에 의해 제작 상피 손상의 분석 Entamoeba 아메바 감염

이 절차의 전반적인 목표는 초기 숙주 병원체 상호 작용과 TBA의 침입 가능성을 평가하는 것입니다. 히스톨리티카. 먼저 손상되지 않은 trophozoites, trophozoites, total lysates 또는 secreted trophozoites를 준비하십시오. 그런 다음 숙주 상피 세포를 서로 다른 trophozoites의 적절한 농도로 배양합니다.

이제 AM 면역형광을 사용하여 상피 세포의 밀접한 연접과 상호 작용하는 선별된 ABA 조직분해 단백질에 대해 처리된 상피 배양을 분석하고 트랜스 상피 전기 저항에 의한 주세포 장벽의 변화를 측정합니다. 종합하면 결과는 TBA Histolytica에 의한 밀착 접합 분해를 입증할 수 있으며 이 과정에서 선택 복합체의 참여를 정확히 찾아낼 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기생충의 다양한 생성물을 사용하여 Eva histo 인자의 숙주 상피로의 전좌를 평가하고 이러한 eva의 참여를 입증하는 것입니다.

감염 초기에 전체 세포의 접합부 개방에 대한 그의 요인. 이 방법은 상피와 디바 이슬리 기생충 사이의 분자 상호 작용 이해와 같은 아메바 기생충 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 co incubation을 위한 두 세포 시간의 적절한 배양 시간 비율, 그리고 다른 ELI 산물을 얻는 방법 및 TER을 측정하는 방법을 모르기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 기술의 의미는 E-H-C-P-A-D-H 112 복합체와 같은 vir 요인이 새로운 치료 전략의 표적으로 활용될 수 있기 때문에 amis 치료로 확장됩니다. 4. 이 시험관 내 방법은 초기 병원 현장 상호 작용에 Anica 바이러스 인자의 참여에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 인비보(inbivo), 햄스터 마우스, 기니피그의 감염 모델 및 인간 장 생검과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 문화.

% 이산화탄소 및 37°C에서 10ml의 보완된 DMEM 매체에 있는 MDCK 셀. 본격적으로 10 곱하기 1 - 벤트 아메바 히스톨리티카의 다섯 번째 영양 동물을 섭씨 37도의 중간 TYIS 33 15 밀리리터로 성장시킵니다. 영양동물을 분리하려면 얼음물 욕조에서 튜브를 5-10분 동안 식히십시오.

그런 다음 배양물을 원뿔형 튜브로 무균 상태로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 360배 G로 원심분리합니다. 이제 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 펠릿에 얼음처럼 차가운 PBS를 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 원심분리 후 세포를 분산시킵니다.

혈류 세포 분석기를 사용하여 영양 동물 수를 결정하고 영양 동물을 잿물로 만들고 액체 질소에서 1 분 동안 동결하고 섭씨 4도에서 해동하고 격렬하게 소용돌이칩니다. 이제 0.02% 베타 메르캅토에탄올로 용해물에 존재하는 프로테아제를 활성화합니다. 3 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS에 6 개의 트로 포 조이트를 9 번 10으로 희석하고 세포를 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.

이제 분비된 제품을 수집하기 위해 2시간 동안 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5도 기울어진 수평 각도로 tropho 현탁액을 놓고 10분 동안 360회 G로 튜브를 원심분리하십시오. 일회용 멸균 주사기를 사용하여 상층액을 조심스럽게 수집하여 펠릿의 영양동물로 샘플이 오염되는 것을 방지합니다. 그런 다음 전달된 세포를 제거하려면 상등액을 0.22미크론 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인에 통과시킵니다.

이제 면역형광 배양을 위해 0.02% 베타 메르캅토에탄올로 프로테아제를 활성화합니다. 멸균 유리 덮개의 MDCK 세포는 24개의 멀티웰 세포 배양 접시 안으로 들어갑니다. 100% confluence에 도달할 때까지 도립 현미경에서 세포를 검사합니다.

1ml의 따뜻한 PBS에 희석된 다양한 조건의 트로포조이트를 추가합니다. PBS가 있고 e histolytica가 없는 MDCK 세포의 제어 조건과 trophozoites의 조건이 다르지만 1차 항체로 배양을 방출하는 MDCK 세포를 포함합니다. 배양 플레이트를 인큐베이터에 2분 또는 30분 동안 놓습니다.

다음으로, 상피 세포를 차가운 PBS로 5회 세척하여 결합되지 않은 분자 또는 영양동물을 제거합니다. 습한 챔버에서 섭씨 영하 20도에서 몇 분 동안 96% 에탄올 1밀리리터로 세포를 고정하고 퍼밍합니다. 우물에서 덮개 미끄러짐을 조심스럽게 꺼내십시오.

