Name: 유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 학습하세요 FRET 센서를 활용한 생세포 내 글루타민 운반체 활성 실시간 영상화 방법을. 유전자 인코딩된 센서로 단일세포 수준에서 대사 동역학을 정밀 분석하는 기술입니다.

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이 작품은 NIH 교부금 1R21NS064412, NSF 교부금 1,052,048 및 제프리스 기념 트러스트 부여 J-908에 의해 지원되었다.

1. 샘플 준비 주 : 많은 경우 관류 실험 초조 문제가 될 수있는 세포의 상당한 부분을 씻어 흘려. 폴리-L-라이신 모든 세포 라인, 코팅 커버 유리 표면에 (표면에 0.01 % 용액의 1.0 ml/25 cm 2를 추가 할 필요는 없습니다 만, 세포 배양 등급 물로 2 회 세척&gt; 5 분을 배양하고, 건조 생물 안전 캐비닛) 세포 접착을 향상시킵니다. 또한, 사용되는 세포주의 바이오 안전성 레벨 (BSL)을 인식하고, 지역의 환경 보건 및 안전 사무실에서 승인 한 표준 운영 절차를 따르십시오. 이 실험에서, COS7 세포 (도 4 참조)로 인해 낮은 내인성 글루타민 수송 활성에 사용 하였다. <ol><li> 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM) 70-80 % 년 자랄 + 10 % 우주의 혈청과 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 하나 6 자 문화에 배치 멸균 25mm 유리 커버 슬립에 ~에 씨 COS7 세포요리 또는 8 잘 유리 바닥 슬라이드. 37 ° C에서 5 % CO 2, 24 시간 동안 100 % 습도에서 품어. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라, DMEM +10 % 우주의 혈청 (항생제)에 성장 배지를 교환한다. 100 % 습도에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 O / N을 성장. </li><li> (CMV 프로모터 10에서 FLIPQTV3.0 센서를 수행 한 pcDNA3.1) 글루타민 센서와 10 ~ 50 ㎖의 혈청이없는 미디어 (OPTI-MEM) mCherry - 태그 ASCT2를 인코딩 0.4 mg의 플라스미드 DNA를 각각 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 50 ㎖의 혈청이없는 미디어로 형질 전환 시약 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 품어. </li><li> DNA (단계 1.3) 및 형질 전환 시약 (단계 1.4)를 포함하는 두 용액을 혼합하고 20 분 동안 품어. </li><li> 조심스럽게 세포의 상단에 형질 전환 시약을 추가하고 챔버를 흔들어 가볍게 섞는다. 37 ° C에서 5 % CO 2, 100 % 습도에서 24 시간 동안 배양한다. </li><li> 24 시간 후, DMEM + 10 %의 우주 송아지 세럼 매체를 교환페니실린 / 스트렙토 마이신 (CCS) + (100)는 유닛. </li><li> 세포는 48 ~ 72 시간 후 - 형질을 이미지하고 있습니다. </li></ol> 2. 관류 실험 주 :이 실험에서 사용 된 COS7 세포의 경우, 관류 매체와 챔버는 RT로 유지하고 주위 CO 2 농도 하였다. 사용되는 세포가 더 높은 온도와 CO 2 농도 제어 생존 가열 현미경 스테이지 및 / 또는 환경 챔버를 필요로하는 경우에는, 사용되어야한다. <ol><li> 관류 버퍼 AF를 준비 (재료의 목록을 참조하십시오.) , 50 ㎖ 주사기에 콕 마개를 부착 콕 마개를 닫고 다음 관류 솔루션을 입력합니다. 버퍼 크레인의 머리 공간을 채우기 위해 짧은 기간 동안 코크를 엽니 다. </li><li> 관류 연필로 8 채널, 중력 공급 관류 시스템에 전환 한 다음 선택 기능 옵션에서 &quot;수동 모드&quot;를 선택합니다. 