유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

본 프로시저의 전반적인 목표는 FRET(Förster resonance energy transfer) 센서를 사용하여 살아있는 세포 내에서 이종 발현된 수송체를 통한 글루타민 수송을 이미징하는 것입니다. 이는 먼저 COS-7 세포에 글루타민 센서와 수송체를 형질전환함으로써 수행됩니다. 이 센서는 박테리아 글루타민 결합 단백질에 삽입된 FRET 도너와 글루타민 결합 단백질의 C-말단에 위치한 FRET 억셉터로 구성됩니다.

두 번째 단계는 관류 시스템을 구축하고 도립 형광 현미경을 사용하여 세포를 실시간으로 이미징하는 것입니다. 마지막 단계는 이미지를 분석하고 글루타민 역학을 시각화하는 것입니다. 최종적으로, 이러한 fret 센서를 사용하여 단일 세포 내의 운반체 활성을 검출할 수 있습니다.

크로마토그래피 기반 측정과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 훨씬 더 높은 시공간 해상도를 얻을 수 있다는 점입니다. 이 기술은 센서 단백질을 이용한 세포 형질전환, 실시간 이미징, 그리고 실험 후 분석의 세 부분으로 구성됩니다. 이 실험에서는 내인성 글루타민 수송 활성이 낮기 때문에 Seven cells가 사용됩니다.

10% cosmic calf serum(CCS)과 100 units/mL의 Penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM을 사용하여, 8-well glass bottom dish에 세포를 약 70~80% 밀도로 파종합니다. 37°C, 5% CO₂,\ 100% 습도 조건에서 24시간 동안 배양합니다.

24시간 후, 성장 배지를 항생제가 없는 10% CCS 함유 DMEM으로 교체하고 37°C, 5% CO2, 100% 습도 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. transfection 당일에 glutamine sensor를 인코딩하는 plasma DNA와 태그가 붙은 필수 아미노산 교환체 m cherry A SCT 2를 각각 0.4 µg씩 50 µL의 무혈청 배지에 첨가합니다.

트랜스펙션 시약을 1 µL 취하여 50 µL의 무혈청 배지에 넣고 가볍게 혼합한 후, 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, DNA가 포함된 용액을 희석된 트랜스펙션 시약과 혼합하고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 20분 후, 트랜스펙션 시약 혼합물을 cost seven 세포 위에 천천히 가하고 챔버를 흔들어 가볍게 혼합합니다.

37°C, 5% CO2, 100% 습도 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 배지를 10% CCS와 100 units의 penicillin streptomycin이 첨가된 DMEM으로 교체합니다. 관류를 시작하기 전 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다.

동봉된 원고의 레시피에 따라 관류 버퍼 A부터 F까지 준비합니다. 50 milliliter 주사기에 스톱콕을 연결합니다. 스톱콕을 잠그고 주사기에 관류 용액을 채웁니다.

스톱콕의 헤드스페이스를 버퍼로 채우기 위해 스톱콕을 잠시 엽니다. 그다음, 퍼퓨전 펜슬이 연결된 8채널 중력 공급 퍼퓨전 시스템의 전원을 켜고 수동 모드를 선택합니다.

선택 함수 옵션에서, 관류 펜슬 아래에 폐액 용기를 배치하십시오. 본 실험의 성공을 위해서는 드리프트와 용액 전이(carry over)를 최소화하는 방식으로 관류 시스템을 설정하는 것이 중요합니다.

해당 번호를 눌러 포트를 수동으로 활성화하고 튜빙에 물을 채웁니다. 10 milliliter 주사기를 사용하여 포트를 닫고, buffer A부터 F가 담긴 주사기를 관류 시스템의 1번부터 6번 포트에 장착한 후 스톱콕을 엽니다. 그 후.

포트를 다시 열어 튜브 내의 물을 버퍼로 교체합니다. 유속은 분당 약 0.8 milliliters여야 합니다. 퍼퓨전 컨트롤러의 취소 버튼을 한 번 눌러 기능 선택 메뉴로 돌아갑니다.

프로그램 편집 옵션으로 전환한 다음, 이 표에 표시된 관류 프로토콜을 입력하십시오. 관류 프로그램을 저장합니다. 세포는 형질전환 후 48~72시간 후에 이미징합니다.

