Name: 에 의해 제작 상피 손상의 분석 Entamoeba 아메바 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 학습하세요 Entamoeba histolytica 감염 시 상피 세포의 tight junction 해체 메커니즘을 면역형광법과 전기저항 측정으로 분석하는 방법을. 이 기법은 아메바증 병원성 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 연방 관구 과학 기술 연구소 (ICyTDF, 64/2012 to EO)와 멕시코 과학 기술 협의회 (Conacyt, 179895 to MS)의 보조금으로 지원되었습니다.

E. 1. 구축 및 유지 아메바 문화 <ol><li> (다른 오염 생물의 전체 무료) axenically 성장 Entamoeba 아메바 균주 HML의 1 × 10 5 trophozoites : IMSS는 테프론 라이너 스크류 캡 (또는있는 일회용 T-1 × 10 6 trophozoites와 18 125 X 16 MM 문화 튜브를 복제 25 플라스크) 15 ㎖ (또는 TYI-S-33 매체의 T-25 플라스크에 50 ㎖) (TYI 국물이 3 % 다이아몬드 비타민 혼합물, 10 %의 열 불 활성화 성인 소 혈청, 0.5 IU / ㎖ 페니실린, 35 μg로 보충 / ㎖, 37 ℃에서 인큐베이터에 스트렙토 마이신) 19 </li><li> 48-96 시간 간격으로 통상 대수 증식기 유리 배양 관에 부착 trophozoites를 해제 빙수 욕에서 50-10 분 동안 배양 튜브 얌전 순서 (도 1) 동안 수확 trophozoites. </li><li> 원뿔 튜브에 문화를 전송하고 CEL을 분산하도록 여러 번 반전LS. 혈구 (Neubauer의 챔버)를 사용하여 세포 수를 결정하고 신선한 TYI-S-33의 매체를 포함하는 문화 튜브에 접종을 전송합니다. <ol><li> 더 이상 부화 기간 (~ 5 일 동안 ~ 3 × 10 5 세포) 짧은 기간 동안 높은 숫자 (1 ~ 하루 ~ 1 × 10 6 세포)에 아메바의 낮은 숫자를 사용합니다. 계산 접종이 바람직하지만 접종의 예상 볼륨이 실현되도록 ​​수립 문화가 예측된다. </li><li> 각 실험에 대한 세포 수를 최적화하는 trophozoites의 양을 적정한다. </li><li> 부주의로 오염이나 튜브 파손의 경우 백업을 가지고 병렬 중복 문화를 유지한다. </li></ol></li><li> 캡 튜브는 단단하고 수평 각도를 기울이면 5 °에서 37 ° C에서 그들을 품어. </li><li> 문화의 과도한 성장이 많은 용해 세포를 포함 할 수 있기 때문에, 정기적으로 육안 검사에 의해 문화를 확인합니다. </li></ol> MDCK 문화 2. 구축 및 유지 &lt;/ P&gt; <ol><li> (Madin 다비 송곳니 신장) 세포 / 0.08 U (인슐린, 페니실린 (100 IU / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎎ / ㎖)와 보충 DMEM 매체 10 ㎖로 처분 할 수있는 T-75 플라스크에 I (고 저항)를 입력 MDCK 성장 37 ° C에서 5 % CO 2, 95 % 공기의 가습 분위기 ㎖)과 10 %의 신생아 혈청 </li><li> 셀을 분할하려면, 거꾸로 현미경에 그 (것)들을 검사한다. 그들은 ~ 8​​5-100% 합류 할 때 셀을 분할합니다. </li><li> 멸균 후드와 문화에서 미디어를 제거하는 멸균 유리 파스퇴르 피펫에 진공 흡입기를 사용합니다. 세포를 긁어 피하려면, 하단 모서리에서 거꾸로 플라스크 대기음 미디어를 켭니다. </li><li> T-25 플라스크의 경우 (5 ㎖ T-75 플라스크에 데워진 PBS (140 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4, 산도 7.4) 10 ㎖를 분배 ) 부드럽게 세포를 씻어 플라스크 바위. 진공 흡인에 의해 PBS를 제거합니다. 혈청, 트립신을 억제하기 때문에 광범위한 세척이 필요합니다. </li><li> (T-25 플라스크에 0.5 ㎖를 사용)과 부드럽게 트립신 전지 층을 덮도록 플라스크를 흔들 T-75 플라스크에 0.05 % 트립신 1.5ml의 디스펜스. </li><li> 인큐베이터에서 5 ~ 10 분 (정확한 시간은 트립신의 활동에 따라 다름)에 품어. </li><li> 빛에 술병을 들고으로 전지의 분리를 확인하고 세포를 흐르는 찾는다. 세포 분리 (반올림 세포)도 현미경을 사용하여 확인할 수 있습니다. 종종 세포가 플라스크의 측면에 빠르고 부드러운 때리고과 빠른 놓습니다. </li><li> T-75 플라스크 (T-25 플라스크에 대한 5 ㎖)을 보충 DMEM 15 ML을 추가합니다. 로 pipetting 아래로 4 ~ 5 배 세포를 Resuspend. </li><li> 세포를 전파하기 위해, 신선한 DMEM 배지와 세포 현탁액 1:5 희석. 세포 수는 혈구 계를 사용하여이 지점에서 결정될 수 있지만, 특정 분석을위한 특별한 형식으로 세포를 분리하는 경우이 보통 단지 필요하다. </li></ol> Trophozoite 총 해물 3. 