재관류 연필에서 폐기물 용기를 놓습니다. </li><li> 수동으로대응하는 숫자를 눌러 포트를 활성화 및 물을 함유하는 10 ㎖ 주사기를 사용하여 호스를 기입하고 포트를 닫는다. 포트가 만수되면 관류 시스템의 포트 1-6에서 버퍼 AF를 함유하는 주사기를 설정하고 스톱 코크를 연다. 버퍼와 튜브에 물을 대체하기 위해 다시 포트를 엽니 다. 유속은 약 0.8 ㎖ / 분이어야한다. </li><li> 눌러 다시 &quot;기능 선택&quot;메뉴로 이동 관류 컨트롤러에 한 번 취소 할 수 있습니다. &quot;편집 프로그램&quot;옵션으로 전환 한 후 관류 프로토콜은 표 1에 입력합니다. 관류 프로그램을 저장합니다. </li><li> 인큐베이터 밖으로 세포를 가져 가라. 관류 버퍼로 두 번 세척 한 후 무대에서 세포를 설정합니다. 챔버에 관류 시스템을 연결합니다. 개방 챔버가 사용되는 경우, 챔버로부터 관류 액을 제거하는 또 다른 펌프를 설치했다. </li><li> Slidebook 소프트웨어를 엽니 다. 새 슬라이드를 시작합니다. 참고 :다음 절차는 Slidebook 소프트웨어에 고유 있지만, 이러한 MetaFluor 및 니스 요소로 다른 소프트웨어는 여기에 설명 된 영상의 종류에 사용할 수 있습니다. 이론적 실험 시간 코스 이미징을 허용하는 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수 있으며, 이미지 시퀀스는 ImageJ에 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) 또는 피지와 같은 소프트웨어를 사용하여 후 실험적으로 분석 할 수있다 (http:/ / fiji.sc / 피지). 그러나, 억 셉터 / 도너 비율의 실시간 모니터링을 허용 소프트웨어는 매우 유용하다. </li><li> 형광 현미경의 무대에 슬라이드를 장착합니다. 적절한 필터 세트를 사용하여 센서와 ASCT - mCherry 공동 발현하는 세포를 찾아 &quot;FOCUS&quot;기능에서 (재료의 목록을 참조하십시오). &quot;카메라&quot;탭을 클릭하고 &quot;이득&quot;에서 슬라이드 막대를 밀어 이득을 조정합니다. 또한, 감광 필터 드롭 다운 메뉴에서 감광 필터 설정을 조정합니다. 참고 : 필터 큐브 아이 필터를 포함하지 않는 경우, 간결시기 눈 조각을 사용하지 않는T 파장의 여기 광은 눈에 해 롭습니다. 대신 세포를 찾기 위해 컴퓨터 화면을 사용합니다. </li><li> 세포의 이미지를 얻기 with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (필터 재료의 목록에 명시되어있다). &quot;이미지 캡처&quot;를 클릭 한 다음 인수 창에서 사용하고자하는 필터를 지정합니다. 필터 설정 옆에있는 상자에 원하는 노출 시간을 입력하여 노출 시간을 조정하는 &quot;TEST&quot;버튼을 클릭합니다. 주 : 모든 세 개의 채널이 동일한 길이에 대해 노출 될 필요가있다. 촬상 파라미터를 조정하면, 예상 FRET 효율 변화를 가지고 고려 증가 겹 : FRET 효율 실험 중에 2 배 갈 것으로 예상되는 경우, 예를 들어, 영상 파라미터는 조정되어야해당 채널이 실험 기간 동안 포화 상태가되지 않도록 정지 상태에서 기증자 전 수락 엠의 강도는, &lt;악기에 의해 기록 될 수있는 최대 값의 50 % 들도록. 표지화 된 세포에서의 신호는 배경 영역에서보다 적어도 세 배 더 높아야한다. </li><li> 소프트웨어의 영역 도구를 사용하여 관심 영역을 그립니다. 대안 적으로, 특정 강도 이상 화소를 선택하는 소프트웨어 기능을 이용할 수 있고, 그 다음 영역으로 변환된다. 이렇게하려면 마스크를 클릭 - 세그먼트 다음 원하는 영역을 강조하는 슬라이드 막대를 이동합니다. </li><li> 캡처 형식 상자에서 &quot;시간 경과&quot;를 선택하고 간격 (이 실험에서는 10 초)하고 실험을위한 시간 지점을 지정합니다. </li><li> 모든 형광 세포없이 지역의 영역을 그립니다. 이 영역은 배경 빼기에 사용됩니다. 