주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

이 절차의 전반적인 목표는 MHC Class 2 dex 트리머를 사용하여 높은 수준의 특이성을 가진 자가 반응성 T 세포를 검출하는 것입니다. 이 비디오에서 대뇌는 미엘린 protio 지질 단백질 유도 실험용 자가면역 뇌척수염 쥐의 뇌에서 채취됩니다. 이것은 먼저 조직을 조심스럽게 수확하고 aros 블록을 준비함으로써 수행됩니다.

두 번째 단계는 아로스 포매 조직을 바이옴으로 200마이크로미터 두께의 절편으로 절단하는 것입니다. 그런 다음 절편은 24웰 플레이트의 조직 챔버로 옮겨져 염색되고 고정됩니다. 마지막 단계는 조직 섹션을 현미경 슬라이드에 장착하는 것입니다.

궁극적으로 컨포칼 현미경은 dex 트리머와 CD 4 항체로 결합된 세포를 보여주는 데 사용됩니다. 우리는 MHC 클래스 2 덱스트로 ER이 아쟁 특이적 자가 반응성 CD 4 T 세포를 검출하는 데 기존의 MHC 클래스 2 테트라머보다 더 민감하다는 것을 처음 입증했을 때 이 아이디어를 처음 고안했습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 새로운 조직을 절단하고 취급하는 것이 상당히 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 절편, 장착 및 분석 단계가 까다롭기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. Ting 외에도 두 명의 박사후 연구원인 제 그룹의 Chandy와 Aaron, 그리고 Dr.Zoe의 실험실에서 Christian이 이 절차를 시연할 예정입니다: 실험용 자가면역 뇌척수염 또는 EAE 쥐의 안락사 후, 구부러진 가위를 사용하여 두개골을 원형으로 잘라 두개골을 발굴하고 집게로 두개골 뼈를 조심스럽게 뒤집습니다. 깨끗한 메스를 사용하여 둔기로 해부하여 뇌를 적출합니다.

소뇌에서 소뇌를 분리합니다. 차가운 인산염 완충 식염수 또는 PBS가 들어 있는 튜브에 rerum을 넣고 처리할 때까지 튜브를 얼음 위에 둡니다. 얼음 위에 보관된 일회용 딥 베이스 몰드 조직학 카세트에 rerum을 놓습니다.

다음 카세트로 용융된 4%PBS에 의하여 완충된 낮은 녹는 aros를 따르십시오. 즉시 집게로 대뇌를 부드럽게 눌러 조직을 담그고 응고가 완료될 때까지 카세트를 얼음 위에 두십시오. 일단 응고되면, 박힌 조직의 모든 측면에서 과도한 에어로를 잘라내고 rerum의 복부 표면을 약간 노출시킵니다.

다음으로, Vibram 조직 블록에 슈퍼 접착제를 바르고 횡방향 절단을 위해 접착제 위에 노출된 대뇌의 복부 표면을 배치하여 접착된 표면 위로 aros 내장 조직을 전달합니다. 티슈가 블록 위에 놓이면 움직이지 마십시오. aros가 포함된 티슈가 포함된 진동 톤 블록을 얼음 위에 놓고 접착제를 15분 동안 건조시킵니다.

그 동안, 준비된 조직 챔버를 웰당 하나의 챔버에 있는 24웰 플레이트에 배치합니다. 조직 챔버가 들어있는 우물에 1 밀리리터의 차가운 XPBS를 채우고 플레이트를 얼음 위에 두십시오. 접착제가 마르면 비브람 블레이드를 티슈 상단 표면 높이로 내립니다.

Vibram 속도를 초당 0.22mm로 설정하고 앞으로 이동하면서 절편을 시작하여 200마이크로미터 두께의 단면을 만듭니다. 수채화 소프트 브러시를 사용하여 하나의 대뇌 섹션을 각 조직 챔버로 옮깁니다. 24웰 플레이트에서 조직 분해를 방지하기 위해 절단이 완료될 때까지 플레이트를 얼음 위에 유지합니다.

