Name: 실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: 학습하세요 실시간 세포 분석기를 활용한 난소암 세포의 중피 침윤 정량화 방법입니다. 이 기술은 전이 과정의 동적 특성을 연속 측정하여 암 세포 침략 메커니즘을 심층 분석합니다.

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이 작품은 CASS 기초 과학 및 의학 부여에 의해 지원되었다; (MB); 호주 프로젝트 그랜트의 국립 보건 의학 연구위원회 (KLS, 338,516); 그리고 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램 (호주)에 의해.

1. 준비 세포의, 미디어 및 시약 <ol><li> 메틸 셀룰로오스 함유 매체의 제조 <ol><li> 250 ㎖의 플라스크에 멸균 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM) (무첨가) 100 ㎖에 메틸 1.5 g을 녹인다. </li><li> 5 분 동안 전자 레인지에 최저 솔루션을 열; 닦는 않도록주의하십시오. </li><li> 메틸 셀룰로오스 파우더가 반 용해되면, 125 ML에 볼륨을 깨끗한 자석 교반기와 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> , 반전을 혼합하고, 4 ° C에서 하룻밤 교반하여 1.5 시간 동안 실온에서 교반. </li><li> 네 개의 50 ㎖ 튜브와 2,300 X g에서 1.5 시간 동안 원심 분리기에 동일하게 솔루션을 나눈다. </li><li> 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 명확하고, 점성이 높은 멸균 50 ML 튜브에 뜨는 (주식의 약 90 % -95 %), 나누어지는 및 저장을 수집합니다. </li></ol></li><li> 문화와 세포의 라벨링 <ol><li> TI의 단일 층의 난소 암 세포주를 유지10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 L 보충 : 37 ° C, (OVCA429 및 OVCA433 세포주 18 M199 KGN 셀 (17)과 MCBD110에 대한 DMEM) 적절한 성장 배지에서 5 % CO 2에서 ssue 문화 인큐베이터 -글루타민 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신. </li><li> M199에 LP9 인간 중피 세포를 유지 : 햄의 F12 미디어는 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 15 % FBS, 10 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF) 400 NG / ㎖ 하이드로 코티손을 포함. </li><li> 종자 원하는 플라스크 크기의 세포와 약 75 %의 포화 상태로 성장합니다. 0.05 % 트립신 / EDTA, 5 분 186 XG에 스핀, 그리고 PBS로 두 번 세포 펠렛을 씻어를 사용하여 트립신 처리하여 수확 세포. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li></ol></li><li> 선택적인 형광 셀 라벨 방법 <ol><li> 데워진 PBS/0.1 %의 BSA를 1 ㎖에 1 × 106 세포 / ml의 최종 농도로 재현 탁 암세포. </li><li> 5 mM의 재고 셀 (TR)의 2 μl를 추가에이스 CSFE 솔루션 (또는 장기간 유지되는 다른 바람직한 셀 라벨) 10 μM의 최종 농도에서 세포와 수조에서 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 원심 분리에 의해 10 % FBS 및 재 펠렛을 함유하는 얼음 냉각 된 배지 1 ㎖으로 반응을 켄 칭하고. 데워진 적절한 성장 배지 10ml에 재현 탁한다 (단계 1.2.1 참조). </li><li> 37 ° C에서 75cm 2 필터 덮인 플라스크와 문화에 씨앗 세포, 5 % CO 2. </li><li> 형광 라벨의 수준이 탐지를위한 적절한 지 확인하기 위해 형광 현미경으로 세포를 확인합니다. 세포는 약 75 %의 포화 상태, 수확에 도달하고 단계 1.2.3 이상 1.2.4에서와 같이 계산하면. </li></ol></li></ol> 메틸 셀룰로오스의 상체의 2.​​ 세대 <ol><li> (300000 셀 전체가 각각 전체 96 - 웰 플레이트 실험에 필요한) 타원체 생성에 필요한 제 1 ~ 난소 암 세포의 양을 계산한다. 아니테 : 여기에 제시된 다른 세포 라인을 사용하는 경우, 균일 한 구형의 생성을위한 세포 밀도는 각각의 라인에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다. </li><li> 메틸 미디어 세포의 희석을 계산하려면 먼저 15 ML에서 (단계 2.1)에 필요한 세포의 양을 뺍니다. </li><li> 각 세포주에 대한 문화 매체의 적절한 부피 15 ㎖를 뺀 세포 부피와 동일 (최종 20 %가 메틸하기 위해) 부드러운 반전에 의해 철저하게 혼합 메틸 원액 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 메틸 셀룰로오스 함유 배지에 30 만 셀을 추가하고 부드러운 반전에 의해 완전히 혼합. </li><li> 37 ° C에서 96 - 웰 오목 바닥 배양 플레이트와 문화의 각 웰에 (3,000 세포 / 웰의 총) 셀 / 메틸 / 미디어 믹스의 피펫 150 μL, 5 % CO 2 1~4일 또는 균일 한 구형 체 (1 회전 타원체가 / 잘 일반적으로 관찰)를 형성 할 때까지. </li></ol> 3. R​​TCA 셀 침략 분석 실험 NOTE : 임피던스 측정 값은 셀 인덱스 (CI), 셀의 상태를 나타내는 측정 셀 임피던스의 상대적인 변화 무 차원 매개 변수로 표현된다. Microsoft Excel과 같은 스프레드 시트에 분석을 위해 데이터를 가져옵니다. <ol><li> 접시 준비 <ol><li> 한번에 4 웰 그룹에서 작동하는 전체 표면적이 적용되도록하기 위해 16 - 웰 RTCA CIM 플레이트의 상부 챔버의 각 웰에 (무 혈청 배지 1:10 희석) 50 μL 행렬을 쓰 . 