SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

이 절차의 전반적인 목표는 주어진 관심 단백질에 대한 단백질 상호 작용 파트너를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 탄소와 질소의 서로 다른 안정 동위원소로 표지된 아르기닌과 라이신을 포함하는 세포 배양 배지에서 세포를 성장시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 관심 단백질 또는 대조 플라스미드를 라벨링된 세포에 transfection, plasmids 및 코팅하는 것입니다.

다음으로, 세포를 용해시키고 샘플을 용해물로부터 면역 침전시킵니다. 그런 다음 동일한 부피의 대조군 및 샘플 면역 침전물을 결합하여 lc MS MS 분석을 위해 제출합니다. 마지막 단계는 질량 분석 데이터를 분석하여 관심 단백질과 상호 작용하는 단백질을 식별하는 것입니다.

궁극적으로, 세포 배양 또는 실락 아미노 침전에서 아미노산의 안정 동위원소 표지는 조직 배양 세포에서 관심 단백질과의 많은 수의 직간접적인 상호 작용을 식별할 수 있습니다. 탭 태깅(tap tagging)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 연구자가 질량 분석법에서 개별 밴드를 보낼 필요가 없다는 것입니다. 이렇게 하면 중요한 바이어스 원인이 제거되는 동시에 감도가 향상됩니다.

이 방법은 세포 단백질에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만 단백질 상호 작용은 병원체 숙주 상호 작용 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 세포 배양 접시에서 GFP 태그가 지정된 관심 단백질 또는 GFP 제어를 얼음처럼 차가운 PBS로 발현하는 SLAC 라벨링 HEK 2 93 T 세포를 긁기 시작한 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 220배 G로 세포 현탁액을 원심분리하고, 10밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS에서 세포를 3회 더 세척하고, 갓 첨가된 프로테아제 억제제 칵테일을 포함하는 200마이크로리터의 세포 용해 완충액에서 세포 펠렛을 재현탁합니다. 3 개의 X 농도에서 용해 완충액 1 밀리리터 당 5 마이크로 리터의 RNA 칵테일을 첨가하고 5 분 동안 얼음에서 배양합니다. 다음 13, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 G 000 시간에 세포 용해물을 분리기하고 녹는 세포 용해물로 상등액을 유지하십시오.

A BCA assay를 사용하여 세포 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음 프로테아제 억제제를 함유한 용해 완충액을 사용하여 최종 부피 500마이크로리터에서 각 샘플 용해물의 단백질 농도를 정규화합니다. 정규화된 세포 용해물 각각에 1개의 x 프로테아제 억제제 칵테일 3개를 포함하는 500마이크로리터의 희석 완충액을 추가하여 총 부피를 1ml로 조정합니다.

Anti GFP 비드를 준비하는 동안 얼음에 용해물을 유지하고 샘플 입력에 사용할 각 샘플의 50마이크로리터 부분 표본을 유지합니다. 비드 슬러리를 소용돌이쳐 비드를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 끝 컷오프가 있는 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 샘플당 25마이크로리터의 비드를 새 튜브로 옮깁니다.

비드 슬러리의 각 25 마이크로 리터에 대해, 세척하기 위하여 희석 완충액의 20 부피를 추가하고, 5 분 동안 2, 700 시간 G에 구슬을 원심 분리하십시오. 20 부피의 희석 완충액으로 비드를 추가로 세척합니다. 다음으로, 비드 슬러리 25마이크로리터당 100마이크로리터의 희석 버퍼를 추가합니다.

그런 다음 끝 컷오프가 있는 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 85마이크로리터의 재현탁 비드 슬러리를 SLAC 표지된 각 샘플 용해물로 옮깁니다. 샘플이 비드와 함께 배양된 후 2시간 동안 섭씨 4도의 회전기에서 비드로 샘플을 배양하고 섭씨 4도에서 5분 동안 2, 700배 G로 샘플을 원심분리합니다. 50마이크로리터의 상등액을 결합되지 않은 샘플로 유지하고 나머지 상등액을 폐기합니다.

각 튜브의 비드를 1 밀리리터의 희석 완충액에 재현탁 한 다음 섭씨 4 도에서 5 분 동안 2, 700 배 G로 원심 분리합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복하여 비드에서 단백질을 용리시킵니다. 각 샘플에 50마이크로리터의 두 XSDS 로딩 버퍼를 추가하고 섭씨 95도에서 10분 동안 가열합니다.

일단 가열이 끝나면, 2, 700 시간 G에 4 섭씨 온도에 5 분 동안 각 표본을 분리기화하십시오. 상층액을 사전 윤활된 튜브로 옮기고 MS 분석을 위해 제출할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 그런 다음 동일한 부피의 대조군 및 시료 아미노 침전물을 혼합하고 결합된 시료를 lc ms MS 분석을 위해 질량 분석 시설에 제출합니다.

질량 분석 데이터를 분석하기 전에 원시 데이터를 새 스프레드시트에 복사합니다. 그런 다음 이 스프레드시트에서 식별 번호, 고유 펩티드 비율 수, 샘플 비교, 비율 변동성 및 단백질 설명이 포함된 열을 제외한 모든 열을 제거합니다. Excel 정렬 기능을 사용하여 펩타이드 수를 기준으로 데이터를 정렬하고 하나 이상의 펩타이드가 결핍된 단백질에 대한 항목을 제거합니다.

