실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 전이의 소행성 중피 세포 공동 배양 모델에서 난소암 세포의 침입을 실시간으로 신속하게 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 메틸 셀룰로오스에서 비부착 조건에서 세포를 배양하여 세포주에서 난소암을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 복막강의 중피와 중피 내막 자체의 기저막을 모방하기 위해 마트리겔로 챔버가 있는 두 챔버의 상부 챔버를 코딩하여 실시간 세포 분석기인 CIM 플레이트를 준비하는 것입니다.

다음으로, 난소암 스테로이드를 수확하여 실시간 분석기 플레이트 웰의 상부 챔버에 첨가합니다. 마지막 단계는 실시간 세포 분석기를 프로그래밍하고 시작하는 것으로, 장기간에 걸쳐 사전 정의된 간격으로 주기적으로 판독합니다. 궁극적으로 얻어진 결과는 난소암 세포가 세포 및 기질 장벽을 침범할 때 조절하는 핵심 요인을 결정하는 데 사용되는 지속적인 침입 과정을 묘사합니다.

암세포 침입에 대한 표준 트랜스월드 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 접근 방식을 통해 장기간에 걸쳐 암세포 침입을 지속적으로 측정할 수 있다는 것입니다. 난소암 전이의 동적 특성을 완전히 포착하지 못하는 단일 종점 분석과 달리, 이 방법은 난소암에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용되지만 유방암 또는 내피층을 통한 암세포와 같은 다양한 유형의 전이 과정을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 마찬가지로, 배아 착상 중 영양막 침입과 같은 정상 세포 침입을 연구하여 형광 세포 표지를 위해 난소암 세포를 준비하는 데 사용할 수 있습니다.

첫 번째 수확 세포는 75%co fluency 및 resus suspend cells in 1 millilit per millilit of prewarm PBS per 0.1%BSA 웰당 최적의 스테로이드 양을 추가하고 스테로이드를 조심스럽게 취급하는 것이 이 절차의 성공에 매우 중요합니다. 다음으로, 10 마이크로 몰의 최종 농도로 세포에 5 밀리 몰의 세포 미량 CSFE 용액 2 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 37도에서 10-15 분 동안 배양하고 수조에서 10 % FBS를 함유 한 1 밀리리터의 얼음 차가운 매체로 반응을 끄고 원심 분리로 펠렛을 다시 만듭니다. 레우스. 적절한 예열 성장 배지 10ml를 넣고 시드 세포를 섭씨 37도에서 75제곱센티미터 필터로 덮인 플라스크 배양액에 넣고 형광 표지 수준이 검출에 적합할 때까지 5% 이산화탄소

각 세포주에 적합한 배양 배지의 부피(15ml에서 sphe 생성에 필요한 세포 부피)를 측정하여 이 절차를 시작합니다. 배양 배지에 3ml의 메틸 셀룰로오스 원액을 첨가하여 최종 메틸 셀룰로오스 농도 20%를 달성하고 부드러운 반전으로 완전히 혼합합니다. 메틸셀룰로오스 함유 매체에 300, 000의 세포를 추가하고 온화한 반전 피펫에 의해 96 잘 오목한 바닥 문화 판의 각 우물로 세포 메틸셀룰로오스 매체 혼합물의 150 마이크로리터에 의해 철저히 섞으십시오.

그 결과 섭씨 37도에서 웰 배양당 총 3000개의 세포가 생성되며, 1일에서 4일 동안 또는 균일한 PHE가 형성될 때까지 5%의 이산화탄소가 생성됩니다. 일반적으로 웰당 하나의 스테로이드가 관찰되며, 실시간 세포 분석기 또는 RTCA 세포 침입 분석은 16웰 RTCA 2개의 챔버 CIM 플레이트를 사용합니다. 한 번에 4개의 웰 그룹으로 작업하면서 플레이트의 상부 챔버의 각 웰에 50마이크로리터의 매트릭스를 추가하여 전체 표면적이 덮이도록 합니다.