초과 액체를 제거하는, 천천히 바로 행렬의 30 μl를 제거 할 수 있지만. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 사용하기 전에 4 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 각각의 암 세포 상부 챔버 라인과 하부 챔버 (당신의 실험 설계에 따라) 또는 혈청이없는 미디어의 160 μL에 적합한 혈청 배지 (SFM)의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 상부 챔버 및 equilibr에 하부 챔버를 클릭하여 CIM 판을 조립조직 문화 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C의 배양기에서 먹었다. </li></ol></li><li> RTCA 악기를 프로그래밍 <ol><li> RTCA 프로그램을 열고 &#39;레이아웃&#39;탭을 선택합니다. 모든 실험 우물을 강조 표시합니다. </li><li> 오른쪽 우물을 클릭하고 &#39;우물를 켜고&#39;를 선택; 원하는대로 다음 실험 조건 및 셀 이름을 입력합니다. </li><li> 프로그램에 단계 또는 하위 단계를 추가 &#39;단계를 추가&#39;에서 &#39;일정&#39;탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭을 선택합니다. 첫 번째 단계는 선택 &#39;단계 추가&#39;를하면 자동으로 프로그램에 포함되어있는 미리 프로그램 된 배경 청소입니다. </li><li> LP9 단층의 설립시 판독 값을 기록합니다 RTCA 프로그램의 2 단계의 원하는 프로그램의 세부 정보를 입력합니다. &#39;&#39;간격 &#39;탭을 선택하고 &#39;15 분을 입력 임피던스 측정 값 사이의 시간 간격을 추가합니다. &#39;시간&#39;탭을 선택하여 실험 기간을 추가D 12 ~ 24 시간 사이에 시간을 입력. </li><li> 다음 단계를 추가하려면 &#39;단계를 추가&#39;에서 &#39;일정&#39;탭을 선택하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 위의 추가 단계의 세부 정보를 입력합니다. RTCA 프로그램의 3 단계 회전 타원체 침공 기간 동안 독서를 취할 수있는 악기를 직접 것입니다; &#39;시간&#39;탭에서 간격 &#39;탭과 &#39;48 시간&#39;에서 &#39;5 분을 입력합니다. </li><li> 메뉴 바의 &#39;판&#39;을 선택하고 저장합니다. </li></ol></li><li> 회전 타원체의 침략의 LP9 단층 및 측정의 생성 <ol><li> 위의 단계 3.2에서 RTCA 악기 및 오픈 프로그램에서 CIM 판을 놓습니다. 이전에 셀을 추가로 선택 메뉴 바에서 &#39;실행&#39;다음 &#39;시작&#39;. 배경 청소가 자동으로 (RTCA 소프트웨어 지침 1 단계) 수행됩니다. </li><li> 조직 문화 후드에서 배경 청소 및 장소 다음 악기에서 CIM 플레이트를 제거합니다. </li><li> 판 50,000 LP9 세포는 물론 각 CIM 판의 상부 챔버에 160 ㎕의 SFM에서 일시 중단. </li><li> RTCA 악기에 접시를 놓고 LP9 단층이 (RTCA 프로그램의 2 단계) 하룻밤 구축하는 동안 판독마다 15 분을. </li><li> 수확 암 상체 위, 2 단계 &#39;세대 메틸있는 상체의&#39;에서 생성 된. <ol><li> 무균, 1 ㎖ 피펫 팁의 맨 오프 1mm를 잘라 부드럽게 잘 각각의 내용을 검색하기 위해 사용합니다. 멸균 튜브에 전송합니다. </li><li> 원심 분리기는 8 분 120 XG에 상체, 부드러운 열망에 의해 메틸 셀룰로오스 함유 배지를 제거합니다. </li><li> 각 세척 후 상체를 펠렛 8 분 120 XG에서 원심 분리, PBS로 두 번 더 상체를 씻으십시오. </li><li> 각 실험 잘 들어, FBS가없는 배지 160 ㎕의 10 상체의 총을 재현 탁. </li><li> 메뉴 바에서 &#39;실행&#39;을 선택하고 확인 및하여 RTCA 실험을 일시 중지# 8216; &#39;일시 중지합니다. 악기에서 CIM 플레이트를 제거하고 조직 문화 후드에 배치합니다. 기음 각 우물에서 용지 오프 LP9 전용 제어 우물 구형 함유 미디어 (160 ㎕의 10 분야) 또는 신선한 용지로 교체합니다. </li></ol></li><li> RTCA 계기로 판을 반환합니다. 메뉴 바에서 &#39;실행&#39;과 &#39;단계를 중단&#39;확인을 선택합니다. 이 프로그램은 자동으로 다음 단계로 이동합니다. 실험을 다시 시작하려면 메뉴 바에서 &#39;실행&#39;과 &#39;시작 / 계속&#39;확인을 선택합니다. RTCA 프로그램의 3 단계를 시작합니다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 <ol><li> 회전 타원체 세포 침윤의 수준을 결정하기 위해, 단지 각 평가시기에서 난소 암 세포주에 대해 얻어진 각각의 판독으로부터 LP9 단층 얻은 값을 뺀다. </li><li> &#39;회전 타원체 침입을&#39;그리려면되다, 상체가 플레이트에 첨가되는 시점에 모든 값을 정규화&#39;0 &#39;으로 그 시점을 랩탑 설치. </li></ol></li></ol>