준비 <ol><li> CU에서 trophozoites를 분리빙수 욕에서 5-10 분 동안 튜브를 얌전 의해 LTURE 튜브. 4 ℃에서 10 분 동안 360 XG에서 원뿔 튜브와 원심 분리기로 문화 무균 이동 조심스럽게, 경사 분리하여 상층 액을 버린다 펠릿에 얼음처럼 차가운 PBS를 추가, 10 분 동안 360 XG에서 다시 세포와 원심 분리기를 분산하기 위해 튜브를 여러 번 반전. TYI-S-33 매체의 모든 흔적을 제거하기 위해 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 trophozoites 번호를 확인합니다. </li><li> 를 Lyse 동결 해동 사이클에 의해 trophozoites. 1 분 동안 액체 질소에, 얼음처럼 차가운 PBS에 희석 trophozoites의 측정 접종 (60 trophozoites / ㎖)를 스냅 동결. 적극적으로 4 ° C와 소용돌이에서 샘플을 녹여. 세포 용해를 완료하기 위해 동결 융해 3 번 반복합니다. </li><li> 0.02 %의 β-머 캅토 에탄올로 용해 액에 존재하는 단백질 분해 효소를 활성화합니다. </li></ol> Trophozoite 분비 제품 4. 준비 <ol><li> 단계 3.2에 3.1를 수행합니다. </li><li> 결정혈구를 사용하고 트리 판 블루 배제 테스트 (20)를 적용하는 시점에서 세포 수 및 생존력 : <ol><li> 50 ML 원뿔 관에 9 × 10 6 3 ML 얼음처럼 차가운 PBS에 trophozoites 및 전송 세포를 희석. 현탁액의 10 μl를 타고 0.4 % 트리 판 블루 stock 용액의 pH 7.2의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 낮은 배율로 세포를 계산하는 Neubauer의 챔버를 사용합니다. </li><li> 모든 셀을 계산하고 푸른 세포가 색소를 촬영하고 죽은 것으로 간주해야하기 때문에, 파란색 셀의 수를 구분합니다. </li><li> 셀의 전체 개수에 의해 생존 세포의 수를 나누어 100을 곱함으로써 생존 세포의 백분율을 계산한다. </li></ol></li><li> 수평 각도를 기울이면 5 °에서 2 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 trophozoite 서스펜션을 포함하는 원뿔 튜브를 전송합니다. </li><li> 10 분 360 XG에서 분비 된 제품, 원심 분리기 튜브를 수집합니다. 일회용 멸균 주사기를 사용하여 조심스럽게 SU에게 수집맑은 상등, 펠릿으로부터 trophozoites과 시료의 오염을 방지. 0.22 μm의 셀룰로오스 아세테이트 막을 통해 뜨는을 전달하여 어떤 전송 세포를 제거합니다. 0.02 %의 β-머 캅토 에탄올과 단백질 분해 효소를 활성화합니다. </li><li> 죽은 세포에서 방출 분자와 추정 원하지 않는 오염을 버리고, 세포 생존 능력의 트리 판 블루 배제 시험을 다시 적용합니다. 4.2 단계에서 얻어진 세포의 생존과 총 수는 동일해야합니다. 이 경우가 아니라면, 수집 된 상등액을 포함하는 단백질을 분비 할 수뿐만 아니라 폐기되어야한다. </li></ol> Trophozoites, Trophozoite 해물 또는 분비 제품과 MDCK 세포의 5. 상호 작용 <ol><li> 라이브 trophozoites (1:1의 MDCK - 투 - 아메바 비율)에 합류 MDCK 세포 단일 층을 품어, trophozoite 해물 (MDCK - 투 - 아메바 1:2 비율) 또는 분비 제품 (1 MDCK - 투 - 아메바 비율 : 10) 2 30 분 (그림 2A) 37 ° C에서. </li><li> 언 바운드 분자 또는 trophozoites을 제거하기 위해 얼음처럼 차가운 PBS와 상피 세포 다섯 번 씻으십시오. </li></ol> 면역 형광 검사를위한 샘플 6. 준비 <ol><li> 24 멀티 웰 세포 배양 접시 안에 배치 멸균 유리 커버 슬립에 문화 MDCK 세포. 그들이 합류의 100 %에 도달 할 때까지 거꾸로 현미경의 세포를 검사합니다. 그런 다음, 신선한 보충 DMEM 배지 1 ml의 매체를 대체하고 더 24 시간 동안 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다. </li><li> 진공 흡입기 및 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체를 제거하고 각 웰에 따뜻한 PBS 1 ㎖를 추가합니다. PBS를 제거하고 신선한 PBS로 세척을 반복합니다. 유리 피펫 우물의 바닥에서 세포가 긁히지 않도록주의하십시오. </li><li> 라이브 trophozoites (T), trophozoite 총 해물 (TL)과 분비 제품 (SP) : 따뜻한 PBS 1 ㎖에 희석 trophozoites의 다른 조건을 추가합니다. <ol><li> 2 또는 30 분 동안 인큐베이터에서 배양 플레이트를 넣습니다. </li><li> MDCK 세포가 E.와 함께 배양해야하는지 하나라는 시간 0 분, 두 개의 제어 조건을 준비 아메바하지만 따뜻한 PBS 1 ㎖와; 이 경우 이차 항체 제어와 같은 다른 조건은 2 또는 30 분 동안 T, TL 또는 SP와 MDCK을 배양하고 기본 항체와 부화를 생략합니다. </li></ol></li><li> 언 바운드 분자 또는 trophozoites을 제거하기 위해 차가운​​ PBS와 상피 세포 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 수정 및 C. -20 °에서 30 분 동안 96 % 에탄올 1 ㎖로 세포를 투과 </li><li> 에탄올을 제거하려면, 실온에서 1 ㎖의 PBS로 3 빠른 세척을 수행합니다. </li><li> 시료의 건조를 방지하기 위해 습한 챔버에서 다음 단계를 수행 <ol><li> 폐쇄 및 샘플을 안전하게 배치 할 수있는 젖은 종이 타월로 가득 수 있습니다 가능한 평면 상자를 사용합니다. 