여과지를 사용하여 가장자리에서 과도한 액체를 제거하고 셀이 아래를 향하도록 커버 슬립을 0.5%BSA 차단 용액에 담그십시오. 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 한편, PBS에서 1차 항체 혼합물을 준비합니다.

차단 용액에서 덮개 슬립을 들어 올립니다. 여과지에 여분의 액체를 말리십시오. 세포를 항체 용액으로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다.

결합되지 않은 분자를 제거하기 위해 1ml의 PBS로 세포를 5번 세척합니다. 이제 PBS에서 두 개의 형광 2차 항체의 혼합물을 준비합니다. 핵 염색을 위해 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 2차 항체로 샘플을 배양합니다.

200마이크로리터의 0.05밀리몰 dappy 용액으로 어두운 곳에서 실온에서 3분 동안 세포를 배양합니다. 이제 공동 배양 실험에서 Zack 절편과 XZ 평면을 통해 컨포칼 현미경으로 준비물을 분석합니다. 프로테아제 억제제 또는 특정 항체를 사용하여 각 실험 조건을 프로테아제 억제제 또는 단클론 항체 배양으로 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다.

상부 격실의 멸균 트랜스웰 투과성 지지체의 MDCK 세포는 100마이크로리터의 세포 현탁액을 배치하고 하부 격실에는 600마이크로리터의 보충된 DMEM 배지를 배치합니다. 준비된 트랜스웰 필터를 도립 현미경의 인큐베이터에 놓습니다. 셀이 100% confluent인지 확인합니다.

각 트랜스웰의 상부 격실에서 이 배지 혼합물 50마이크로리터로 배지를 수집하고 풀링합니다. 50마이크로리터의 트로포조이트 현탁액 또는 PBS 제어를 추가합니다. 이제 혼합물을 MDCK 세포를 포함하는 각 트랜스웰의 상부 챔버로 옮깁니다.

즉시 STX 두 전극을 각 트랜스웰에 담그어 트랜스 상피 전기 저항을 측정합니다. 긴 전극이 하부 챔버의 바닥에 닿고 더 짧은 전극이 상단 구획의 매체로 덮여 있는지 확인합니다. E histolytica는 악센트 조건에서 배양되고 후기 로그 단계에서 초기 정지 성장 단계에서 수확되었습니다.

여기서, 밀착 접합 마커 zero one은 밀착 접합과 부착 접합에 의해 안정화된 상피 세포의 세포 접촉을 시각화하는 데 사용되었습니다. 단클론 항체를 사용한 면역형광을 사용하여 아메바 유래 복합체와 상피 표면의 상호 작용을 연구하고, 영양 영양 단층, 영양 농축물, 총 용해물 또는 상피 단층에 분비된 산물의 적용을 통해 밀접한 접합을 가진 복합체의 공동 국소화를 달성했습니다. 30분 후, 세포 경계에서 불연속적인 ZO one 염색이 발생하고 소포에서 내재화가 발생했습니다.

이러한 파괴는 MDCK 세포와 영양동물(trophozoites) 및 영양동물(trophozoites)과의 접촉에서 가장 두드러졌습니다. Total lysates 컨포칼 레이저 현미경은 독성 복합체가 세포 간 공간을 향해 침투하는 것을 나타냈습니다. 제오원 염색 기생충 접촉이 중단된 경우 상피 장벽 기능이 파괴되고 트랜스 상피 전기 저항이 90% 감소했습니다.

트로포조이트를 복합체에 대한 항체 또는 프로테아제 억제제와 함께 사전 배양하면 TER 드롭에 대한 보호가 이루어졌습니다. 함께. 이러한 데이터는 단백질 분해 활성과 접착 특성이 모두 e histolytica 침입 동안 이 복합체의 중요한 독성 인자임을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 EMBA histolytica 바이러스 in factor가 초기 감염 시간에 단단한 접합을 여는 메커니즘을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 상피 손상에 대한 이 분석을 마스터하면 lya 산물과 세포 배양이 준비되면 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행하는 동안 이 절차를 따르는 이온에 대한 정확한 상호 작용 시간을 고수하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 면역침전 분석과 같은 다른 방법은 enba, histolytica violence factors 및 발달 후 상피 단백질 간의 가능한 연관성과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 기술은 alside interactions 분야의 연구자들이 햄스터 마우스, 기니피그 및 인간 조직에서 AMS의 발병 기전을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.