마우스 오른쪽 단추로 그린 영역을 클릭 한 다음 배경으로 설정합니다. 참고 : 더 있습니다 이상적으로, 세포를센서를 발현 t는 자기 형광 및 카메라에 의해 검출 배경 개화 모두 고려하여 배경 영역으로 사용되어야한다. 그러한 세포가 시야에 사용할 수없는 경우 세포가없는 적어도 영역은 배경 형광을 고려하여 사용되어야한다. </li><li> 옵션 - &quot;실행 프로그램 기능 선택&quot;에서 원하는 프로그램을 선택합니다. 저장된 프로그램 (단계 2.3 참조)로 전환 한 후 관류 컨트롤러에 입력하고 Enter 키를 누르십시오. 이제 프로그램이로드되고, 임의의 키를 타격하는 재관류를 시작합니다. </li><li> 관류를 확인하고 촬상 실험 관류 컨트롤러 키를 누르는 것과 동시에 캡쳐 윈도우에서 &quot;시작&quot;버튼을 클릭함으로써 동시에 시작한다. 참고 :이 솔루션은 (이것은 인수 탭 내에있는 &quot;주의 사항&quot;기능을 사용하여 수행 할 수 있습니다) 교환 된 평가시기를 기록하는 것이 좋습니다. </li><li> 같은 관류 프로토콜 USI를 수행실험 조건 하에서, 포화 또는 언 바운드가 될 것으로 예상된다 센서를 발현하는 세포를 겨. 참고 : 여기에, 실험 조건 하에서 포화 FLIPQTV3.0_1.5μ는, 제어, 그림 6과 같이 사용되는 이러한 제어 실험은 FRET 효율의 변화가없는 기판의 실제 변화에 기인하고 있음을 확인하기 위해 필요합니다. 때문에 이러한 세포의 pH와 같은 다른 매개 변수의 변화에​​. </li></ol> 3. 후 실험 분석 <ol><li> 샘플 드리프트는 실험 기간 동안 발생했는지 검사합니다. 관심 영역 (ROI)을 그립니다 평가시기 0에서 찍은 이미지들, 그 이미지 창의 상단에있는 슬라이드 막대를 이동하고 세포 실험에서 나중에 촬영 한 이미지의 ROI를 열외하는지 확인합니다. </li><li> 그렇다면, 다음 마스크를 선택하여 세포의 주위에 마스크를 만들고, 처음으로 드리프트를 보정하기 위해 추적 기능을 사용하는 경우 - 세그먼트를, 다음 HIG에 컷오프를 지정하는 라인을 밀어영역이 세포를 포함 hlight. 마스크를 클릭하여 영역을 추적 - 입자 추적 - 기본 입자 추적. </li><li> 필요한 경우 ROI를 다시 그릴과 배경 영역. </li><li> 실험의 과정을 통해 로아의 평균 강도를 보냅니다. 통계를 클릭합니다 - 수출 - 비율 / 인터벌 데이터. </li><li> 기질 농도의 FRET 효율과 정량화가 필요없는 경우, 기판의 역학의 프록시 강도 비 (기증자 전 수락 엠 / 기증 전 기증자 EM)의 시간 과정을 줄거리. 세포질 농도를 결정하기 위해, 최대 및 (각각 기판의 포화 및 부재에서, 즉,,) 최소한의 비율 변화, ΔR 최대 계산 - 다음과 같은 식에 Δratio (ΔR)의 비선형 회귀 분석에 의한 ΔR의 분 : ΔR = [S] / (K d 개 + [S]) × (ΔR <suB&gt; 최대 - ΔR 분) + ΔR 분 여기서 [S] 세포질에서 기질 농도이다. ΔR 최대 사용 - 주어진 ΔR에서 센서의 ΔR의 분 얻은 값, 채도 (S)는 다음과 같이 계산됩니다 S는 = (ΔR - ΔR 분) / (ΔR 최대 - ΔR 분) S는 또한 다음 식을 이용하여 기질 농도 [S]로 전환 될 수있다 : S = [S] / (K d 개 + [S]) 주 : 수락 전 수락 엠 채널의 강도도 실험 조건이 직접 수용체의 형광에 영향을 여부를 검사 그릴 수 있어야합니다. </li><li> 때문에 사진 표백에 대한베이스 라인 드리프트가 관찰 될 때,베이스 라인 보정을 수행합니다. 이렇게하려면, 시간이 지남에 따라 기증자와 수용체의 농도 (그림 5A)을 플롯. 그런 번째 사용 timepoints 식별E 기준선, 관류 시스템 지연과 특정 셀 (도 5b)의 전송 활동에 따라. </li><li> 최고의 기준을 설명하는 다항식 피팅을 계산합니다. 그런 다음,베이스 라인 (그림 5C)로 각각 평가시기에서 원시 강도를 정상화. 정규화 된 기증자와 수용체 강도에서 강도 비 (기증자 전 수락 엠 / 기증 전 기증자 EM)을 계산합니다. </li></ol>