예를 들어, 빈 피펫 팁 상자가 아니라이 목적을 제공합니다. </li><li> 챔버 내부에 균일하게 파라 필름 층과 피펫 블록의 25 μl를 배치각 coverslip에 대한 솔루션 (0.5 % BSA)을 주입. </li><li> 미세 집게와 우물 밖으로 커버 슬립을 조심스럽게 여과지 가장자리에서 물기를 제거하고 세포가 차단 솔루션을 향 차단 솔루션 (0.5 % BSA)을 포함하는 드롭에 커버 슬립을 넣어. 실온에서 1 시간 동안 샘플을 배양한다. </li></ol></li><li> PBS의 기본 항체의 혼합물을 준비 IgM 항체 마우스 방지 EhCPADH112 (mα-EhCPADH112 1:10 희석)와 IgG의 토끼 반 ZO-1 (Pα-ZO-1, 1:100 희석). </li><li> 습기 상자와 펫 각 coverslip에 대한 항체 용액 25 μL에서 파라 필름의 신선한 시트를 놓습니다. </li><li> 블로킹 용액으로부터 커버 슬립을 올리고 여과지를 이용하여 에지에서 과도한 액체를 건조하고, 세포가 항체 용액을 향하게 알갱이에 넣지. 4 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어 </li><li> (상단에 셀 측) 24 멀티 웰의 우물에 각 coverslip에 넣어 1 ㎖의 PBS를 추가합니다. <ol><li&gt; 언 바운드 분자를 제거하는 PBS 1 ㎖와 다섯 번 씻으십시오. </li></ol></li><li> FITC 결합 염소 항 - 마우스 IgM 항체 (1:100 희석) 및 TRITC (1시 50분 희석)에 결합 된 염소 항 - IgG의 토끼 : PBS의 형광 차 항체의 혼합물을 준비합니다. </li><li> 습기 상자와 펫 각 coverslip에 대한 이차 항체 용액 25 μL로 파라 필름의 신선한 시트를 놓습니다. </li><li> 6.10에서와 같이 샘플을 전송하고 형광 염료의 탈색을 방지하기 위해 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 6.11.1 단계를 반복합니다. </li><li> 핵 염색의 경우, 상온에서 0.05 ㎜ DAPI 용액 200 ㎕를 3 분 동안 부화와 빛으로부터 보호합니다. 6.11.1 단계를 반복합니다. </li><li> 형광 염료를 절약 Vecta 방패 유리 현미경 슬라이드에 장착 솔루션을 antifade 5 μL로 커버 슬립 (세포가 아래로 향하게)을 배치합니다. 샘플 건조를 방지하기 위해 매니큐어를 사용하는 커버 전표를 밀봉. </li><li> 장기 기억,에 슬라이드를 계속-20 ° C에서 현미경 슬라이드 상자 </li><li> Z-스택 섹션과 XZ-평면 (그림 2A)를 통해 공 초점 현미경으로 준비를 분석합니다. </li></ol> 프로테아제 억제제 또는 특정 항체와 Trophozoites 7. 보육 <ol><li> 반복 3.2 3.1 단계를 반복합니다. 각 실험 조건의 경우, 4에서 20 분 동안 단백질 분해 효소 (전체 1 ㎜ 및 40 ㎍ / ㎖의 E-64) 억제제 또는 EhCPADH112 (mαEhCPADH112)에 30 μg의 단일 클론 항체 (21) (50 ㎕의 PBS에 재현 탁) 1 × 10 5 trophozoites을 품어 ° C (그림 2B). 단계 8.5에서 설명한대로 공동 배양 분석을 위해 이러한 준비를 사용합니다. </li></ol> 8. Transepithelial 전기 저항의 측정 (TER) <ol><li> 멸균 트랜스 웰 투과 지원 (0.4 μm의 기공 크기)에 문화 MDCK 세포. 상부 구획에서, 100 ㎕의 세포 현탁액 및 하부 구획에 배치보충 DMEM 배지 600 μl를 놓습니다. <ol><li> 주기적으로 중간 수준을 확인합니다. 필요에 따라 새로운 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 그들이 합류의 100 %에 도달 할 때까지 거꾸로 현미경의 세포를 검사합니다. 2-3 일마다 중간 변경합니다. </li><li> 세포 부착 (필요한 경우)을 개선하기 위해, 세포 현탁액을 추가하기 전에 DMEM에서 37 ° C에서 하룻밤 트랜스 웰 필터를 평형. </li></ol></li><li> 에탄올에 침지 후드 STX2 전극을 소독하고 멸균 PBS에서 UV 빛 아래 15 분 각각에 대한. EVOM 상피 voltohmmeter에 전극을 연결하고 저항 모드를 선택합니다. </li><li> 각 트랜스 웰의 상부 구획에서 매체를 수집하고이를 풀. 이 미디어 혼합물의 50 μl를 타고 trophozoites 현탁액 50 μL (PBS에 1 × 10 5 trophozoites) 또는 만 PBS (대조군)와 결합. 각 트랜스 웰의 유사한 혼합물을 사용합니다. </li><li> 각 트랜스 웰의 containin의 상부 챔버에 혼합물을 추가G MDCK 세포. 실험 조건은 trophozoites (제어)없이 trophozoites 또는 단백 분해 효소 억제제 또는 mαEhCPADH112 사전 배양 trophozoites와 공동 문화를 MDCK 세포를 포함한다. 필터에 의해 제공되는 저항을 제거하기 위해, 단지 배지로 배양 트랜스 웰을 사용한다. 