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</ol>

ACEA Biosciences, Inc. 및 MIMR-PHI Institute of Medical Research에서 지불한 오픈 액세스 요금입니다.

침입 난소 암 세포는 섬유 아세포, 지방 세포, 및 중피 세포 포함한 복막의 표면에 다양한 종류의 세포와 상호 작용하고, 암세포 및 복막 세포 사이의 양방향 통신이 전이 과정이 구동에 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. 일단 마스터, 본원에 기재된 프로토콜은 복막 미세 환경 내에서 이러한 상호 작용의 연구에 용이하게 적응할 수있다, 예를 들어, 외인성 사이토 카인, 성장 인자, 또는 CIM 웰 플레이트 또는 유전자 조작의 상부 또는 하부 챔버에 특정한 억제제의 추가를 통해 복막 암 세포주. 또한,이 방법은 규제 신호 및 복강 내 전이 병변의 설립을 제어하는​​ 세포의 상호 작용에 직접적인 통찰력을 얻기 위해 악성 복수 및 / 또는 기본 복막 세포에서 갓 수확 된 차 난소 종양 세포와 함께 사용할 수 있습니다 <s업&gt; 2. 단일 세포 또는 상체의 침략 용량을 측정 할 수 RTCA 악기의 사용은 기존의 단일 엔드 포인트 분석과 시간 경과 이미지 분석을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다. RTCA 계기는 몇 시간 또는 며칠이 될 수있는 분석의 과정을 통해 지속적으로 정의 된 간격으로 세포 침입을 측정합니다. 이것은 하나의 엔드 포인트 분석의 한계를 극복 시간에 침략의 속도, 변화의 결정을 할 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 엔드 포인트 (그림 2), 예를 들면, 3 시간에 다른 암 세포 라인의 침입 데이터를 검사, KGN과 OVCA433 세포가 훨씬 더 침략 OVCA429 세포보다이었다 잘못된 결론에 LED가 있습니다. 이 기술의 또 다른 장점은 RTCA 악기 전기 임피던스의 변화를 측정한다는 것이다. 이 분석은 세포 페닐에 의도하지 않은 영향을 미칠 수있는 외생 에이전트와 세포를 라벨없이 실행할 수 있다는 것을 의미합니다otype 또는 함수입니다. 그들의 생체 활동이 반영되지 않는 분자 및 표현형 변화를 도입 피하기 위하여 최소한의 조작을 계속하는 것이 필수적이다있는 악성 복수, 유래 차 난소 암 세포를 연구 할 때 특히 중요하게된다. 또한, RTCA 악기의 사용은 시간 경과 현미경과 관련된 분석을 소모를 방지뿐만 아니라 분석의 최적화를위한 주요 실험 윈도우의 신속한 결정을 가능하게뿐만 아니라 실시간에 정량적 인 데이터의 수집을 가능하게합니다. 회전 타원체의 침공에 대한 다양한 요인의 영향을 비교할 때 이것은 특히 유용합니다, 같은 다른 요인은 다른 timepoints 또는 시간이 지남에 따라 크게 다른 프로필과 자신의 최대한의 효과를 발휘할 수있다. 이 프로토콜은 변경 (예컨대, 의무이지만 상이한 ECM 행렬, 다른 암 세포주 또는 상이한 타겟 CEL 사용이렇게하면 LS), 다양한 실험 조건은 우선 최적화되어야한다는 것을주의하는 것이 중요하다. 예를 들어, 이전에 회전 타원체의 내습 시험을 시작으로, 암 세포 / CIM 플레이트의 최적의 수는 물론 첫번째 단층 배양에서 세포 수의 적정 분석에 의해 결정되어야한다. 웰 당 사용하는 구 상체의 최적의 수는 다음이 분석에 기초한다. 처음으로 생성 될 때 예를 들어, 현재의 방법에서는, 구 상체는 각 약 3000 세포를 포함한다. 초기 세포 수의 적정은 단일 층에 30,000 세포 분석 침략의 검출을위한 최적의 것을 나타냅니다 경우, 10 상체가 잘 CIM 플레이트 당 추가됩니다. 공동 배양 실험을 수행 할 때 또한, 별도 이들 세포는이 결과를 혼동 할 수 있으므로, 본질적으로 침습 여부를 판정하기 위해 &#39;타겟&#39;세포 단층의 행동을 연구하는 것이 중요하다. 설명 된 예에서, 암은 상체 LP9 셀 monola 위에 도금된다FBS와와없는 YER은 화학 유인 물질뿐만 아니라 아래에 추가. 병행 LP9 세포는 각각의 처리 조건에서, 단독으로 배양된다. 세포 및 상체의 침습 용량을 연구 할 때 마찬가지로, 그것은이 동작을 (이주되지 않는 동안, 즉 침입 ECM 장벽의 단백질 분해 소화를 요구)를 구별하기 위해서뿐만 아니라 자신의 이동성 용량을 조사하는 것이 중요하다. 이를 위해, ECM 장벽을 생략 (3.1.1 단계 - 3.1.3) 그 자리에 ECM 장벽과 병렬로 분석을 실시하고 있습니다. 원하는 경우 후자의 &#39;침략&#39;법안은, 전 &#39;마이그레이션&#39;측정을 보정 할 수있다. 세포가 바닥 챔버 내로 침입 한 후에 자신의 어태치먼트, 확산, 및 멤브레인의 밑면에 증식의 변동의 변화에​​ 기여할 수있다 : 마지막으로, 전기 임피던스의 측정으로부터 얻은 정보가 범위에 한정된다는 점에 유의하는 것이 중요 임피던스 정말이에요종소리. 종합적으로 구형 세포의 행동을 평가하기 위해 구형 세포 생존, 접착, 이동 및 형태의 다른 분석과 함께 사용하면 따라서,이 방법은 대부분의 정보를합니다. 회전 타원체 형태 및 건강의 질적 평가는 침입 정량적 RTCA 분석법과 평행 할 수 있도록 예를 들어, 이상적으로는, 완전 구형-중피 상호 작용을 이해하기 위해, 분리 된 공동 배양은 또한 표준 위상 현미경 하에서 주기적으로 묘화한다. 선택적 라벨링 공정이 수행되는 경우에 그들이 타원체로부터 해리하는 및 비 표지 중피 세포와 상호 작용할 때, 다음 번의 암세포의 행동은 형광 현미경 하에서 결정될 수있다. 제 2 셀 타입과 함께 공동 배양 될 때 형광 암세포 라벨의 추가 장점은 오직 암 세포가 세포와 ECM 장벽을 통해 침입 한 것을 확인하는 것이 가능하다는 것이다. <p class="jove_content"&gt; 요약하면,이 방법은 중피 및 ECM 장벽의 난소 암의 회전 타원체의 침공의 높은 처리량 정량 분석​​을 나타냅니다. 외인성 사이토 카인, 성장 인자, 또는 잘 CIM 판의 상부 또는 하부 챔버에 특정한 억제제의 추가를 통해,이 방법은 위에 중피 및 매트릭스 장벽을 통해 침입하는 난소 암 타원체 세포 사이의 상호 작용을 조절 인자의 신속한 결정을 가능하게 시간.