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공개 아무것도 없다.

영상 실험의 성공은 몇 가지 중요한 요소에 따라 달라집니다. 이러한 요인 중 하나는 전술 한 바와 같이, 사용 된 센서의 궁합이다. 또한 세포 내 구획에서 기판의 절대 농도는, 그러나, 종종 알려지지 않았다. 그러므로 우리는 원하는 실험 조건에 따라 가장 적합한을 찾을 수 있도록 지그재그 친화 여러 센서를 시도하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 우리의 경우에 우리는 1.5μ 함께 글루타민 센서를 COS7 세포에 형질 감염, 100μ, 2m, 8m 및 (도 3 및 데이터는 미도시). 또 다른 중요한 요소는 센서 단백질의 발현 수준이다. 수명이 짧은 경우 (예, 단일 활동 전위)보다 높은 발현 수준이 필요 19가 될 수있는 관찰 할 필요가있을 때 검출을 위해 필요한 발현 수준은, 예를 들어, 실험 사이에서 변화한다. 따라서, 대부분의 경우에, 필요한 레벨 empiricall해야y를 결정했다. 타겟 셀에서 매우 낮은 ...

때문에 세포 수준에서의 전 사체와 단백체의 검사를 할 수 있습니다 기술의 놀라운 발전으로, 지금은 생화학 및 대사 물질과 이온의 결과 유출이 높은 셀 타입의 특정 분명되고있다. 예를 들어, 포유 동물의 간장에 순차 글루타민 분해 및 합성 후자 1-3에 과량의 암모니아를 소비하면서 전 셀 분류 우레아주기 암모늄 수유 각각 문맥 주위 세포와 perivenous 세포에 의해 동시에 수행된다. 일부의 경우, 상당한 이질성 생화학 심지어 단일 &quot;셀 분류&quot;4, 5에서 검출된다. 이러한 공간적 특이성 이외에, 대사 물질 및 이온의 세포 수준 (예 : 칼슘 2 + 및시 클릭 뉴클레오티드 같은 신호 분자, 예) 매우 동적이다. 대사와 이온의 시공간 패턴은 종종 신호 전달에 중요한 역할을한다. 엠대사와 이온의 세포 역학을 onitoring 그러나, 독특한 도전을 제기. 많은 경우에있어서 농도 변화는 빠른 과도 같은 돌기 쪽이 6 ~ 20 밀리 초 내에 소멸 칼슘 2 +와 같은 신호 전달 분자의 경우에 의해 예시된다. 또한, 세포 내와 사이 생화학 적 경로의 구획화 어려운 추출 및 컬럼 크로마토 그래피 / 질량 분석 기술을 이용하여 대사 물질 및 이온의 역학을 정량화 할 수있다. 생물학적 분자 유전자 인코딩 된 센서가 널리 인해 실험이 단명 및 / 또는 구획 된 분자 역학 연구 할 수있는 높은 시공간 해상도로 사용됩니다 (7에서 검토를, 8). 이들 유전자에 의해 코딩 센서는 크게 2 종류로 나눌 수있다; 강도 기반 센서 및 센서 ratiometic. 강도 기반 센서는 일반적으로 결합 도메인과 독감으로 구성orescent 단백질 (FPS) 및 결합 도메인에 결합하는 용질은 형광 강도를 변경합니다. Ratiometic 센서는 반면에, 종종 FRET 쌍으로서 기능이 FPS 사이 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 활용. 이러한 센서는 결합 도메인과 두 FPS로 구성하고, 바인딩 용질이 FPS 간의 FRET 효율의 변화를 유도한다. 생물학적으로 중요한 대사 물질 및 이온 용 센서의 다수는 지난 십 (8, 9)에서 개발되었다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 센서들에 의해 제공되는 흥미로운 가능성 중 하나는 이전에 세포 수준에서 검출하기 쉽지 않았다 막 수송 과정의 고해상도 분석에서의 사용이다. 유전자에 의해 코딩 센서는 기질 특이성하여 pH 의존성 (10, 11) 등의 반송기구의 분석을 용이하게한다. 또한, 유전 입술과 함께의 RNAi 라이브러리 모델 생물에 대한 생성 ources 같은, 그것은 유전자에 의해 코딩 센서를 사용하여 새로운 전송 프로세스에 대한 게놈 전체 검색을 수행 할 수있게되었습니다. 실제로, 다수의 경우 12, 13 이전에 uncharacterized 수송의 발견에 유전자 인코딩 센서 리드의 사용. 최근에, 우리의 실험실은 글루타민 FRET 기반 센서의 시리즈를 개발했습니다. 우리는 셀룰러 글루타민 농도는 FRET 글루타민 센서 (10)를 이용하여 가시화 될 수 있다는 것을 증명하고있다. 이 센서는 glnH의 C-말단 (그림 1)에서 세균 글루타민 결합 단백질 glnH에 삽입 된 FRET 기증자 (mTFP1) 및 FRET 수용체 (금성)으로 구성되어 있습니다. 이들 센서의 FRET 효율성 셉터 / 도너 강도 비의 감소의 결과로, 글루타민의 결합시 감소. 글루타민 전송 프로세스의 미세 조정은 neurotransm 같은 생물 학적 과정에 중요ission (14), (15) 및 간 1, 16, 17의 우레아주기의 유지. 여기서 우리는 광 시야 형광 현미경 셋업을 사용하여, 글루타민 FRET 센서로 전송 활동을 분석하는 방법을 보여준다. 여기에 도시 된 실험의 목표는 하나의 셀에 수송 활동을 검출하고 일시적으로 발현 트랜스 포터의 기질 특이성을 검토한다.