각 실험 조건은 적어도 세 개의 트랜스 웰하십시오. </li><li> 즉시, 각 트랜스 웰에 STX2 전극을 찍기 TER을 측정합니다. <ol><li> 긴 전극이 하부 챔버의 바닥을 만지고 짧은 전극 (그림 2B 참조) 상부 구획 중간에 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마다 수직으로 전극을 보유해야합니다. 이것은 크게, 재현성을 향상시킬 것입니다. 이 데이터의 변화로 이어질 것으로 이동하거나 측정하는 동안 전극을 기울 마십시오. </li></ol></li><li> 이 측정은 초기 TER 값으로 간주해야한다. 그 후, 다음 과정을 모니터링 TER30 분. </li><li> TER 최종 값을 계산하기 위해, 전용 필터의 TER 값을 뺀다. 다른 실험에서 결과를 비교하려면 100 % (그림 2B)로 다음을 고려하여 초기 값으로 각 데이터 포인트를 정상화. </li></ol>

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E.에 의해 상피 감염 동안 체외 호스트 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 아메바, 그것은 상피 세포와 trophozoites 모두의 잘 확립 된 문화와 함께 작동하는 데있어 매우 중요합니다. 예를 들어, 이전의, E. 아메바의 문화는 일반적으로 세균이나 trypanosomatids (22, 23)의 특정 종과 공동으로 설립했다. E.의 그러나 공동 재배 숙주 세포에서 관찰 된 효과가 명백하게 ameobas에 기인 할 수없는 것이 아니라 공동 배양 세포의 효과가 될 수 있기 때문에 아메바 문화 호스트 병원체 상호 작용의 연구에 대한 역효과. 따라서, E.의 axenical 문화 아메바는 특정 호스트 병원체 상호 작용의 조사를 위해 바람직하다. 제공되는 프로토콜은 방법을 설명 E. 같은 무균 재배 아메바는 특히 감염 연구에 대한 이러한 문화를 악용 달...

Entamoeba의 아메바는 염증과 설사. E.의 원인이 인간의 아메바 증, 장 감염의 책임있는 단일 셀의 원생 동물이다 아메바는 연간 5000 만 개인에게까지 감염 있지만, 감염된 사람의 약 10 %는 아메바 증 1에 관련된 증상을 개발할 수 있습니다. 감염 E를 포함하는 오염 된 음식이나 물을 섭취에 발생 아메바 포낭. 소장에서, 낭종은 결장 점액을 준수하고 2 증식 라이브 trophozoites을 생산하고 있습니다. Trophozoites은 일반적으로 대변을 통해 배설된다 낭종을 형성한다. 다른 경우 아직 알 수없는 이유로, trophozoites는 장 상피 층을 중단하고 기본 조직을 공격. 최악의 경우에, 그들은 혈류를 입력하고 3 간 등의 다른 장기에 영향을 미친다. 상피 장벽을 깨고 합류 세포를 유지 상피 transmembranal 구조의 중단을 요구합니다. 상피 세포연락처 타이트 (TJ)로 구성된 정점 접합부 복합체 형성 및 접합 (AJ)에있는 adherens, 4를 데즈 모섬 있습니다. 가장 꼭대기 접합 TJ 있으며, 따라서 이들은 E. 의해 상하게 제 베리어 호스트 침입 동안 아메바와 다른 병원균. TJ는 같은 인접 셀의 수용체와 호모 또는 heterophilic 상호 작용에 관여 claudins, occludin 및 접합부 접착 분자 (JAM)로 transmembranal 접착 수용체로 구성되어 있습니다. 그들은 세포 내 상피 세포에 더 기계적 강도를 제공하는 굴지의 골격에 부착 수용체를 연결 (ZO) 가족 zonula의 occludens의 발판 분자에 의해 바인딩됩니다. TJ는 과도한 물과 용질의 누설을 방지, 창자 루멘에서 장 조직을 밀봉 할 책임이 있습니다. TJ는 기생충에 의해 중단 된 후 따라서, 조직은 침략있다. E. (I) TARG에 아메바의 접착에 관련된 사람들 : 아메바 같은 다양한 분자를 분비등의 셀 (5); 세포 외 유출에 의해 숙주 세포의 살해에 참여하는 (ⅱ) 막 - 활성 인자, 예를 들어 칭했다 이온 채널 형성 펩티드 6,7 amoebapores; 그리고 (iii) 세포 외 매트릭스 단백질을 분해 및 조직 붕괴 5,8,9을 중재 단백. 함께 EhCPADH112 착체를 형성 시스테인 프로테아제 EhCP112 및 유착 분자 EhADH112 두 E. 아르 아메바 TJ (10)의 분해에 중요한 역할을하는 단백질을 독성. 라이브 trophozoites, 자신의 총 해물과 분비 제품은 상피 장벽의 TJ 복잡하고 기능 장애의 분자 변화를 유도한다. 이 연구에서, EhCP112 및 EhADH112 따라서 E.에게 용이 occludin 내면화하고 세포 단백질의 저하로 이어지는 claudin-1 단백질과 상호 작용하는 것을 알 수있다 세포층의 경로를 통해 아메바 입구. 우리의 데이터와 그 오F 다른 그룹 11-17 강력 기생충의 침입을 허용 특정 호스트 병원체 상호 작용의 필요성을 제안합니다. 이러한 상호 작용의 분자 기초를 이루는 것은 아메바 증의 발병 기전에 대한 이해를 위해 가장 중요합니다. 증가 된 세포층의 투과성을 특징 trophozoites 의해 TJ의 선택적 교란, transepithelial 전기 저항의 감소 (TER)에 의해 측정 될 수있다. 