난소 암은 모든 부인과 암 1의 가장 높은 사망률을 가지고 있습니다. 전 세계적으로 ~ 230,000가지 경우 인해 매년 1 병에 100,000의 죽음이 있습니다. 대부분의 환자 (&gt; 75 %)의 암이 이미 전이 된 후 치료가 더 화학 요법에 저항 증가에 의해 복잡하게되는 경우, 진단과 환자의 예후 (豫后)는 2 좋지 않습니다. 단계 III-IV 전이성 질환 환자는 30~40% 3 5 년 생존율이 있습니다. 따라서, 효과적으로 향상된 질병을 치료하기 위해 난소 암 전이의 기초가 셀룰러 동작의 더 나은 이해를위한 긴급한 필요가있다. 난소 암 전이의 현재 모델은 어떤 종양 행동에 영향 미세 환경에서 발생하는 별개의 각각의 전이 과정의 여러 단계를 제안한다. 을 전이 난소 암 세포는 처음에 기본 종양 사이트에서 창고 및 nonadher에서 살아남을 수 있습니다단일 셀 또는 3 차원 다세포 구조로 복강 액 내에서 ENT 상태, 다세포 집계 또는 상체 2,4,5라고. 서스펜션의 상체를 형성하지 않는 세포는 anoikis 2,4,5에 더 취약합니다. 구 상체는 또한 잔여 질병 및 암 2,4,5의 후속 반복에 기여하고, 화학 요법에 대한 내성을 증가 나타낸다. 난소 암 전이의 두 번째 중요한 단계는 복막 벽과 대망 5,6 내에 설립 이차 종양 자유 부동 클러스터에서 집계의 전환이다. 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용은 집계 형성, 생존, 그리고 복막 4-11의 중피 라이닝에 의해 생성 된 세포 외 기질 (ECM) 준수에 연루되어있다. 아직 이러한 프로세스는 제대로 이해하고 있습니다. 난소 암의 보급에 관여하는 메커니즘을 정의하려면, 상체는 gener이 될 수 있습니다ated 배양액 12,13에 메틸 셀룰로오스를 첨가하여 또는 저 부착 2,14 플레이트에 세포를 배양하여 세포 현탁액 중의 어느 하나를 유지하는 비 접착 배양 방법을 사용하여 확립 된 암 세포주에서. 이 방법으로 배양 한 경우, 난소 암 세포는 생체 내에서 발견 2,14 종양 골재 마찬가지 세포 분자 및 생화학 적 특성을 나타낸다 다세포 응집체 또는 구 상체에 조립한다. 형성 후, 구 상체는 이후 비 접착 매체로부터 수확 될 수 있고, 추가적인 기능 연구에 대한 고체의 표면 상에 다양한 replated. 이것은 정확하게 같은 복막 유체로서 비 접착 환경 내을 전이 난소 암 세포의 행동을 모델화하지 않는 단층 배양에서 분석을 통해 사전을 나타낸다. 암 상체의 침습 용량 보이든 챔버이 전통적인 종점 분석법으로 평가할 수있다 </su난소 암 세포의 침공이 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이기 때문에 P&gt;하지만,이 방법은, 오해의 소지가있을 수 있습니다. 최근 실시간 방법은 난소 암 상체에게 (15, 16)에 침입하여 중피 세포 정리의 시간 경과 비디오 현미경을 사용하여 고안되었습니다; 그러나, 시간 경과 데이터의 분석은 시간이 소요됩니다 주관적 일 수있다. 여기서, 실시간 난소 암 상체의 침습 행동을 평가하기위한 신속하고 정량적 방법이 설명된다. 첫째, 구형 - 중피 세포 모델은 다세포 상체가 연결하고 보조 종양을 형성하는 복막 안감을 공격 할 때 난소 암 전이의 단계를 나타내는 설립되었습니다. 그런 다음 실시간 세포 분석기 (RTCA, 회사 정보에​​ 대한 자료 표 참조)에 대한 방법론은 상체로 성장이 모델에서 테스트 다른 난소 암 세포주의 침략 능력의 정량적 실시간 측정을 실시하도록했다. RTCA에있는strument, 세포 반응은 전기 임피던스의 변화를 측정함으로써, 외인성 레이블에 대한 필요없이, 분석의 과정 동안 연속적으로 모니터링된다. 특별히 디자인 문화 판은 2 잘 챔버 ( &#39;CIM&#39;판)의 상부 및 하부 챔버 사이의 계면에 미세 다공성 막 아래에있는 금 코팅 된 미세 전극이있다. 세포가 ECM 또는 ECM / 세포 장벽을 통해 침입으로 하부 챔버 내의 전극의 위치는 전기 임피던스의 변화를 측정 할 수있다. 각 CIM 판 우물의 2 챔버 사이의 막 인터페이스는 먼저 관심 ECM 성분으로 코팅되어 있습니다. 구형 - 중피 세포 모델 시스템에서 인터페이스는 인간 중피의 합류 단층 다음 복막의 중피 라이닝의 기초가되는 복잡한 ECM을 모방하는 리겔 층 (회사 자세한 내용은 재료 표 참조) &#39;으로 코팅 대상 &#39;세포. 마지막으로, 미리 형성된 난소 암 상체는 광고입니다DED. 난소 암 세포 타원체 적극적 하부 측실 도달 전기 임피던스 측정 값을 변경하는 표적 세포 층과 매트릭스를 통해 침입한다. 자신에 대한 표적 세포는 또한 그들이 매트릭스 층을 통해 침입 및이 분석에서 사용하기에 적합하지 않는 것을 보장하기 위해 평가된다.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP 분석기</td><td>ACEA biosciences</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence CIM 플레이트&nbsp;</td><td>ACEA 생명과학</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell TraceTM CFSE&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스 (4,000 센티포즈)</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>미디엄 199&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td></td><td></td>11150067</tr><tr><td>Ham의 F-12 영양 믹스</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>11765062</tr><tr><td>표피 성장 인자(EGF)</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>96-well concave culture plate&nbsp;</td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 인간 중피 세포주</td><td>Coriell Institute for Medical Research&nbsp;</td><td></td><td></td>AG07086</tr><tr><td>성장 인자 감소 마트리겔 매트릭스</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>제354230</td><td></td></tr></tbody></table>호

