유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

이 절차의 전반적인 목표는 1차 공명 에너지 전달 또는 프렛 센서를 사용하여 살아있는 세포에서 이종 발현 수송체를 통해 글루타민 수송을 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 글루타민 센서와 수송체를 가진 7개의 세포를 transection함으로써 달성됩니다. 이 센서는 박테리아 글루타민 결합 단백질에 삽입된 프렛 공여체(fret donor)와 글루타민 결합 단백질의 C 말단에 있는 프렛 수용체(fret acceptor)로 구성됩니다.

두 번째 단계는 관류 시스템을 설정하고 도립 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 세포를 이미지화하는 것입니다. 마지막 단계는 이미지를 분석하고 글루타민 역학을 시각화하는 것입니다. 궁극적으로 단일 셀의 수송체 활동은 이러한 프렛 센서를 사용하여 감지할 수 있습니다.

크로마토그래피 기반 측정과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 훨씬 더 높은 공간 시간 분해능을 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술은 센서 단백질을 사용한 세포의 transfection, 실시간 이미징 및 실험 후 분석 비용의 세 부분으로 구성됩니다. 이 실험에는 7개의 세포가 낮은 내인성 글루타민 수송 활성으로 인해 사용됩니다.

DMEM에서 약 70-80%의 co-fluency와 10%의 cosmic calf serum 또는 CCS 및 밀리리터당 100 단위의 세포를 파종합니다. 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin)은 여덟 개의 유리 바닥 접시에 들어 있습니다. 섭씨 37도, 5%CO2, 100% 습도에서 24시간 동안 배양합니다.

24시간 후. 성장 배지를 DMEM과 항생제가 없는 10% CCS로 교체하면 transfection 당일 섭씨 37도, 5%CO2 100% 습도에서 밤새 성장합니다. 글루타민 센서를 인코딩하는 혈장 DNA를 각각 0.4마이크로그램씩 첨가하고, 필수 아미노산 교환기 m cherry A SCT 2-50마이크로리터의 무혈청 배지를 추가합니다.

50마이크로리터의 무혈청 배지 혼합물에 1마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 부드럽게 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, DNA가 포함된 용액을 희석된 형질주입 시약과 혼합하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 20분 후, 비용 7개 세포 위에 형질주입 시약 혼합물을 부드럽게 첨가하고 챔버를 흔들어 부드럽게 혼합합니다.

24시간 후 섭씨 37도, CO2 5%, 습도 100%에서 24시간 동안 배양합니다. 배지를 DMEM과 10%CCS와 페니실린 스트렙토마이신 100단위로 교체합니다. 관류를 시작하기 전에 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.

함께 제공된 원고의 레시피에 따라 관류 완충액 A에서 F를 준비합니다. 스톱 콕스를 50밀리리터 주사기에 부착합니다. 스톱 콕을 닫고 주사기에 관류 용액을 채웁니다.

스톱 콕을 잠시 동안 열어 스톱 콕의 헤드 스페이스를 버퍼로 채웁니다. 다음으로 8채널 중력을 켭니다. 관류 펜슬로 관류 시스템을 공급하고 수동 모드를 선택합니다.

기능 선택 옵션 아래에서. 관류 연필 아래에 쓰레기통을 놓습니다. 이 실험의 성공을 위해서는 드리프트와 용액 전달을 최소화하는 방식으로 관류를 설정하는 것이 중요합니다.

해당 숫자를 눌러 포트를 수동으로 활성화하고 튜브에 물을 채웁니다. 10밀리리터 주사기를 사용하여 포트를 닫고, 버퍼 A에서 F를 포함하는 주사기를 관류 시스템의 포트 1에서 6까지 설정한 다음 스톱 콕을 엽니다. 그 후.

포트를 다시 열어 튜브의 물을 버퍼로 교체하십시오. 유속은 분당 약 0.8밀리리터여야 합니다. 관류 컨트롤러에서 취소를 한 번 눌러 기능 선택 메뉴로 돌아갑니다.

edit program 옵션으로 전환한 다음 이 표에 표시된 관류 프로토콜을 입력합니다. 관류 프로그램을 저장합니다. 세포는 transfection 후 48-72시간 후에 이미지화됩니다.

