시스템과 펌프에 연결하고 분당 1밀리리터의 일정한 관류 속도로 표시기 다이 흐름을 켜고 1헤르츠의 속도로 62번째 비디오를 녹화합니다. 15초 동안 표시기 다이로 녹음을 시작한 다음 하이퍼토닉 솔루션으로 전환하십시오.45초 동안 녹음을 중지합니다.

표시기와 같은 높이입니다. 다시 30초 이상 죽습니다. 새로운 영화를 시작하기 전에 기록을 하고 영화를 분석하기 위해 5-6개의 영화를 저장하십시오.

변화 인디케이터 다이 투과율의 평균 시간 경과를 얻으려면 이미지 J 클릭 파일을 시작하십시오. 그런 다음 영화를 열고 찾습니다. 각 동영상에 대해 동영상의 첫 번째 이미지 아무 곳에나 10픽셀 너비의 세로 사각형을 그리고 이미지 J 기본 패널에서 이미지를 클릭합니다.

그런 다음 드롭다운 메뉴에서 자르기를 클릭합니다. 60개의 프레임을 한 행에 정렬하려면 이미지를 클릭한 다음 드롭다운 메뉴에서 스택을 펼치고 몽타주를 만들 때 연속적으로 클릭합니다. 이미지의 전체 행을 따라 아무 곳에나 1픽셀 높이의 수평 사각형을 그리고 Image J 기본 패널에서 분석을 클릭합니다.

그런 다음 플롯 프로파일을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 투과율 데이터 목록을 Excel 파일에 복사합니다. 지표 다이 플러시의 Sero 영화에서 얻은 투과율 시간 코스의 평균을 구합니다.

이미지 일련 번호에 0.1을 곱하여 실시간 베이스를 생성합니다. 평균 시간 코스를 텍스트 파일에 저장하여 삼투압 시간 코스의 다양한 매개변수를 계산합니다. 사용 가능한 MATLAB 피팅 프로그램 PF fit을 사용합니다.

무료입니다. 이 프로그램의 다운로드 및 사용에 대한 자세한 내용은 프로토콜 텍스트에서 확인할 수 있습니다. 표시기 맞춤 패널에서.

지표 염료 투과율의 평균 시간 경과 데이터를 가져옵니다. 현재 실험 매개 변수를 수동으로 입력하면 개미 H로 매개 변수의 초기 추측을 입력합니다.지표 염료 농도의 시간 경과를 설명하는 것도 변경 될 수 있습니다. 실행을 클릭하여 시간 경과, 지표, DAI 농도 및 모델링된 수조 삼투압의 플롯을 봅니다.

물에 대한 좋은 적합은 물 투과 계수를 결정하는 데 필수적입니다. 볼륨 맞춤 패널로 전환합니다. 영역의 데이터 파일을 가져오려면 선택합니다.

마지막 지표 피팅을 매개변수 소스로 선택합니다. 모델 클래스를 선택합니다. 두 가지로 시작하십시오.

PF 매개 변수 pf 느린 PF 및 지연은 예를 들어 그림과 같이 초기화해야 하지만 다른 값도 가능합니다. Mark는 세 가지 매개변수가 모두 적합한지 확인합니다. 실행을 클릭합니다.

그런 다음 중간 수치를 주시하고 필요한 경우 지연 매개변수와 레코드의 길이를 조정합니다. 결과 그래프를 검토하여 피팅, 품질을 평가하고 피팅 오차를 기록합니다. 초기화 매개 변수를 각각 몇 배씩 변경하고 다시 실행하십시오.

물 투과성 계수 또는 pf를 결정하기 위해 가장 낮은 맞춤 오차 값을 목표로 초기화 매개변수의 다양한 조합으로 시작하여 이 절차를 여러 번 반복하고, 토끼 opsys 잎의 다른 아쿠아포린 메실 원형질체의 활성을 비교하고, 토끼의 아쿠아포린 유전자를 가진 3개의 유전자 구조로 분리 및 별도로 형질전환했습니다. OPSYS 및 MAZE. 원형질체는 강화된 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 벡터로 co-ran에 의해 표지되었습니다. 저장성 챌린지에 노출되었을 때 세포 부피 변화의 시간 경과를 각 세포에 대해 구하고, 저장성 챌린지 동안 목욕 삼투압 변화의 시간 경과를 얻었으며, 각 세포에 대한 PF 값을 도출했습니다.

PF FIT 프로그램을 사용하여 3개의 아쿠아포린 각각으로 형질전환된 프로토플라스트의 PF 값이 GFP 단독으로 형질전환된 대조 세포의 PF보다 유의하게 높은 것을 관찰했습니다. 이 기술을 완전히 익히면 제대로 수행되면 며칠 안에 수십 개의 세포를 분석할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 하이토닉 분석을 받은 분리된 프로토플라스트 또는 다른 초점 세포에서 SMO 투수성을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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