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

난소 암은 복강 액에 흘리고 복막 내 원심 사이트에 분산 전이. 암 세포가 본질적으로 부착 및 이차 종양을 형성하는 복막 안감 침입하여 전이성 프로세스 올릴 다세포 구조로 응집으로서 단층 배양 정확하게, 비 접착 환경 내 암세포의 동작을 모델링하지 않는다. 난소 암 전이, 다세포 집계 또는 구 상체의 중요한 단계를 모델링하기 위해, 비 접착 조건 하에서 유지 확립 난소 암 세포주에서 생성 될 수있다. 생체 내에서 종양 세포에 의해 발생하는 복막 미세 환경을 모방하기 위해, 회전 타원체 - 중피 공동 문화 모델은 상체가 세포 외 기질 장벽 형성, 인간 중피 세포 단일 층 위에 도금하는 예비 성형하는 년에 설립되었습니다. 방법은 그 후에 정량적 실시간을 수행하는 실시간 셀 분석기를 사용하여 개발되었다상체로 성장 다른 난소 암 세포주의 침윤 능력의 시간 측정. 이 방식은 기존의 엔드 포인트 분석 등 힘든 실시간 현미경 이미지 분석을 통해 몇 가지 장점을 가지고 시간의 긴 기간 동안 침략의 연속 측정 할 수 있습니다. 요컨대,이 방법은 시간이 지남에 중피 매트릭스 장벽을 통해 침입하는 난소 암 타원체 세포 사이의 상호 작용을 조절 요인 신속한 결정을 가능하게한다.

난소 암 상체는 현탁액들을 배양함으로써 악성 복수 2,14에서 일차 종양 세포를 수확하여 세포주 많은 종류로부터 생성 될 수있다. 이곳이 상피 성 난소 암 세포주, OVCA433 및 OVCA429 및 난소 과립 막 세포 종양 라인 KGN은 상체 (도 1a)을 생성하는데 사용되어왔다. 메틸 셀룰로오스를 첨가하여 이루어진 것으로, 점성 매체에 부유하는 동안이 방법에서, 세포는 U-바닥 웰에서 배양 하였다. 이러한 조건 하에서, 많은 난소 암 세포는 상체 (13)를 형성하도록 응집하는 고유의 능력을 나타낸다. 메틸 셀룰로오스 / 매체에 현탁하고 하룻밤 동안 배양 후, 세 개의 세포주는 직경이 약 400 ~ 500 μM (도 1a)의 소형 구형 구조를 형성했다. 한편, RTCA CIM 플레이트는 첫번째 행렬과 인간의 MES 후 합류 단층과 공막 인터페이스를 코팅함으로써, 제조othelial 세포 (그림 1B). 일단 형성, 상체는 다음 준비된 CIM 판에 전송됩니다. 수확 암 상체는 LP9 단층 위에 도금과 아래에 설명 된대로 평가된다. 병렬 문화 (옵션 셀 라벨 단계는 다음 경우 또는 형광 현미경 아래) 표준 위상 현미경 아래 이미지는 RTCA 데이터의 해석 (그림 1C)을 돕기 위해 정기적으로 촬영하고 있습니다. 이는 암세포의 침윤 기저 수준뿐만 아니라, 화학 유인 물질 - 유도 침입 모두를 평가 유익하다. 통상적으로, 기저 침입 양쪽 상부와 하부 챔버 SFM의 첨가에 의해 측정된다. 많은 잠재적 인 chemoattractants을 포함 전체 미디어 (10 % FBS)을, &#39;화학 유인 물질에 의한 침략 (그림 2)을 검사하는 현재의 예에서 사용됩니다. 혼자 LP9 중피 세포의 병렬 연구는이 세포가 최소한에 있는지 확인vasive 따라서 기저 또는 &#39;화학 유인 물질&#39;유도 조건으로 하나에서 2 일 이상은 난소 암 세포와 공동 배양 분석에 사용하기 좋은 셀 분류 있었다 (도 2a 및도 2b). 반면, 세 개의 세포주 중 하나를 사용하여 생성 된 난소 암 상체는 화학 유인 물질 (FBS) (도 2A-2C)을 향하여 침입하는 능력을 나타내었다. 전통적인 종점 분석법 위에 RTCA 실시간 계기를 사용의 주요 이점은 셀 / 회전 타원체 행동의 변화가 시간이 지남에 따라 정량화 될 수 있다는 것이다. 2 일 분석을 통해, KGN, OVCA429 및 OVCA433 세포주 모두 (셀 인덱스를 증가로 표시) 화학 유인 물질 그러나 침략의 낮은 기저 수준 (그림 2C)으로 침입 할 수있는 능력을 나타내었다. 곡선 (도 2c)의 평행 한 경사면으로 나타낸 바와 같이 세포주, 침입의 유사한 비율을 나타내었다; 그러나 OVCA429 곡선은 높은 상부 점근선을 나타내,이는 다른 세포주에 비해 침윤 높은 최대 수준을 나타냈다. 또한, 세포 라인은 KGN 세포가 빠르게 (그림 2D) 각각 침공 이상 3 배를 복용 세포 및 매트릭스 장벽과 OVCA433 및 OVCA429 세포 침입과, 침략의 발병에 자신의 배의 차이를 보였다. 중요한 것은, 침략의 발병에 그들의 행동은 침략에 대한 자신의 전체 용량 (그림 2C와 2D)의 예측하지 않았다. 이는 암세포의 다른 고유 기능을 제안하지만, 또한 다른 요인 상체의 초기와 후기 침습 행동을 조절할 수 있다는 것을 의미 할 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1 실험의 회전 타원체 생성 및 모델을 설정합니다.. I. B 메틸 / 미디어 (위)에 형성 상체의 위상차 현미경의 밑에 그리고 단층 (아래)로 성장 일치하는 세포주의 마법사 : 회로도 RTCA 2 CIM 판 잘 난소 암을 사전에 형성되는, 설정 챔버 표시 상체가 화학 유인 물질로 FBS ± 상부 챔버 및 미디어 LP9의 중피 층 / 매트릭스 장벽의 단층 위에 도금하는 하부 챔버에 추가됩니다. . 위상차 현미경 (왼쪽) 또는 형광 현미경 (오른쪽)에서 LP9 단층 위에 KGN의 상체의 이미지 : 더 많은 세포가 하부 챔버 C의 장벽을 통해 침입으로 전기 임피던스를 증가 2 챔버 측정의 인터페이스 아래에 전극. 스케일 바 = 100 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> .. 그림 2 실시간 난소 암의 회전 타원체의 침공 데이터 - B : 잘 CIM 판의 아래쪽 챔버에 FBS와 사용하지 실시 RTCA 침공 분석에서 대표 결과. KGN 세포 침윤 LP9 중피 세포에 비교된다. 결과는 24 시간 평가시기 (A)에서와 전체 이틀 분석 기간 (B)에 세중 우물에서 평균 ± SD 휴대 지수로 표시됩니다 C - D :. KGN, OVCA429의 침략 용량의 비교 및 OVCA433 세포 24 시간주기 (C)에와 2.5 시간의 시간 (D)에 대한 자세한 방식으로 묘사 라인.