호스트 상피으로 기생 단백질의 전이는 면역 형광 염색과 공 초점 레이저 현미경도 가능 직접 상호 작용을 나타내는 상피 접합부 마커 아메바 독성 요인의 공동 현지화를 공개 할 수있는 방법으로 측정 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 상피 세포와 trophozoites가 재배 수확 및 호스트 병원체 상호 작용과 그 영향을 검토하기 위해 조작하는 방법을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Entamoeba histolytica HM1:IMSS, 클론 A&nbsp;</td><td>IMSS 병원, 멕시코</td> 독성 영양동물이 <td>없는 경우</td><td>18&nbsp; </td></tr><tr><td>TYI 국물</td><td>Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich</td><td>211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879</td><td>3.45% BBL 비오사카트 펩톤 58mM 포도당 39mM NaCl 5mM KH2PO4 6.5mM K2HPO4 16.3mM 아스코르브산 8.1mM L-cysteine 0.1 mM 구연산 철 암모늄, pH 조정 6.819</td></tr><tr><td>소 혈청 성인</td><td>Microlab , Labs., Mex.</td><td>SU146</td><td>10%에서 사용하고 56으로 비활성화; C 30분</td></tr><tr><td>다이아몬드&nbsp; 비타민&nbsp; 혼합물- Tween 80</td><td>In vitro</td><td>SR-07</td><td>3%</td></tr><tr><td>페니실린에서 사용&nbsp;</td><td>호숫가,&nbsp; M&eacute;x입니다.</td><td>34564SSA IV</td><td>0.5 IU/ml</td></tr><tr><td>스트렙토마이신&nbsp;</td><td>호숫가,&nbsp; M&eacute;x입니다.</td><td>75757SSA IV</td><td>35 및 마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>Pyrex 15 ml 스크류 캡 배양 튜브, PTFE 라이닝 페놀 캡</td><td>Corning-Pyrex</td><td>9826-16X</td><td>16 x 125 mm, 용량 15 ml 및 온도의 영향에 강한 특수 공식으로 제작된 캡</td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트, 6-Well</td><td>Corning-Costar</td><td>3516</td><td>멸균 플레이트, 웰 직경 34.8 mm 및 성장 면적 9.5 cm2.&nbsp; 뚜껑의 고리는 교차 오염을 방지합니다</td></tr><tr><td>25 cm2 세포 배양 플라스크</td><td>Corning-Costar</td><td>430168</td><td>캔티드 넥 플라스크</td></tr><tr><td>MDCK (Madin Darby 송곳니 신장) 유형 I</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CCL34</td><td>신장 상피 세포는 60th 및 90th 통로</td></tr><tr><td>DMEM 매체</td> 사이에서 성장합니다.<td>기코&nbsp;</td><td>12800-017</td><td>Dulbecco의 고포도당을 함유한 변형된 독수리 배지.</td></tr><tr><td>신생아 송아지 혈청</td><td>In vitro</td><td>S-02</td><td>10%에서 사용.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 혼합물&nbsp;</td><td>시험관에서&nbsp;</td><td>A-01</td><td>원액 10,000 U/&마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>인슐린&nbsp; &nbsp;</td><td>AMSA</td><td>398MJ94SSA IV</td><td>스톡 솔루션 100 IU/ml</td></tr><tr><td>트립신 솔루션&nbsp;</td>칼슘 및 마그네슘이 없는 <td>시험관 내</td><td>EN-005</td><td>0.05% 효소 용액</td></tr><tr><td>75cm2 세포 배양 플라스크</td><td>Corning-Costar</td><td>430720</td><td>TYI-S-33 매체</td></tr><tr><td>Transwell 투과성 지원</td><td>Corning-Costar</td><td>3470</td><td>0.4 &micro; M Polyster 막, 24-웰 플레이트에 6.5mm 삽입, 성장 면적 0.3 cm2</td></tr><tr><td>24-웰 세포 배양 접시&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning-Costar</td><td>3524</td><td>투명 폴리스티렌, 최적의 세포 부착을 위해 처리, 감마선 살균 및 인증된 비발열성</td></tr><tr><td>Complete Mini</td><td>Roche</td><td>11836 153 001</td><td>프로테아제 억제제 칵테일은 광범위한 세린, 시스테인 및 금속 프로테아제를 억제합니다. 