<table><tbody><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>다른 공급업체의 동등한 도립 형광 현미경도 적합합니다.</td></tr><tr><td>여기 필터 (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>밴드 폭 450-460 nm</td></tr><tr><td>여기 필터 (금성)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>밴드 폭 490-510 nm</td></tr><tr><td>방출 필터 (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>밴드 폭 475-505 nm</td></tr><tr><td>방출 필터 (금성)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>밴드 폭 520-550 nm</td></tr><tr><td>다이크로익 미러 (FRET 채널)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>긴 통과, 470nm 차단</td></tr><tr><td>이색성 거울(YFP 채널)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td></tr><tr><td>통과 mCherry 필터 세트</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>여기 540-580nm, 585nm 차단된 긴 통과 이색성, 방출 필터 595-695nm</td></tr><tr><td>광원</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>안정적인 광도를 생성하는 LED 또는 할로겐 광원, 수은 램프는 권장되지 않음</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic 형광 대물</td>렌즈 <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>관류 시스템, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>빠른 용액 교환이 가능한 다른 관류 시스템도</td></tr><tr><td>층류 챔버 작동</td><td>씨& L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>다른 larminar-flow 챔버도 작동합니다.</td></tr><tr><td>챔버 슬라이드</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>개방형 챔버 실험용</td></tr><tr><td>관류 펌프</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>개방형 챔버 실험용</td></tr><tr><td>비율계량 측정을 지원하는 소프트웨어</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>층류 생물 안전 캐비닛</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone SV30010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transfection용 무혈청 배지 (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Lipofectamine 2000과 함께 사용</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine 용액</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25mm 원형 유리 커버 슬립</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>VC-MPC-TW를 사용하는 경우</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>다른 transfection 시약도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>용액 A (행크 완충액)</td><td></td><td></td> <td>9.7g 행크 염 (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g Hepes에서 1L, NaOH</td></tr><tr><td>용액 B</td><td></td><td></td><td>용액 A + 0.04 mM Gln</td></tr><tr><td>용액 C</td><td></td><td></td><td>용액 A + 0.2 mM Gln</td></tr><tr><td>용액 D</td><td></td><td></td><td>용액 A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>용액 E</td><td></td><td></td><td>용액 A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>용액 F</td><td></td><td></td><td>용액 A + 5mM Ala</td></tr></tbody></table>

