마우스에있는 자기 공명 현미경 영상으로 실험자가 면역 심근염에있는 심장의 이상 유무 비 침습적 평가

이 절차의 전반적인 목표는 염증성 심장 질환에 걸린 살아있는 동물의 심장을 영상화하여 심장 기능 이상을 확인하는 것입니다. 이는 우선 심근염과 같은 질병을 유도함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 동물 모델을 자기공명현미경 영상 촬영에 맞게 준비하고 동물 홀더에 배치하는 것입니다.

다음으로, 심장 영상을 획득하기 위해 마우스를 자석 내부에 배치합니다. 마지막 단계는 segment 소프트웨어를 사용하여 심장 기능 파라미터를 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 이 기술은 자가면역성 심근염이 유발된 마우스의 이완기말 용적과 박출률을 계산하는 데 사용됩니다.

조직병리학과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 비침습적이며 심장의 3차원 고해상도 뷰를 제공한다는 점입니다. 이 방법은 염증성 심장 질환의 진단과 관련된 심장학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 자기공명 미세영상 획득을 위한 동물 준비 과정이 생소하여 어려움을 겪을 수 있습니다.

따라서 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 프로토콜을 시작하기 위해 먼저 자가면역성 심근염을 유도하기 위한 펩타이드 용액을 준비하십시오. cardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 to 3 52를 인산염 완충 식염수에 녹여 최종 농도가 2 mg/1.5 mL가 되도록 합니다. 다음으로, 50 µg의 동결건조된 pertussis toxin이 들어 있는 바이알에 멸균된 1x 인산염 완충 식염수 1 mL를 첨가하여 pertussis toxin을 준비하십시오.

50 ng/µL의 스톡 농도를 확보하십시오. 그런 다음 스톡 20 µL를 멸균된 1.5 mL 튜브에 취하고 멸균된 1x phosphate buffered saline 980 µL를 첨가하여 1 ng/µL의 작동 농도를 맞추십시오. 또한, mycobacterial tuberculosis H 37 RV 또는 MTB 추출물 40 mg을 CFA 10 mL에 첨가하여 최종 농도가 5 mg/mL가 되도록 완전 프론스 보조제(complete frons adjuvant) 또는 CFA를 준비하십시오.

이제 펩타이드 CFA 에멀션을 준비합니다. 1.5 mL의 에멀션 분주액을 만들기 위해, 1.5 mL 튜브 하나에 750 µL의 cardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 to 3 52 펩타이드 용액을 넣고, 다른 1.5 mL 튜브에 MTB 추출물이 보충된 CFA를 동일한 부피로 분주합니다. 그 다음 3 mL 루어 락(lure lock) 주사기를 사용하여 펩타이드 용액을 먼저 흡입하고, 이어서 CFA-MTB 추출물을 흡입합니다. 주사기를 3방향 콕(three-way stop cock)에 부착하고, 콕의 다른 배출구를 빈 3 mL 주사기에 연결합니다.

스톱콕의 개방도를 조절하십시오. 펩타이드-CFA 혼합물이 적절한 저항을 유지하며 한 주사기에서 다른 주사기로 흐르도록 합니다. 약 1분 동안 내용을 한 주사기에서 다른 주사기로 반복해서 밀어 넣어 혼합한 다음, 전체 어셈블리를 얼음 위에 약 3분 동안 둡니다.

이 절차를 최소 10회 반복하십시오. 100 milliliter 유리 비커의 정지된 물 위에 아주 작은 방울을 조심스럽게 떨어뜨려 에멀션의 일관성을 확인하십시오. 방울이 물속에서 분산되지 않아야 하며, 그렇지 않을 경우 원하는 일관성이 확보될 때까지 계속 혼합하십시오.

3 mL 주사기에 들어 있는 에멀젼 내용을 1 mL 루어락(Lure lock) 주사기로 옮깁니다. 스톱콕에 연결된 두 개의 3 mL 주사기 중 하나를 1 mL 주사기로 교체한 다음, 27.5 게이지 바늘을 연결합니다.