유리 바닥 접시의 우물을 관류 완충액 A로 두 번 씻고 세포가 씻겨 나가지 않도록 주의하십시오. 유리 바닥 접시를 무대에 놓습니다.tage 형광 현미경의. 관류 시스템을 챔버에 연결합니다.

개방형 챔버를 사용하는 경우 챔버에서 관류 용액을 제거하는 다른 펌프를 설정합니다. 슬라이드 북 이미징 소프트웨어를 엽니다. 초점 기능을 사용하여 새 슬라이드를 시작하고 적절한 필터 세트를 사용하여 센서와 A SCT two M cherry를 발현하는 세포 coex를 찾습니다.

카메라 탭을 클릭하고 슬라이드 바를 게인 아래로 밀어 게인을 조정합니다. 또한 중립 밀도 필터 드롭다운 메뉴에서 중립 밀도 필터 설정을 조정합니다. 이미지 캡처를 클릭한 다음 획득 창에서 사용할 필터를 지정합니다.

이미지는 3개의 채널로 획득됩니다. 기증자 흥분, 기증자 방출 기증자 흥분, 수용 임무 및 수용자 흥분 수용 임무. 테스트 버튼을 클릭하여 필터 설정 옆의 상자에 원하는 노출 시간을 입력하여 노출 시간을 조정하면 세 채널이 모두 동일한 시간 동안 노출되어야 합니다.

지역 도구를 사용하여 관심 영역을 그립니다. 캡처 유형 상자에서 타임랩스를 선택합니다. 그런 다음 실험의 간격과 시간 지점을 지정합니다.

다음으로, 배경 빼기에 사용할 형광 세포가 없는 영역에 영역을 그립니다. 그려진 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 배경으로 설정합니다. 이상적으로는 센서를 발현하지 않는 세포를 카메라가 감지한 자가형광과 배경 형광을 모두 설명하기 위한 배경 영역으로 사용해야 합니다.

select function run programs 옵션에서 원하는 프로그램을 선택하고 저장된 프로그램으로 전환한 다음 관류 컨트롤러에서 Enter 키를 누릅니다. 이제 프로그램이 로드되고 아무 키나 누르면 관류가 시작되어 관류와 이미징 실험이 동시에 시작되도록 합니다. 캡처 창에서 시작 버튼을 클릭하는 동시에 관류 컨트롤러의 키를 누릅니다.

여기에 표시된 것은 8밀리몰 및 100마이크로몰의 친화도를 가진 a s CT 2개의 수송체 및 프렛 글루타민 센서를 발현하는 세포 coex를 사용하는 일반적인 시간 경과 실험입니다. 글루타민의 유입은 donor mtfp one과 acceptor Venus 사이의 형광 강도 비율의 변화로 검출됩니다. 알라닌의 존재 하에서 글루타민의 유입은 또한 입증된 기질입니다.

센서를 사용하여 운송기의 특이성도 검사할 수 있습니다. 여기서, 세포에 글루타민이 미리 적재된 다음 다양한 아미노산을 세포 외 관류에 첨가했습니다. 예상대로 8 A ct 2 기질은 글루타민 flx를 유도 한 반면, 비 기질 아미노산은 그렇지 않았다.

기질 추가 시 프렛 효율 변화가 없는 것은 8 밀리몰 센서 또는 100 마이크로몰 센서를 발현하는 셀에서 볼 수 있듯이 테스트 중인 기질에 대한 낮은 흡수 용량과 같은 여러 가지 이유 때문일 수 있습니다. 그러나 이는 프렛 효율 변화가 다른 파라미터의 변화가 아니라 기판의 실제 변경에 기인한다는 것을 확인하기 위해 a s CT 2 수송기를 표현하지 않습니다. 동일한 관류 프로토콜은 실험 조건에서 포화될 것으로 예상되는 센서를 발현하는 세포를 사용하여 수행됩니다.

그리고 이 예에서 센서의 친화도는 1.5마이크로몰입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 프렛 센서를 사용하여 대사 산물의 역학을 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 세포 배양은 노출 위험을 최소화하기 위해 표준 운영 절차에 따라 적절하게 처리되어야 한다는 것을 잊지 마십시오.