세포가 씻겨 내려가지 않도록 주의하며 유리 바닥 디쉬의 웰을 관류 버퍼 A로 두 번 세척합니다. 유리 바닥 디쉬를 형광 현미경의 스테이지 위에 올립니다. 관류 시스템을 챔버에 연결합니다.

개방형 챔버를 사용하는 경우, 챔버에서 관류액을 제거하는 별도의 펌프를 설치하십시오. 슬라이드 북 이미징 소프트웨어를 실행하십시오. 초점 기능을 사용하여 새 슬라이드를 시작하고, 적절한 필터 세트를 사용하여 센서와 A SCT two M cherry를 함께 발현하는 세포를 찾으십시오.

카메라 탭을 클릭하고 gain 아래의 슬라이드 바를 움직여 gain을 조정하십시오. 또한, neutral density filter 드롭다운 메뉴에서 neutral density filter 설정을 조정하십시오. image capture를 클릭한 다음, 획득 창에서 사용할 필터를 지정하십시오.

이미지는 세 가지 채널에서 획득합니다. 공여체 들뜸-공여체 방출, 수용체 들뜸-수용체 방출 및 공여체 들뜸-수용체 방출입니다. 테스트 버튼을 클릭하고 필터 설정 옆의 상자에 원하는 노출 시간을 입력하여 노출 시간을 조정하십시오. 세 채널 모두 동일한 시간 동안 노출되어야 합니다.

영역 도구를 사용하여 관심 영역을 지정하십시오. 캡처 유형 상자에서 타임랩스를 선택하십시오. 그런 다음 실험의 간격과 시점을 지정하십시오.

다음으로, 배경 감산에 사용할 형광 세포가 없는 영역을 지정합니다. 지정한 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 후 배경으로 설정합니다. 카메라에 의해 검출되는 자가 형광과 배경 형광을 모두 고려하기 위해, 이상적으로는 센서를 발현하지 않는 세포를 배경 영역으로 사용해야 합니다.

select function run programs 옵션에서 원하는 프로그램을 선택하고, 저장된 프로그램으로 전환한 다음 퍼퓨전 컨트롤러의 enter 키를 누릅니다. 이제 프로그램이 로드되었으며, 아무 키나 누르면 퍼퓨전이 시작되어 퍼퓨전과 이미징 실험이 동시에 시작되도록 할 수 있습니다. 퍼퓨전 컨트롤러의 키를 누름과 동시에 캡처 창의 시작 버튼을 클릭하십시오.

여기에는 8 mM 및 100 µM의 친화도를 가진 ASCT2 운반체와 FRET 글루타민 센서를 공동 발현하는 세포를 이용한 전형적인 시간 경과 실험 결과가 제시되어 있습니다. 글루타민의 유입은 공여체인 mTurquoise2와 수용체인 Venus 사이의 형광 강도 비율 변화로 검출됩니다. 또한 알라닌 존재 하에서의 글루타민 유입을 통해 기질 경쟁이 입증되었습니다.

센서를 사용하여 수송체의 특이성을 확인할 수도 있습니다. 본 실험에서는 세포에 글루타민을 미리 로딩한 후, 세포 외 관류액에 다양한 아미노산을 첨가하였습니다. 예상대로 8가지의 Act2 기질은 글루타민 flux를 유도한 반면, 비기질 아미노산은 유도하지 않았습니다.

기질 첨가 시 FRET 효율 변화가 나타나지 않는 것은 8mM 센서 또는 100µM 센서를 발현하는 세포에서 나타난 것처럼 테스트 대상 기질에 대한 흡수 능력이 낮기 때문일 수 있습니다. 하지만 FRET 효율 변화가 다른 파라미터의 변화가 아닌 실제 기질의 변화로 인한 것임을 확인하기 위해 sCT2 수송체를 발현하지 않는 세포를 사용합니다. 동일한 관류 프로토콜을 실험 조건 하에서 포화될 것으로 예상되는 센서를 발현하는 세포를 사용하여 수행합니다.

이 예시에서 센서의 친화도는 1.5 µM입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 FRET 센서를 사용하여 대사물질의 역동성을 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 노출 위험을 최소화할 수 있도록 세포 배양은 표준 작업 절차에 따라 적절하게 처리해야 함을 잊지 마십시오.