그런 다음 비율별로 정렬하고 SLAC 비율이 없는 단백질을 제거합니다. 다음으로, 슬랙 비율을 변환하여 두 값을 기록합니다. 공식을 사용하면 로그 괄호, SLAC 비율 2 및 괄호와 같으며, 여기서 SLAC 비율은 셀 식별자를 대체합니다.

그런 다음 Excel 파일에 새 열을 만들고 모의 샘플 비율을 샘플 모의 비율로 변환하기 위해 모든 샘플 모의 열에 대해 두 개의 SLAC 비율을 기록합니다. 공식은 1을 비율로 나눈 값과 같습니다. GraphPad 프리즘을 엽니다.

새 데이터 테이블 및 그래프 선택 창의 왼쪽에 있는 목록에서 열을 선택하고 가져오기 데이터 입력을 선택합니다. columns 옵션에 누적된 복제본 값을 입력합니다. 만들기를 누릅니다.

그런 다음 Excel 스프레드시트에서 지정된 log two 샘플 모의 SLAC 비율 열을 선택하여 새 prism 파일에 복사합니다. 그런 다음 드롭다운 삽입 메뉴를 클릭하고 새 분석을 선택합니다. 컬럼 분석에서 빈도 분포를 선택합니다.

기본 옵션을 유지하고 확인을 클릭합니다. 결과 폴더에 새 히스토그램 섹션이 생성되었습니다. 빈도 분포 섹션을 선택한 다음 드롭다운 삽입 메뉴를 클릭하고 새 해석 XY 비선형 회귀 곡선 맞춤을 선택합니다.

Gaussian distribution(가우스 분포)을 클릭하고 OK(확인)를 클릭합니다. 나타나는 결과 창에 평균과 표준 편차가 제공됩니다. Excel 파일의 평균 수익률에 1.96 표준 편차를 추가하여 임계값을 생성합니다.

결합된 레이블 열 A 식별이라는 새 탭을 만들고 각 개별 실험의 모든 등록 번호를 이 단일 열에 복사합니다. 그런 다음 데이터 탭을 선택한 다음 중복 제거 옵션을 선택합니다. 그런 다음 각 실험의 SLAC 비율 및 비율 변동성과 단백질 이름 설명 열에 대한 열을 만듭니다.

설명 탭에서 VLOOKUP 수식을 사용하여 각 식별 번호에 대한 설명을 수집합니다. 수식을 열 아래로 끌어 단백질 설명을 채운 다음 이 수식을 사용하여 개별 실험에서 비율 및 변동성 데이터를 가져옵니다. 결합된 데이터 세트에서 상호 작용하는 단백질을 강조 표시하려면 특정 실험에 대한 임계값을 기록해 둡니다.

비율 열을 선택하고 홈 탭을 클릭합니다. 그런 다음 조건부 서식을 선택하고 셀 규칙을 강조 표시한 다음 더 많은 규칙을 적용한 다음 클래식 형식 선택 스타일은 판매 가치가 크거나 같은 판매만 포함합니다. 상자에 1.96 표준 편차 값을 입력하고 확인을 클릭합니다.

각 양의 교호작용에 대한 비율 변동성을 평가합니다. 백분율 변동성을 빼면 적중률이 임계값 아래로 떨어집니다. 이것은 주의해서 다루어야 합니다.

각 결과 열에 대해 이 작업을 반복하고 두 개 이상의 실험에서 식별된 강조 표시된 단백질이 높은 신뢰도 상호 작용을 나타내는 실험 간에 비교합니다. 웨스턴 블롯 분석은 GFP 태그가 지정된 관심 단백질의 정제를 확인했습니다. 결합된 샘플에 갭 DH 밴드가 없다는 것은 면역침전 단계에 의해 샘플에서 비상호 작용 단백질이 고갈되었음을 나타내는 반면, 이러한 샘플에 EIF 4G 밴드가 존재한다는 것은 알려진 상호 작용 결합 파트너가 유지되었음을 나타냅니다.

확인된 EIF 4개의 A 결합 단백질 중 일부는 두 동형 사이에 보존되었습니다. EIF four A와 상호 작용하는 단백질은 높은 LAC 비율로 식별되는 반면, 이 실험에서 비특이적으로 결합된 단백질은 비율이 0.96 미만입니다. 이 개시 인자 복합체 다이어그램에서 SLAC 아미노 침전 실험에서 확인된 EIF 4개의 A 결합 단백질은 빨간색에서 흰색으로 음영 처리되어 있습니다.

로그 2 SLAC 비율에 따르면, EIF 4 A 1 및 2 복합체의 직접 및 간접 결합 파트너의 높은 적용 범위는 단백질 상호 작용을 식별하기 위한 이 접근 방식의 효과를 보여줍니다.이 절차를 시도하는 동안 단백질 수준의 일부 변동은 데이터 분석 단계에서 보상할 수 있지만 다음과 같은 점을 기억하는 것이 중요합니다. 단백질 투입 수준의 정확한 정상화를 보장하고 세척 단계에서 AROS 비드가 손실되지 않도록 하여 이를 방지할 수 있는 것이 가장 좋습니다.