복막의 중피 안감에 난소 암 세포의 침공은 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이다. 실시간 분석기를 활용 타원체-중피 세포 공동 배양 모델의 난소 암 세포의 침윤 능력은 전이 과정을 조절하는 인자에 대한 통찰력을 제공하고, 장기간의 시간주기에 걸쳐 정량화 될 수있다.

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

본 절차의 전반적인 목표는 전이의 아스테로이드 중피세포 공동 배양 모델에서 난소암 세포의 침습을 실시간으로 신속하게 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 메틸 셀룰로오스 내에서 비부착 조건으로 세포를 배양하여 세포주로부터 난소암 구체를 생성함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 2챔버 웰의 상단 챔버에 matrigel을 코팅하여 복강 중피의 하부에 위치한 기저막과 중피 내피 자체를 모방함으로써 실시간 세포 분석기용 CIM 플레이트를 준비하는 것입니다.다음으로, 난소암 스테로이드를 회수하여 실시간 분석기 플레이트 웰의 상부 챔버에 첨가합니다. 마지막 단계는 실시간 세포 분석기를 프로그래밍하고 시작하는 것이며, 분석기가 장시간의 분석 과정 동안 미리 정의된 간격으로 주기적인 측정값을 읽어 들입니다. 최종적으로 얻은 결과는 지속적인 침습 과정을 보여주며, 이는 난소암 세포가 세포 및 매트릭스 장벽을 침습할 때 이를 조절하는 주요 요인을 결정하는 데 사용됩니다.암세포 침습의 표준 트랜스웰 분석(transwell assay)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 암세포의 침습을 장기간에 걸쳐 지속적으로 측정할 수 있다는 점입니다. 난소암 전이의 역동적인 특성을 완전히 포착하지 못하는 단일 종점 분석(endpoint assay)과 달리, 이 방법은 난소암에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용되지만 유방암과 같은 다양한 유형의 전이 과정이나 내피세포 층을 통한 암세포의 이동을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 마찬가지로, 배아 착상 중의 영양막 세포 침습과 같은 정상 세포의 침습을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 형광 세포 표지를 위해 난소암 세포를 준비하십시오.먼저 세포의 밀도가 75%가 되었을 때 수확하고, 0.1% BSA가 포함된 예열된 PBS 1 mL당 100만 cells/mL의 최종 농도로 세포를 재현탁합니다. 웰당 최적량의 스테로이드를 첨가하고 스테로이드를 주의 깊게 다루는 것이 이 실험 절차의 성공에 매우 중요합니다. 다음으로, 5 mM의 CellTrace CFSE 스톡 용액 2 µL를 세포에 첨가하여 최종 농도가 10 µM이 되게 한 후, 37 °C 항온수조에서 10~15분 동안 배양합니다. 10% FBS가 포함된 얼음처럼 차가운 배지 1 mL를 넣어 반응을 중단시키고 원심분리를 통해 다시 펠릿화합니다. 적절한 예열된 성장 배지 10 mL로 재현탁한 후, 75 cm² 필터 캡 플라스크에 세포를 접종하고 형광 표지 수준이 검출에 적절할 때까지 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다.각 세포주에 적합한 배양액의 부피를 측정하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 배양액의 부피는 15 milliliters에서 구형체(sphere) 생성에 필요한 세포의 부피를 뺀 양입니다. 최종 methyl cellulose 농도가 20%가 되도록 배양액에 methyl cellulose 스톡 용액 3 milliliters를 첨가하고, 가볍게 뒤집어 충분히 혼합합니다. Methylcellulose가 포함된 배양액에 300,000개의 세포를 첨가하고 가볍게 뒤집어 충분히 혼합한 후, 세포가 포함된 Methylcellulose 배양액 혼합물 150 microliters를 96웰 오목 바닥 배양 플레이트(96 well concave bottom culture plate)의 각 웰에 피펫으로 분주합니다.이렇게 하면 웰당 총 3000개의 세포가 되며, 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 1~4일 동안 또는 균일한 PHE가 형성될 때까지 배양합니다. 일반적으로 웰당 하나의 스테로이드를 관찰합니다. 실시간 세포 분석기 또는 RTCA 세포 침습 분석에는 16웰 RTCA 2챔버 CIM 플레이트가 사용됩니다. 한 번에 4개 웰씩 그룹으로 나누어 작업하며, 플레이트 상단 챔버의 각 웰에 50 µL의 매트릭스를 추가하여 전체 표면이 덮이도록 합니다.과잉 액체를 제거하기 위해 즉시 30 µL의 매트릭스를 천천히 제거하십시오. 사용 전 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 37 °C로 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 상단 챔버에 각 암 세포주에 적합한 무혈청 배지 30 µL를 추가하고, 하단 챔버에는 혈청 포함 여부에 따라 배지 160 µL를 추가합니다.실험 설계에 따라 하단 챔버를 상단 챔버에 딸깍 소리가 나도록 결합하여 CIM 플레이트를 조립하고, 37 °C 인큐베이터에서 평형화합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 유지하는 동안, RTCA 프로그램을 실행하고 레이아웃 탭을 선택합니다. 모든 실험 웰을 강조 표시한 다음, 웰을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 웰 켜기(turn on wells)를 선택합니다.그런 다음 원하는 실험 조건과 셀 이름을 입력하십시오. 프로그램에 단계 또는 하위 단계를 추가하려면 스케줄(schedule) 탭을 선택하고 '단계 추가(add a step)'를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오. 첫 번째 단계는 미리 프로그래밍된 배경 스캔(background sweep)이며, 이는 프로그램에 자동으로 포함됩니다.