최종 농도 1 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>트랜스-에폭시숙시닐-L-류실아미도(4-구아니디노) 부탄(E-64)</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>E3132</td><td>시스테인 프로테아제 억제제, 최종 농도 40 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>p&알파; 조-1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td>IgG 토끼 폴리클론널&nbsp; 항체&nbsp; ZO-1 인간 단백질 m&alpha의 중간 영역에 있는 합성 펩타이드에 대하여</td></tr><tr><td>; EhCPADH112</td><td>수제 항체</td><td>없음 / 번호</td><td>IgM 마우스 단클론 항체&nbsp; 반대&nbsp; 444-601 항원결정인자 EhCPADH11221,27</td></tr><tr><td>FITC-염소 항-마우스 IgM Zymed</td><td></td><td>62-6811</td><td>플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 표지 염소 항-마우스 2차&nbsp; 항체</td></tr><tr><td>TRITC- 염소 항-토끼 IgG (H+L)</td><td>Zymed</td><td>816114</td><td>테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트 (TRITC) 라벨링; 염소 안티 토끼 IgG&nbsp; 2차 항체.</td></tr><tr><td>STX2 전극</td><td>세계 정밀 기기&nbsp;</td><td>102711</td><td>폭 4mm, 두께 1mm의 고정된 쌍의 이중 전극으로 구성됩니다. 전극 쌍의 각 스틱에는 전압을 측정하기 위한 은/염화은 펠릿과 전류를 통과시키기 위한 은 전극이 포함되어 있습니다. EVOM</td></tr><tr><td>EVOM 상피 전압저항계</td><td>세계 정밀 기기와 함께 사용하기 위해&nbsp;</td><td>12111</td><td>저항 모드에서 사용하고 TER 측정 중에는 플러그를 뽑은 상태로 유지</td></tr><tr><td>Neubauer 챔버</td><td>MEARIENFELD</td><td>610610</td><td>혈구계&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCS_SP5_MO</td><td>Leica</td><td>Leica</td><td>Microsystems CMS Gmbh/Leica Las af Lite/BIN 소프트웨어를 사용한 레이저 컨포칼 현미경 비</td>/번호</tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>형광</td></tr><tr><td>4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)</td><td>를</td> 위한 마운팅 매체SIGMA <td>D-9542</td><td>0.05 mM 최종 농도</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>US Biological</td><td>A-1310</td><td>0.5%&nbsp; 차단 용액을 위한 최종 농도</td></tr></tbody></table>

에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; entamoeba 아메바</em&gt; 감염

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba의 아메바는 인간의 아메바 증의 원인 물질, 열대 국가에서 설사와 간 농양의 주요 원인이다. 감염은 장 상피 세포와 병원체의 상호 작용에 의해 시작됩니다. 이러한 상호 작용은 꽉 접합 (TJ)로 세포 간 구조의 붕괴로 연결됩니다. TJ는 창자 루멘에서 호스트 조직을 분리하는 상피 층의 밀봉을 보장합니다. 최근의 연구에 기생 단백질 EhCPADH112으로 TJ의 중단이 E.의 전제 조건임을 증거를 제공 상피 장벽 기능 장애를 동반 아메바 침공. 따라서, E. 동안 TJ 분해에 관련된 분자 메커니즘의 분석 아메바 침공은 아메바 증의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 개선하기 위해 매우 중요합니다. 이 문서에서는 초기 호스트 병원체 상호 작용의 평가 및 기생충의 침입 가능성을 확인하기 쉬운 모델을 제시한다. 분석 할 매개 변수 T를 포함ransepithelial 전기 저항, 상피 세포 표면 수용체, 표현의 변화와 상피 접합부 마커 및 상피 세포 내 기생충 분자의 현지화 현지화와 EhCPADH112의 상호 작용.

성공적인 E.에 대한 아메바의 문화는 중요한 두 가지 조건이 충족되어야합니다 로그 단계에서 무균 조건과 수확의 성장. E.의 이전, 문화 아메바는 쉽게 세균이나 trypanosomatids 22의 특정 종과 공동으로 설립되었다. 그러나, 요즘은 대사 박테리아, 곰팡이, 원생 동물, 또는 후생 동물 세포없는 환경에있는 아메바의 무기한 subcultivati​​on을 의미하는이 기생충의 무균 재배를하는 것이 일반적입니다. 또한, 성장의 초기 고정 단계 후반 대수 동안 trophozoites를 수확하는 것은 생존과 증식 세포의 23을 가지고 매우 중요합니다. 따라서, 몇 일을 따라 또한 그들의 본래 형태와 급속한 운동 (도 1)을 검사하여 trophozoites 정량화하여이 단계를 구분하는 것이 중요하다. 상호 작용 연구의 경우, 상피 세포는해야아메...