유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 생물학적 분자와 같은 센서의 엄청난 다양성은 많은 실험실에서 일상적으로 사용되는 필수 도구가 된 일부는, 지난 15 년 동안 사용 가능하게되었다. 유전자에 의해 코딩 센서 흥미로운 애플리케이션 중 하나는 셀룰러 전송 프로세스를 조사하고 이러한 센서의 사용이다. 이러한 반응 속도 및 기판 특이성 등의 수송의 속성 수송 활동의 세포 타입 별 분석에 대한 가능성을 제공하는 세포 수준에서 조사 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 수송 역학 예를 들어 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서를 사용하여 관찰 할 수있는 방법을 보여줍니다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석에 대한 고려 사항이 논의 될 것이다.

전형적인 시간 코스 실험 그림 2에 표시됩니다.이 실험에서, 8 개 mm (FLIPQTV3.0_8m, 그림 2A와 2B) 및 100 μM (FlipQTV3.0_100 μ C 및 D)의 친화력과 글루타민 센서를 FRET와 공동으로 표현했다 COS7 세포 (10)의 필수 아미노산 교환기 ASCT2 18. 글루타민의 유입은 도너 (mTFP1) 및 억 셉터 (금성) (도 2A 및 2C) 간의 형광 강도 비의 변화로서 검출된다. 다른 기판 (ALA)의 존재에있는 글루타민의 유출을 명확하게이 실험에서 입증된다. 두 센서를 사용, 표준화 된 형광 강도가 관찰 비율의 변화가 참으로 인해 t 것을 제안 기판의 존재에 (수용체의 강도가, 아래 그림 2B와 2D를 간다 즉, 기증자의 강도가 올라갑니다) 상호 변경FRET 효율의 변화 오. 이러...

이 문서에서는 FRET을 이용하여 살아있는 세포에서 글루타민의 역학을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석을위한 고려 사항은 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서에 대해 설명한다.