30마이크로리터의 매트릭스를 즉시 천천히 제거하여 과도한 액체를 제거하십시오. 조직 배양 인큐베이터에서 사용하기 전에 섭씨 37도에서 플레이트를 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 각 암 세포주에 적합한 무혈청 배지 30마이크로리터를 상부 챔버에 추가하고 혈청이 있거나 없는 배지 160마이크로리터를 추가합니다.

하부 챔버에 대한 실험 설계에 따라 하부 챔버를 클릭하여 CIM 플레이트를 상부 챔버로 조립하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 평형을 이룹니다. 조직 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 RTCA 프로그램을 열고 레이아웃 탭을 선택합니다. 모든 실험용 wells를 강조 표시하고 wells를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 well 켜기를 선택합니다.

그런 다음 실험 조건을 입력하고 원하는 대로 이름을 판매합니다. 프로그램에 단계 또는 하위 단계를 추가하려면 일정 탭을 선택하고 단계 추가를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 첫 번째 단계는 사전 프로그래밍된 배경 스윕으로, 프로그램에 자동으로 통합됩니다.

단계 추가가 선택되면 LP 9 인간 중피 세포 단층을 설정하는 동안 판독값을 기록하는 RTCA 프로그램의 2단계에 대해 원하는 프로그램 세부 정보를 입력합니다. interval 탭을 선택하고 15분을 입력하여 임피던스 판독값 사이의 시간 간격을 추가합니다. 기간 탭을 선택하고 12시간에서 24시간 사이의 시간을 입력하여 실험 기간을 추가합니다.

후속 단계도 같은 방식으로 추가됩니다. RTCA 프로그램의 3단계는 frid invasion 동안 기기가 판독값을 취하도록 지시합니다. 간격 탭 아래에 5분을 입력하고 기간 탭 아래에 48시간을 입력합니다.

메뉴 표시줄에서 플레이트를 선택하고 저장합니다. 이 절차를 시작하려면 CIM 플레이트를 RTCA 기기에 놓고 이전에 저장한 프로그램을 엽니다. 메뉴 모음에서 실행을 선택하면 배경 스윕이 자동으로 수행됩니다.

배경 청소에 이어, 기구에서 CIM 판을 제거하고 조직 배양 두건 판에 있는 두십시오. 50, 000 LP 9개의 세포는 각 CIM 판의 상부 약실로 혈청 자유로운 매체의 160 마이크로리터에서 중단합니다. 플레이트를 RTCA 기기에 잘 놓고 LP nine 단층이 다음 날 밤새 형성되는 동안 15분마다 판독값을 취하고, 1ml 피펫 팁 상단에서 1mm를 무균 처리하여 각 세포주에 대한 각 well의 내용물을 부드럽게 회수하는 데 사용합니다.

멸균 튜브 원심 분리기에 10 스테로이드를 넣으십시오. 스테로이드를 120GS에서 8분 동안 투여한 후 부드러운 흡인으로 배지를 함유한 메틸셀룰로오스를 제거합니다. 각 세척 후에 스테로이드를 펠릿으로 만들기 위하여 8 분 동안 120 GS에 사용을 위한 PBS centrif로 sphe를 두 번 더 세척하십시오.

각 실험용 우물에 대해 Resus는 PBS가 없는 160마이크로리터의 매체에 총 10개의 스테로이드를 사용합니다. 메뉴 모음에서 실행을 선택하고 일시 중지를 선택하여 RTCA 실험을 일시 중지합니다. 기기에서 CIM 플레이트를 제거하고 조직 배양 후드에 넣습니다.

각 웰에서 배지를 흡입하고 스테로이드 함유 배지로 교체합니다. 플레이트를 RTCA 기기에 다시 넣습니다. 메뉴 모음에서 실행을 선택하고 abort step을 선택합니다.

프로그램은 자동으로 다음 단계로 이동합니다. 실험을 다시 시작하려면 메뉴 모음에서 실행을 선택하고 시작 계속을 선택합니다. RTCA 프로그램의 3단계는 이 실험에서 두 개의 상피 난소암 세포주, OVCA 4, 33 및 OVCA 4, 29와 난소 과립층 세포 종양주를 시작합니다.