다음으로, 3개의 웰에 S 미엘린 프로티오 지질 단백질 1 39 내지 1 51 덱스트로 및 CD 4 항체의 IA를 함유하는 칵테일 300마이크로리터를 첨가하여 두 번째 24웰 플레이트를 제조합니다. 그런 다음 S Tyler의 쥐 뇌척수염 바이러스 70-86 덱스트로 및 CD 4 항체 칵테일의 대조군 IA 300 마이크로 리터를 다른 3 개의 웰 세트에 추가합니다. 우물에 레이블을 지정합니다.

그런 다음 특정 dex 트리머로 염색하도록 지정된 섹션을 포함하는 3개의 조직 챔버를 웰당 하나의 챔버가 있는 24웰 플레이트의 지정된 3개의 웰로 이동합니다. 마찬가지로, 제어된 dex 스트리머로 염색하도록 지정된 섹션을 포함하는 3개의 조직 챔버를 해당 웰로 옮깁니다. 우물당 하나의 챔버로 우물을 뚜껑으로 덮습니다.

알루미늄 호일로 플레이트를 감싸고 실온에서 어둠 속에서 1.5시간 동안 부드럽게 회전하도록 설정된 흔들 플랫폼에 플레이트를 놓습니다. 잠복기가 끝나면 조직 절편을 1ml의 차가운 XPBS 세척이 들어있는 새 우물에 옮겨 흔들 플랫폼에서 최소 10분 동안 세척합니다. 그리고 세탁을 세 번 반복하십시오.

조직 섹션이 챔버 측면에 달라붙을 수 있으므로 건조되지 않도록 하십시오. 조직 챔버를 새로운 우물로 옮겨 섹션을 고정합니다. 24웰 플레이트 중 1ml의 여과된 4%PBS 완충 파라 포름알데히드를 함유하고 부드러운 회전으로 2시간 동안 흔들림 플랫폼에서 배양합니다.

섹션을 세 번 더 세척한 후 얼룩지고 고정된 부분을 깨끗한 현미경 슬라이드에 놓습니다. 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 섹션을 건드리지 않고 여분의 물을 닦아내고 장착 매체를 사용하여 섹션을 장착합니다. 미세한 커버 슬립으로 덮고 슬라이드를 실온에서 밤새 건조시킵니다.

암실에서는 Nikon A one Eclipse 90 I 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 일상적인 이미지 스캔 및 획득을 수행할 수 있습니다. NIS 요소 AR 소프트웨어를 열려면 패널에서 테트라에틸, 루민, 이소티오시아네이트 또는 트릿 C 및 시안 5 또는 SCI 5 채널을 선택합니다. Trit sea 및 sci-fi 채널에 대한 excitation emission 파장이 기본적으로 나타납니다.

Trit Sea Channel에 대해 pseudo color green을 할당하고 SCI five channel에 대해 빨간색을 할당합니다. 현미경 스테이지에 검사할 슬라이드를 놓고 100배 배율로 수동으로 초점을 맞춥니다. HV를 10으로 설정하고 오프셋을 0으로 설정하고 초점을 클릭하고 전압을 조정합니다.

레이저 클릭, 초점을 최적화하고, 섹션을 위에서 아래로 스캔하고, 이미지 획득을 위한 Z 레벨을 설정합니다. 그런 다음 CH 시리즈를 클릭하고 이미지를 순차적으로 획득합니다. 적색 및 녹색 채널에서 생성된 신호의 공동 국소화를 기반으로 노란색 반점 세포로 나타나는 4개의 양성 T 세포를 덱스트로 또는 양성 CD로 식별합니다.

Olympus FV 500 BX 60 컨포칼 현미경을 사용하여 dextro 또는 positive CD 4개의 positive T cell을 쉽게 정량적으로 계수할 수 있습니다. 시작하려면 독감 ovu 소프트웨어를 엽니다. 드롭다운 메뉴에서 염료 S, SI 3 및 SCI 5를 선택하고 적용을 클릭하여 해당 레이저를 로드합니다.