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

본 프로시저의 전반적인 목표는 FRET(Förster resonance energy transfer) 센서를 사용하여 살아있는 세포 내에서 이종 발현된 수송체를 통한 글루타민 수송을 이미징하는 것입니다. 이는 먼저 COS-7 세포에 글루타민 센서와 수송체를 형질전환함으로써 수행됩니다. 이 센서는 박테리아 글루타민 결합 단백질에 삽입된 FRET 도너와 글루타민 결합 단백질의 C-말단에 위치한 FRET 억셉터로 구성됩니다.두 번째 단계는 관류 시스템을 구축하고 도립 형광 현미경을 사용하여 세포를 실시간으로 이미징하는 것입니다. 마지막 단계는 이미지를 분석하고 글루타민 역학을 시각화하는 것입니다. 최종적으로, 이러한 fret 센서를 사용하여 단일 세포 내의 운반체 활성을 검출할 수 있습니다.크로마토그래피 기반 측정과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 훨씬 더 높은 시공간 해상도를 얻을 수 있다는 점입니다. 이 기술은 센서 단백질을 이용한 세포 형질전환, 실시간 이미징, 그리고 실험 후 분석의 세 부분으로 구성됩니다. 이 실험에서는 내인성 글루타민 수송 활성이 낮기 때문에 Seven cells가 사용됩니다.10% cosmic calf serum(CCS)과 100 units/mL의 Penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM을 사용하여, 8-well glass bottom dish에 세포를 약 70~80% 밀도로 파종합니다. 37°C, 5% CO₂,\ 100% 습도 조건에서 24시간 동안 배양합니다.24시간 후, 성장 배지를 항생제가 없는 10% CCS 함유 DMEM으로 교체하고 37°C, 5% CO2, 100% 습도 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. transfection 당일에 glutamine sensor를 인코딩하는 plasma DNA와 태그가 붙은 필수 아미노산 교환체 m cherry A SCT 2를 각각 0.4 µg씩 50 µL의 무혈청 배지에 첨가합니다.트랜스펙션 시약을 1 µL 취하여 50 µL의 무혈청 배지에 넣고 가볍게 혼합한 후, 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, DNA가 포함된 용액을 희석된 트랜스펙션 시약과 혼합하고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 20분 후, 트랜스펙션 시약 혼합물을 cost seven 세포 위에 천천히 가하고 챔버를 흔들어 가볍게 혼합합니다.37°C, 5% CO2, 100% 습도 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 배지를 10% CCS와 100 units의 penicillin streptomycin이 첨가된 DMEM으로 교체합니다. 관류를 시작하기 전 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다.동봉된 원고의 레시피에 따라 관류 버퍼 A부터 F까지 준비합니다. 50 milliliter 주사기에 스톱콕을 연결합니다. 스톱콕을 잠그고 주사기에 관류 용액을 채웁니다.스톱콕의 헤드스페이스를 버퍼로 채우기 위해 스톱콕을 잠시 엽니다. 그다음, 퍼퓨전 펜슬이 연결된 8채널 중력 공급 퍼퓨전 시스템의 전원을 켜고 수동 모드를 선택합니다.선택 함수 옵션에서, 관류 펜슬 아래에 폐액 용기를 배치하십시오. 본 실험의 성공을 위해서는 드리프트와 용액 전이(carry over)를 최소화하는 방식으로 관류 시스템을 설정하는 것이 중요합니다.해당 번호를 눌러 포트를 수동으로 활성화하고 튜빙에 물을 채웁니다. 10 milliliter 주사기를 사용하여 포트를 닫고, buffer A부터 F가 담긴 주사기를 관류 시스템의 1번부터 6번 포트에 장착한 후 스톱콕을 엽니다. 그 후.포트를 다시 열어 튜브 내의 물을 버퍼로 교체합니다. 유속은 분당 약 0.8 milliliters여야 합니다. 퍼퓨전 컨트롤러의 취소 버튼을 한 번 눌러 기능 선택 메뉴로 돌아갑니다.프로그램 편집 옵션으로 전환한 다음, 이 표에 표시된 관류 프로토콜을 입력하십시오. 관류 프로그램을 저장합니다. 세포는 형질전환 후 48~72시간 후에 이미징합니다.세포가 씻겨 내려가지 않도록 주의하며 유리 바닥 디쉬의 웰을 관류 버퍼 A로 두 번 세척합니다. 유리 바닥 디쉬를 형광 현미경의 스테이지 위에 올립니다. 관류 시스템을 챔버에 연결합니다.개방형 챔버를 사용하는 경우, 챔버에서 관류액을 제거하는 별도의 펌프를 설치하십시오. 슬라이드 북 이미징 소프트웨어를 실행하십시오. 초점 기능을 사용하여 새 슬라이드를 시작하고, 적절한 필터 세트를 사용하여 센서와 A SCT two M cherry를 함께 발현하는 세포를 찾으십시오.카메라 탭을 클릭하고 gain 아래의 슬라이드 바를 움직여 gain을 조정하십시오. 또한, neutral density filter 드롭다운 메뉴에서 neutral density filter 설정을 조정하십시오. image capture를 클릭한 다음, 획득 창에서 사용할 필터를 지정하십시오.이미지는 세 가지 채널에서 획득합니다. 공여체 들뜸-공여체 방출, 수용체 들뜸-수용체 방출 및 공여체 들뜸-수용체 방출입니다. 테스트 버튼을 클릭하고 필터 설정 옆의 상자에 원하는 노출 시간을 입력하여 노출 시간을 조정하십시오. 세 채널 모두 동일한 시간 동안 노출되어야 합니다.영역 도구를 사용하여 관심 영역을 지정하십시오. 캡처 유형 상자에서 타임랩스를 선택하십시오. 그런 다음 실험의 간격과 시점을 지정하십시오.다음으로, 배경 감산에 사용할 형광 세포가 없는 영역을 지정합니다. 지정한 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 후 배경으로 설정합니다. 카메라에 의해 검출되는 자가 형광과 배경 형광을 모두 고려하기 위해, 이상적으로는 센서를 발현하지 않는 세포를 배경 영역으로 사용해야 합니다.select function run programs 옵션에서 원하는 프로그램을 선택하고, 저장된 프로그램으로 전환한 다음 퍼퓨전 컨트롤러의 enter 키를 누릅니다. 이제 프로그램이 로드되었으며, 아무 키나 누르면 퍼퓨전이 시작되어 퍼퓨전과 이미징 실험이 동시에 시작되도록 할 수 있습니다. 퍼퓨전 컨트롤러의 키를 누름과 동시에 캡처 창의 시작 버튼을 클릭하십시오.여기에는 8 mM 및 100 µM의 친화도를 가진 ASCT2 운반체와 FRET 글루타민 센서를 공동 발현하는 세포를 이용한 전형적인 시간 경과 실험 결과가 제시되어 있습니다. 글루타민의 유입은 공여체인 mTurquoise2와 수용체인 Venus 사이의 형광 강도 비율 변화로 검출됩니다. 또한 알라닌 존재 하에서의 글루타민 유입을 통해 기질 경쟁이 입증되었습니다.센서를 사용하여 수송체의 특이성을 확인할 수도 있습니다. 본 실험에서는 세포에 글루타민을 미리 로딩한 후, 세포 외 관류액에 다양한 아미노산을 첨가하였습니다. 예상대로 8가지의 Act2 기질은 글루타민 flux를 유도한 반면, 비기질 아미노산은 유도하지 않았습니다.기질 첨가 시 FRET 효율 변화가 나타나지 않는 것은 8mM 센서 또는 100µM 센서를 발현하는 세포에서 나타난 것처럼 테스트 대상 기질에 대한 흡수 능력이 낮기 때문일 수 있습니다. 하지만 FRET 효율 변화가 다른 파라미터의 변화가 아닌 실제 기질의 변화로 인한 것임을 확인하기 위해 sCT2 수송체를 발현하지 않는 세포를 사용합니다. 동일한 관류 프로토콜을 실험 조건 하에서 포화될 것으로 예상되는 센서를 발현하는 세포를 사용하여 수행합니다.이 예시에서 센서의 친화도는 1.5 µM입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 FRET 센서를 사용하여 대사물질의 역동성을 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 노출 위험을 최소화할 수 있도록 세포 배양은 표준 작업 절차에 따라 적절하게 처리해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 단일 피질 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소를 평가하는 방법을 보여줍니다. 전기 자극은 시냅스에서 글루타메이트 방출을 촉진합니다. 방출된 글루타메이트는 시간이 지남에 따라 감소하는 센서 단백질의 형광을 변경하여 방출 및 제거 효율을 나타냅니다.