6~8주령의 암컷 aj. 마우스의 양쪽 서혜부 두 곳에 펩타이드 CFA 에멀젼 150 µL를 분할하여 피하 주사합니다. 그 후 면역 후 0일째와 2일째에 각 동물에게 백일해 독소 현탁액 100 µL를 복강 내 투여합니다. 7일째에 펩타이드 CFA 에멀젼 150 µL를 흉골 양측에 분할하여 피하 주사함으로써 면역 절차를 반복합니다.

설명된 대로 이 에멀젼을 신선하게 준비하십시오. 그런 다음 21일 차에 동물들을 MRM 영상 촬영에 처치합니다. 영상 촬영 준비를 위해, 먼저 각 마우스를 온도를 유지하기 위한 가열 패드가 있는 2% ISO fluorine 공기 혼합물이 포함된 마취 유도 챔버에 넣으십시오.

그 다음 동물을 특수하게 설계된 동물 홀더로 옮깁니다. 바이트 바(bite bar)로 머리를 고정하여 동물을 복와위(prone position) 상태로 움직이지 않게 합니다. 마취 상태를 유지하기 위해 주둥이가 노즈 콘(nose cone)에 맞게 위치해야 합니다.

실험 중 동물의 체온을 유지하기 위해 스캐너의 수직 보드에 배출 호스를 삽입한 상태에서 에어 블로우 히터를 켭니다. 전체 영상 촬영 세션 동안 2 mL/min의 유량으로 1~2% isof fluorine을 사용하여 마취 상태를 유지합니다. 발가락 꼬집기 테스트를 통해 마취 상태를 확인합니다.

다음으로, 영상 촬영 세션 전반에 걸쳐 호흡과 체온을 모니터링하기 위해 공압식 필로우 센서와 직장 온도 프로브를 설치합니다. 섬유 광학 펄스 옥시미터 센서를 왼쪽 발목에 부착하고, 실 루프로 발을 고정한 뒤 테이프로 붙여 위치를 유지합니다. 영상 촬영은 조영제를 사용하지 않고 호흡 및 심장 신호를 게이팅하여 수행합니다.

고해상도 3차원 자기공명현미경 영상을 얻기 위해서는 광경통 9.4 Tesla 수직 보어 마그넷을 사용해야 합니다. 동물 준비를 마친 후, 심장이 시야 중심에 위치하도록 마우스를 스캐너에 배치합니다. 그런 다음 이미징 인터페이스를 실행하고 커맨드 바에서 새로운 연구 유형 메뉴를 선택하여 튜닝 페이지를 띄운 후, 시작 프로브, 튜닝 및 자동 스케일을 선택합니다.

코일 끝에 있는 원격 튜닝 및 매칭 노브를 사용하여 RF 코일을 400 megahertz의 양성자 공명 주파수에 맞게 튜닝하십시오. 다음으로, 프리스캔 페이지로 이동하십시오. 주파수 및 전력 보정을 실행하려면 x, Y, Z 퀵 버튼을 눌러 시밍 페이지를 띄우십시오.

그 다음 모든 반복 횟수를 선택하고 자동 시밍(auto shimming)을 수행합니다. 스카우트 시퀀스(scout sequence)를 선택합니다. 시야(field of view)를 35 millimeters로 변경합니다.

다른 기본 설정은 그대로 유지하고 시퀀스를 실행합니다. 심장이 시야 중심에 있지 않은 경우, 동물 홀더의 위치를 조정하고 RF 코일을 다시 튜닝한 후 스카우트 영상을 다시 획득합니다. 그 다음 gem 시퀀스를 선택합니다.