Entamoeba 아메바에 의한 인체 감염은 아메바 증, 열대 국가에서 설사의 주요 원인으로 이어집니다. 감염은 세포 - 세포 연락처 개방 결과적으로 설사, 때때로 간 감염에 의해 다음 도발, 장 상피 세포와 병원체 상호 작용에 의해 시작됩니다. 이 문서는 아메바 증의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 개선하기 위해 초기 호스트 병원체 상호 작용을 평가하는 모델을 제공합니다.

에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; Entamoeba 아메바</em&gt; 감염

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

이 절차의 전반적인 목적은 초기 숙주-병원체 상호작용과 TBA.Histolytica의 침입 잠재력을 평가하는 것입니다. 먼저 온전한 영양체, 영양체, 전체 용해물 또는 분비된 영양체를 준비하십시오. 그 다음, 적절한 농도의 다양한 영양체와 함께 숙주 상피 세포를 배양하십시오.이제 AM 면역형광법을 사용하여, 처리된 상피 세포 배양물에서 상피 세포의 밀착 연접(tight junction)과 상호작용하는 특정 Entamoeba histolytica 단백질을 분석하고, 경상피 전기 저항(trans epithelial electrical resistance)을 통해 세포 간 장벽의 변화를 측정합니다. 이러한 결과를 종합하면 E. histolytica에 의한 밀착 연접의 해체를 입증할 수 있으며, 이 과정에서 특정 복합체의 관여 여부를 정확히 파악할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기생충의 다양한 산물을 사용하여 숙주 상피로의 E. histo 인자 전이를 평가하고, 이러한 인자들의 참여를 입증할 수 있다는 점입니다.감염 극초기 단계에서 전세포의 접합부 개방에 영향을 주는 요인들입니다. 이 방법은 상피 세포와 이질아메바 기생충 사이의 분자적 상호작용을 이해하는 것과 같이 아메바성 이질 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 적절한 배양 시간, 공동 배양을 위한 두 세포의 비율, 그리고 다양한 ELI 생성물을 얻는 방법 및 TER 측정 방법을 알지 못해 어려움을 겪을 것입니다.이 기술의 함의는 E-H-C-P-A-D-H 112 복합체와 같은 바이러스 인자가 새로운 치료 전략의 표적으로 활용될 수 있다는 점에서 아밀로이드증 치료로까지 확장됩니다. 넷째, 이 인비트로(in vitro) 방법은 초기 숙주 부위 상호작용에서 아니카 바이러스 인자의 참여에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 인비보(in vivo) 시스템, 햄스터, 생쥐, 기니피그의 감염 모델 및 인간 장 생검 등 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 배양.5% carbon dioxide 및 37 °C 조건의 보충된 DMEM 배지 10 mL에서 MDCK 세포를 배양합니다. 37 °C의 TYIS 33 배지 15 mL에서 1 × 10⁵개의 Entamoeba histolytica 트로포조이트를 실제로 배양합니다. 트로포조이트를 분리하기 위해, 튜브를 얼음물 수조에서 5~10분 동안 냉각합니다.그 후 배양액을 무균적으로 원심분리 튜브에 옮기고 4°C에서 360 ×g로 10분간 원심분리합니다. 이제 상층액을 조심스럽게 따라냅니다. 펠릿에 얼음처럼 차가운 PBS를 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 원심분리 후 세포를 분산시킵니다.hemo cytometer를 사용하여 trophozoite 수를 측정하고, trophozoite를 용해시킨 후 액체 질소에서 1분 동안 급속 냉동하고, 4°C에서 해동한 뒤 강하게 vortexing 합니다. 이제 0.02% beta mercaptoethanol을 사용하여 용해물에 존재하는 protease를 활성화합니다. 9 × 10⁶개의 trophozoite를 3 mL의 ice-cold PBS로 희석하고, 세포를 50 mL conical tube로 옮깁니다.이제 분비물을 수집하기 위해 영양체 현탁액을 37 °C 인큐베이터 내에서 수평 방향으로 5도 기울인 상태로 2시간 동안 둡니다. 그 후 튜브를 360 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 일회용 멸균 주사기를 사용하여 펠릿의 영양체로 인해 샘플이 오염되지 않도록 상층액을 조심스럽게 수집합니다. 그런 다음 전이된 세포를 모두 제거하기 위해 상층액을 0.22 µm 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시킵니다.이제 면역형광 배양을 위해 0.02% beta mercaptoethanol로 프로테아제를 활성화합니다. 24-웰 멀티 웰 세포 배양 접시 내부의 멸균 유리 커버스립 위에 MDCK 세포를 배양합니다. 세포가 100% confluence에 도달할 때까지 도립 현미경으로 세포를 관찰합니다.1 mL의 따뜻한 PBS에 희석된 다양한 조건의 trophozoites를 추가합니다. PBS만 처리하고 E. histolytica를 처리하지 않은 MDCK 세포의 대조군 조건과, 다양한 조건의 trophozoites를 처리하였으나 1차 항체 배양 과정을 생략한 MDCK 세포 조건을 포함합니다. 배양 플레이트를 인큐베이터에 2~30분 동안 둡니다.