Analyzing the Glutamate Release and clearance at a single neuroron synapse(마우스 뇌 절편의 단일 뉴런 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소)

현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.

글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)는 첫 번째 포스터 공명 에너지 전송 기반 바이오 센서 측정 지 베 렐 린 phytohormones spatiotemporal 고해상도 세포 수준 이다. 이 프로토콜은 시각화 하 고 애기 hypocotyls 및 루트 팁 유전자 인코딩된 nlsGPS1 바이오 센서를 사용 하 여 셀룰러 지 베 렐 린 레벨 계량 방법에 보고 합니다.

머릿속 세포 지 베 렐 린 레벨 NlsGPS1 포스터 공명 에너지를 사용 하 여 전송 (무서 워) 바이오 센서

세포외 글루타메이트 트리거 전신 칼슘 신호는 식물의 기계적 상처 및 초식 공격에 대한 식물 방어 대응의 유도에 매우 중요합니다. 이 문서에서는 칼슘과 글루타민염에 민감한 형광 바이오 센서를 표현하는 아라비도시스 탈리아나 식물을 사용하여 이러한 두 요인의 공간 적 및 측두동을 시각화하는 방법을 설명합니다.

아라비도시스에서 지역 및 전신 상처 신호의 넓은 필드, 실시간 이미징

포도당 섭취량은 FRET 기반의 유전자 인코딩 된 포도당 센서에 의해 표시된 바와 같이 TAR DNA 결합 단백질 (TDP-43) 단백질 병증에 의해 영향을받는 Drosophila 운동 뉴런에서 증가합니다.

TDP-43 단백질 요법의 드로소필라 모델에서 포도당 섭취 측정

이 문서는 공초점 살아있는 현미경 검사를 사용하여 1 차해 및 피질 뉴런에 있는 급성 동요에 기초 redox 상태 및 redox 반응에 있는 다름을 결정하는 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 최소한의 수정으로 다른 세포 유형 및 현미경에 적용 될 수 있습니다.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

학습하세요 FRET 센서를 활용한 생세포 내 글루타민 운반체 활성 실시간 영상화 방법을. 유전자 인코딩된 센서로 단일세포 수준에서 대사 동역학을 정밀 분석하는 기술입니다.

유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

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