단계 추가를 선택한 후, LP nine 인간 중피세포 단일층 형성 동안 측정값을 기록할 RTCA 프로그램의 두 번째 단계에 필요한 프로그램 세부 정보를 입력하십시오. 간격(interval) 탭을 선택하고 15분을 입력하여 임피던스 측정 사이의 시간 간격을 추가합니다. 기간(duration) 탭을 선택하고 12에서 24시간 사이의 시간을 입력하여 실험 기간을 추가하십시오.이후 단계들도 동일한 방식으로 추가합니다. RTCA 프로그램의 세 번째 단계에서는 기기가 fluid invasion 동안 측정값을 기록하도록 설정합니다. interval 탭에 5분, duration 탭에 48시간을 입력하십시오.메뉴 바에서 플레이트를 선택하고 저장하십시오. 이 절차를 시작하려면 CIM 플레이트를 RTCA 기기에 넣고 이전에 저장한 프로그램을 여십시오. 메뉴 바에서 실행(execute)을 선택하면 백그라운드 스윕(background sweep)이 자동으로 시작됩니다.백그라운드 스윕(background sweep) 후, 기기에서 CIM 플레이트를 꺼내 조직 배양 후드 내 플레이트 거치대에 놓습니다. 각 CIM 플레이트의 상단 챔버에 혈청 무첨가 배지 160 µL에 부유시킨 50,000개의 LP nine 세포를 분주합니다. 플레이트를 RTCA 기기에 넣고 LP nine 단층이 밤새 형성되는 동안 15분마다 측정값을 읽습니다. 다음 날, 1 mL 피펫 팁의 끝부분 1 mm를 무균적으로 절단한 후, 이를 사용하여 각 세포주별 각 웰의 내용물을 조심스럽게 회수합니다.멸균 튜브 원심분리관에 스테로이드를 모읍니다. 120 GS에서 8분 동안 스테로이드를 원심분리한 후, 부드러운 흡입으로 메틸셀룰로스 함유 배지를 제거합니다. PBS로 두 번 더 세척하며, 매 세척 후 스테로이드를 침전시키기 위해 120 GS에서 8분 동안 원심분리합니다.각 실험 웰에 대해 PBS가 없는 배지 160 µL에 총 10개의 스테로이드를 재부유시킵니다. 메뉴 바에서 execute를 선택하고 pause를 체크하여 RTCA 실험을 일시 중지합니다. 기기에서 CIM 플레이트를 꺼내 조직 배양 후드에 놓습니다.각 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 스테로이드가 포함된 배지로 교체합니다. 플레이트를 RTCA 장비로 다시 넣습니다. 메뉴 바에서 execute를 선택하고 abort step을 확인합니다.프로그램은 자동으로 다음 단계로 이동합니다. 실험을 재개하려면 메뉴 바에서 execute를 선택하고 start continue를 확인하십시오. RTCA 프로그램의 세 번째 단계에서는 본 실험에 사용될 두 가지 상피성 난소암 세포주인 OVCA 4 33 및 OVCA 4 29와 난소 과립막 세포 종양 세포주를 개시합니다.KGN은 하룻밤 동안 배양한 후, 메틸 셀룰로오스가 포함된 배지 내에 부유시킨 U-bottom 웰을 사용하여 스테로이드 구조체를 생성하는 데 사용되었습니다. 세 가지 세포주 모두 직경 약 400~500 µm의 조밀한 스테로이드 구조체를 형성했습니다. 하단 패널은 단층 배양 규모로 성장시킨 동일한 세포주를 보여줍니다.바는 형성 후 100 micrometers를 나타냅니다. 스테로이드를 수확하여 R-T-C-A-C-I-M 플레이트 내의 LP nine 중피세포 단일층 위에 도말하였습니다. RTCA 데이터 해석을 돕기 위해 위상차 현미경 또는 형광 현미경 하에서 병행 배양된 세포의 이미지를 주기적으로 촬영하였습니다.암세포주의 기저 침습 층과 화학 유인 물질에 의해 유도된 침습을 모두 평가하는 것은 유용한 정보가 됩니다. 본 예시에서 기저 침습성은 상단 및 하단 챔버 모두에 무혈청 배지(SFM)를 첨가하여 측정합니다. 많은 잠재적 화학 유인 물질이 포함된 10% FBS 함유 완전 배지는 화학 유인 물질 유도 침습을 조사하는 데 사용됩니다.kgn 세포와 LP nine 중피 세포 간의 세포 침습 비교를 통한 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. RTCA 침습 분석은 A CIM 플레이트의 하단 챔버에 FBS를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 나누어 수행되었습니다. 결과는 24시간 시점 및 2일의 전체 분석 기간 동안 3중 복제 웰에서 측정된 세포 지수의 평균값에서 SD를 뺀 값으로 표시되었습니다.이러한 결과는 LP nine 세포가 기저 상태 또는 화학유인물질 유도 조건 모두에서 2일 동안 침습성이 최소화됨을 확인해주며, 따라서 난소암 세포와의 공배양 분석에 사용하기에 적합한 세포 유형임을 보여줍니다. 반면 KG 및 난소암 스테로이드는 화학유인물질을 향해 침습하는 능력을 나타냈습니다. 이 그래프는 2일간의 분석 기간 동안 24시간 단위로 나타낸 K-G-N-O-V-C-A 4 29 및 OVCA 4 33 세포주의 침습 능력 비교 결과를 보여줍니다.세 가지 세포주 모두 세포 지수의 증가에서 나타나듯 화학 유인 물질을 향해 침습하는 능력을 보였습니다. 곡선의 평행한 기울기에서 알 수 있듯이, 각 세포주는 유사한 침습 속도를 나타냈습니다. 하지만 OVCA 4 29 곡선은 더 높은 상단 점근선을 보였으며, 이는 다른 세포주들에 비해 더 높은 최대 침습 수준을 나타냅니다.이와 대조적으로, 모든 세포주의 기저 침습 수준은 낮았습니다. 또한, 2.5시간 동안의 침습 데이터에 대한 보다 세부적인 분석에서 나타난 바와 같이, 세포주마다 침습 시작 시간에 차이를 보였습니다. KGN 세포는 세포 및 매트릭스 장벽을 빠르게 침습하는 반면, OVC 4 33 및 OVC 4 29 세포는 침습하는 데 각각 3배와 5배 더 많은 시간이 걸렸습니다.중요한 점은, 침습 초기 단계의 행동이 전체적인 침습 능력에 대한 예측 지표가 되지 않았다는 것입니다. 이는 암세포주마다 고유한 능력이 다름을 시사하지만, 스테로이드의 초기 및 후기 침습 행동을 조절하는 요인이 서로 다를 수 있음을 나타내기도 합니다. 이 기술을 숙달하면 복막 미세환경 내에서 전이 행동에 영향을 미치는 다양한 신호 분자와 세포 경로를 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.이는 웰의 상단 또는 하단 챔버에 외인성 성장 인자, 사이토카인 또는 억제제를 첨가함으로써 달성할 수 있습니다. 또는 암세포 자체나 복막 표적 세포를 유전적으로 조작할 수도 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