KGN은 하룻밤 배양 후 스테로이드를 생성하는 데 사용되었으며 메틸 셀룰로오스 함유 배지에 부유하는 U 바닥 거주지를 사용했습니다. 세 개의 세포주는 모두 직경이 약 400-500마이크로미터인 조밀한 스테로이드 구조를 형성했습니다. 하단 패널은 단층 스케일로 성장한 일치하는 세포주를 보여줍니다.

막대는 일단 형성되면 100마이크로미터를 나타냅니다. 스테로이드를 수확하여 R-T-C-A-C-I-M 플레이트의 LP 9 중피 세포 단층 위에 도금했습니다. 위상차 현미경 또는 병렬 배양의 형광 현미경 검사에서 이미지를 주기적으로 촬영하여 RTCA 데이터 해석을 도왔습니다.

암 세포주의 침입의 기저층과 화학 물질에 의해 유도된 침입을 모두 평가하는 것은 유익합니다. 이 예시에서, 기저 침습성은 상부 챔버와 하부 챔버 모두에 무혈청 배지(SFM)를 첨가하여 측정됩니다. 많은 잠재적인 화학 유인 물질을 포함하는 10% FBS가 포함된 완전한 배지는 화학 유인 물질 유도 침입을 검사하는 데 사용됩니다.

여기에 표시된 것은 kgn 세포와 LP 9 중피 세포 사이의 세포 침입을 비교한 대표적인 결과입니다. RTCA 침습 분석은 A CIM 플레이트의 하단 챔버에서 FBS를 사용하거나 사용하지 않고 수행되었습니다. 결과는 24시간 시점과 전체 2일 분석 기간에 걸쳐 3중 웰에서 SD 세포 지수를 뺀 평균 양성으로 표시됩니다.

이러한 결과는 LP 9 세포가 기저 또는 화학유인물질 유도 조건에서 2일 동안 최소 침습적임을 확인시켜주며, 따라서 난소암 세포와의 공동 배양 분석에 사용하기에 좋은 세포 유형임을 확인합니다. 대조적으로, KG와 난소암 스테로이드는 화학 유인제를 향해 침입할 수 있는 능력을 나타냈습니다. 이 그래프는 2일간의 분석에 걸쳐 24시간 동안 묘사된 K-G-N-O-V-C-A 4 29 및 OVCA 4 33 세포주의 침습 용량을 비교한 결과를 나타냅니다.

3개의 세포주 모두 증가하는 세포 지표에 의해 나타난 바와 같이 화학 유인 물질을 향해 침입할 수 있는 능력을 보여주었습니다. 세포주들은 곡선의 평행선 기울기에 의해 나타난 것과 유사한 침입 속도를 보였다. 그러나 OVCA 4 29 곡선은 더 높은 상부 아심 토트(upper asim tote)를 나타내며, 이는 다른 세포주에 비해 더 높은 최대 침입 수준을 나타냅니다.

대조적으로, 모든 세포주의 침입의 기저 수준은 낮았다. 또한, 세포주는 2.5시간 동안 침입 데이터를 보다 자세히 분석한 결과, 알 수 있듯이 침입이 시작되는 시간에 차이를 보였습니다. KGN 세포는 세포 장벽과 기질 장벽을 빠르게 침입하는 반면, OVC 4 33 및 OVC 4 29 세포는 침입하는 데 각각 3배와 5배 더 오래 걸립니다.

중요한 것은, 침공 초기에 그들의 행동이 그들의 전반적인 침공 능력을 예측하지 못했다는 것이다. 이는 암 세포주의 고유한 능력이 다르다는 것을 시사하지만, 다른 요인이 스테로이드의 초기 및 후기 침습 행동을 조절한다는 것을 나타낼 수도 있습니다. 일단 마스터하면 이 기술은 전이성 행동에 영향을 미치는 복막 미세환경 내의 다양한 신호 분자와 세포 경로를 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

이는 외인성 성장 인자, 사이토카인 또는 억제제를 웰의 바닥 또는 상단 챔버에 첨가함으로써 달성할 수 있습니다. 또는 암세포 자체 또는 복막 표적 세포를 유전적으로 조작할 수 있습니다.