다음으로, 결합되지 않은 분자나 trophozoites를 제거하기 위해 상피 세포를 차가운 PBS로 5회 세척합니다. 습윤 챔버에서 -20 °C로 몇 분 동안 1 mL의 96% ethanol을 사용하여 세포를 고정 및 투과화합니다. 웰에서 커버슬립을 조심스럽게 꺼냅니다.거름종이를 사용하여 가장자리의 과잉 액체를 제거하고, 세포가 아래를 향하도록 커버슬립을 0.5% BSA 블로킹 용액에 담급니다. 시료를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그동안 PBS 내에서 1차 항체 혼합액을 준비합니다.블로킹 용액에서 커버 슬립을 들어 올립니다. 거름종이로 과잉 액체를 닦아냅니다. 세포를 항체 용액으로 옮기고 샘플을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.결합되지 않은 분자들을 제거하기 위해 1 mL의 PBS로 세포를 5회 세척합니다. 이제 PBS에 두 종류의 형광 2차 항체를 혼합하여 준비합니다. 핵 염색을 위해 샘플을 2차 항체와 함께 실온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다.실온의 암소에서 200 µL의 0.05 mM dappy 용액과 함께 세포를 3분 동안 배양합니다. 다음으로, 공동 배양 실험에서 Zack 단면과 XZ 평면을 통해 공초점 현미경으로 준비물을 분석합니다. 프로테아제 억제제 또는 특정 항체를 사용하여, 프로테아제 억제제 또는 단클론 항체 배양액과 함께 각 실험 조건을 4 °C에서 20분 동안 배양합니다.멸균된 트랜스웰 투과성 지지체가 있는 상단 챔버에 MDCK 세포 100 µL의 세포 현탁액을 분주하고, 하단 챔버에는 보충제 함유 DMEM 배지 600 µL를 넣습니다. 준비된 트랜스웰 필터를 도립 현미경이 장착된 배양기에 넣습니다. 세포가 100% 합류(confluent)되었는지 확인합니다.각 트랜스웰의 상부 챔버에서 배지를 수집하여 혼합한 후, 이 배지 혼합물을 50 µL씩 분취합니다. 여기에 50 µL의 트로포조이트(trophozoites) 현탁액 또는 PBS 대조군을 추가합니다. 이제 이 혼합물을 MDCK 세포가 들어 있는 각 트랜스웰의 상부 챔버로 옮깁니다.STX 전극 두 개를 각각의 트랜스웰(transwell)에 즉시 담가 상피 세포 전기 저항(trans epithelial electrical resistance)을 측정하십시오. 긴 전극은 하단 챔버의 바닥에 닿고, 짧은 전극은 상단 구획의 배지에 잠겨 있어야 합니다. E histolytica는 accent 조건 하에서 배양되었으며, 성장기의 후기 대수 증식기에서 초기 정지기 사이에 수확되었습니다.여기서는 tight junction 마커인 ZO-1을 사용하여 tight junction 및 adherence junction에 의해 안정화된 상피세포의 세포 접촉 부위를 시각화하였습니다. 단클론 항체를 이용한 면역형광법을 통해 아메바 유래 복합체와 상피 표면의 상호작용을 연구하였습니다. trophozoites, 전체 용해물 또는 분비 산물을 상피 단일층에 처리한 결과, 해당 복합체가 tight junction과 공국소화되는 것이 확인되었습니다. 30분 후, 세포 경계에서 불연속적인 ZO-1 염색이 나타났으며 소포 내로의 내부화가 관찰되었습니다.이러한 파괴는 MDCK 세포와 트로포조이트(trophozoites) 및 트로포조이트 간의 접촉에서 가장 두드러졌습니다. 전체 용해물 공초점 레이저 현미경 관찰 결과, 병원성 복합체가 세포 간 공간으로 침투했음을 나타냈습니다. 파괴된 ZO-1 염색 부위의 기생충 접촉 지점과 공국소화(co-localizing)되어 상피 장벽 기능을 파괴하였으며, 그 결과 상피 내 전기 저항(trans epithelial electrical resistance)이 90% 감소하였습니다.트로포조이트를 복합체에 대한 항체 또는 단백질 분해 효소 억제제로 사전 배양한 결과, TER 감소로부터 보호되는 효과가 나타났습니다. 이러한 데이터는 단백질 분해 활성과 접착 특성 모두가 E. histolytica 침습 과정에서 이 복합체의 중요한 병원성 인자임을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후, E. histolytica의 병원성 인자가 감염 초기 단계에서 밀착 연접(tight junctions)을 어떻게 개방하는지에 대한 분석 메커니즘을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 분석법을 숙달하면, 용해 생성물과 세포 배양이 준비된 상태에서 상피 세포 손상 분석을 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 이온의 정확한 상호작용 시간을 준수하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 enba, histolytica 병원성 인자와 상피 단백질 사이의 가능한 연관성과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역침강 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 햄스터, 기니피그 및 인간 조직에서 AMS의 병원성을 탐구할 수 있도록 alside 상호작용 분야의 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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