심장의 단축 및 장축을 따라 두 개의 직교 평면을 얻기 위해 여기의 획득(acquire) 탭에 표시된 획득 파라미터를 입력하십시오. 다음으로, 펄스 옥시미터 게이지 단축 시네 영상을 수집하기 위해 시네 시퀀스를 선택하고 좌심실의 해부학적 및 기능적 파라미터를 측정하십시오. 그라디언트 에코 시네 시퀀스를 얻으려면 여기에 표시된 파라미터를 입력하십시오.

심장의 장축 뷰를 바탕으로 영상 슬라이스의 위치와 각도를 조정합니다. 그런 다음 시퀀스를 실행합니다. 영상 촬영이 완료되면.

IO 탭을 사용하여 획득한 이미지를 DICOM 형식으로 변환하고, 해당 파일들을 처리를 위해 데이터 센터로 전송하십시오. 영상 촬영 절차가 끝난 후, 동물은 필터 톱 케이지 내에서 마취로부터 회복되도록 합니다. 마우스가 흉곽 기립 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분히 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.

여기서는 segment 소프트웨어를 사용하여 좌심실의 해부학적 및 기능적 파라미터를 분석합니다. 먼저 DICOM 형식의 cine 영상을 소프트웨어로 불러옵니다. 그런 다음 영상 기법으로 MRGE를, 영상 유형으로 cine를, 그리고 short axis mid ventricular를 선택합니다.

영상 뷰 평면에서, 편집 메뉴의 '현재 타임프레임을 이완기 말로 설정' 및 '현재 타임프레임을 수축기 말로 설정' 하위 메뉴를 각각 사용하여 이완기 말과 수축기 말에 사용할 타임프레임을 지정하십시오. 다음으로, 우측 하단 패널에서 LV 버튼을 누른 후 endo 및 EPI 명령 버튼을 사용하십시오. 좌심실, 심내막 및 심외막을 각각 수동으로 그릴 때, 해당 명령 버튼을 눌러 유두근을 제거하십시오.

계산의 정확도를 높이기 위해, 우측 상단 패널에서 이완기 체적, 수축기 체적, 박출량 및 박출률과 같이 정량화된 좌심실 파라미터를 읽으십시오. 그런 다음 mis 명령 버튼과 측정 캘리퍼 명령 버튼을 사용하여 벽 두께 및 심실 직경과 같은 좌심실 파라미터를 측정하십시오. 마지막으로, 필요에 따라 이미지를 재처리할 수 있도록 세그멘테이션이 포함된 이미지를 dot mat 형식으로 저장하는 'save both image stacks and segmentation' 옵션을 사용하여 저장하십시오.

두 개의 챔버 뷰 영상을 획득하기 위해 심장을 절단한 각도를 여기서 확인할 수 있습니다. 여기에서 실험적 자가면역성 심근염에 걸린 쥐는 건강한 쥐에 비해 좌심실 두께가 약 1.5배 증가하여 심장의 구조적 결함이 있음을 알 수 있습니다. 좌심실 및 이완기 용량과 박출률을 기반으로 측정한 심박출량은 건강한 쥐에 비해 자가면역성 심근염에 걸린 쥐에서 감소하였습니다.

마지막으로, 위 처리군에서 얻은 심장을 hematoxylin, eosin 염색을 통해 염증 여부를 평가하였습니다. 건강한 생쥐가 아닌 심근염 유도 생쥐의 심장을 조직학적으로 평가한 결과, 다초점 림프구 침윤이 관찰되었습니다. 이 절차를 수행할 때는 실험 중에 심박수와 호흡수가 크게 변하지 않도록 동물의 체온을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 이는 재현성 있는 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다.

이 영상을 시청한 후에는 마우스와 같은 심근염 등의 염증성 심장 질환의 기능적 이상을 평가하기 위한 자기공명현미경 기술에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 하지만 고자기장 환경에서 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 동물 홀더 및 기타 구성 요소는 반드시 비자성체여야 함을 잊지 마십시오.