여기에 설명된 mesothelial 통관 분석은 fluorescently 표시된 셀 및 촬영된 비디오 현미경 시각화하고 양적 난소암 다세포 spheroids 및 mesothelial 세포 monolayers의 상호 작용을 측정하기 위해 활용합니다. 이 분석은 난소 암 전이의 초기 단계를 모델.

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

이 비디오에서는 복막강 내막의 체외 3차원 모델 개발을 보여줍니다. 이 유기형 배양은 난소암 세포의 부착, 침입 및 증식을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

복강내막의 난소암 전이 모델링: 복막강 내막의 체외 3D 모델을 확립하는 방법

이 비디오는 형광 표지된 세포와 타임 랩스 비디오 현미경을 사용하여 난소암 스페로이드와 중피 세포의 상호 작용을 정량적으로 측정하는 기술에 대해 설명합니다. 이 in vitro assay는 in vivo에서 전이되는 난소암 세포 스페로이드와 복막강 내벽의 중피 세포 간의 상호 작용을 모델링합니다.

Mesothelial clearance Assay: 난소암 스페로이드가 중피 세포 단층으로 침투하는 능력을 정량화하는 In vitro 기술

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

우리는 복막 지방 조직, 특히 망막의 난소암 집락화를 연구하기 위해 생체 내 및 생체 외 접근 방식을 모두 구현하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 복막 지방의 전이를 촉진하는 유백색 반점(milky spots)으로 알려진 망막의 면역 세포 구조를 정량화하고 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 및 생체 외 복막 지방이에 밀키 스팟 구조의 난소 암 전이성 식민지를 연구하는 접근 방식

난소암 전이는 수많은 미만성 복강 내 병변을 특징으로 하기 때문에 종양 부담을 시각적으로 정확하게 정량화하는 것이 어렵습니다.  여기에서는 적색 형광 단백질(RFP) 표지 종양 세포 및 광학 이미징을 사용하여 전이성 종양 부담의 현장 및 생체 외 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

복강 내 난소 암 전이의 정량

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

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여기에서는 난소암 세포의 부착, 침습 및 증식을 조사하기 위한 도구로서 일차 인간 중피 세포와 세포외 기질로 층을 이룬 섬유아세포로 구성된 복막강 내막의 3차원 체외 모델을 구성하는 프로토콜을 제시합니다.

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

생리 관련 모델에서 난소 종양의 진행을 연구하기 위해, 다세포 회전 타원체는 시뮬레이션 된 유체의 흐름에 따라 마이크로 디바이스에서 배양 하였다. 이 동적 3D 모델은 난소 암 전이가 발생 셀룰러 및 기계 부품과 복강 환경을 에뮬레이트합니다.

동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

학습하세요 실시간 세포 분석기를 활용한 난소암 세포의 중피 침윤 정량화 방법입니다. 이 기술은 전이 과정의 동적 특성을 연속 측정하여 암 세포 침략 메커니즘을 심층 분석합니다.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

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