현미경 스테이지에 검사 할 슬라이드를 놓고 SI 3 레이저가 켜져있는 동안 저배율 클릭 초점에서 수동으로 초점을 맞추고 염증 초점에 초점을 맞 춥니 다. 대물렌즈를 100배 배율로 변경합니다. 드롭다운 메뉴에서 파일 크기를 5 12 over five 12로 설정하고, 초점을 클릭하고 PMT 게인 및 오프셋 값을 조정하여 S SI 3 및 sci five에 대해 레이저를 개별적으로 최적화하고, Z 스테이지를 클릭한 다음 두 레이저가 모두 켜져 있는 동안 초점을 클릭합니다.

위쪽 및 아래쪽 화살표를 클릭하여 Z 스테이지의 두께를 설정합니다. Z 간격을 2마이크로미터로 설정합니다. 중지를 클릭하고 선택합니다.

1, 2, 3을 찾는다. 그런 다음 X, y, Z를 클릭하고 염증 초점 내에서 선택한 영역에 대한 Z 시리즈 이미지 획득을 시작하고 Z 직렬 이미지를 VI 파일로 저장합니다. 이미지 파일을 저장하려면 Z 시리얼 이미지에서 이미지를 선택한 다음 TIFF 형식으로 저장합니다.

항상 다중 TIFF 이미지를 저장하십시오. 먼저 데이터를 보호하기 위한 다음 단계는 두 세트의 dex 트리머로 염색된 세 쌍의 단면을 검사하는 것입니다. 먼저, 동일한 초점 내에서 Z 시리즈의 반복을 피할 수 있도록 수평, 수직, 위로, 수평, 수직, 아래로의 움직임으로 슬라이드를 스캔하여 Z 직렬 이미지를 촬영합니다.

Z 시리얼 이미지가 캡처되면 슬라이드 번호, 섹션 이름 및 촬영된 Z 시리얼 이미지 번호를 식별하여 파일 이름을 지정합니다. 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 총 CD 4개의 양성 T 세포 수와 관련하여 덱스트로 양성 CD 4개의 양성 T 세포를 계수합니다. 이미지 J에서 카운터 유형을 선택하고 모두 표시를 선택한 다음 각 셀의 중앙을 클릭하고 측면 화살표를 사용하여 다른 Z 직렬 이미지에서 계속 계산하여 계산을 시작합니다.

CD 4 개의 T 세포를 모두 계수 한 후 다른 유형의 카운터를 선택하고 dextro 양성 CD 4 개의 양성 T 세포를 계수합니다. 결과 탭을 클릭하여 두 개의 서로 다른 카운터로 계산된 총 셀 수를 가져옵니다. 미엘린 프로티오 지질 단백질 또는 PLP 특이적 CD 4 T 세포의 검출은 EAE 마우스에서 유래한 갓 절단된 대뇌 절편을 사용하여 수행하고, 항 CD 4 및 PLP 1 39 내지 1 51 덱스터 또는 대조군 TMEV 70 내지 86 덱스터 LSCM을 함유하는 칵테일로 염색하였다.

co stain 대뇌 단면을 분석하면 PLP 1 39 to 1 51 dex trimmers에 양성 세포는 빨간색, CD 4 항체에 양성 세포는 녹색인 반면 이중 양성 세포는 노란색으로 나타났습니다. 공염색 세포는 주변부 주위에 반점 점을 보여주었습니다. 이러한 기능은 TMEV 70 - 86 제어로 염색된 섹션에는 없었습니다.

Dex 트리머, 심장 미오신 특이적 CD, 4개의 T 세포를 심장 미오신 중쇄 알파 3, 34 내지 3, 52 덱스터로 제자리에서 염색하여 검출하는 것도 수행했습니다. LSCM에 의한 이러한 이미지 분석은 MYHC 3 34 - 3 52 덱스터에 양성 세포의 존재를 보여주었고, 적색 세포에서 CD 4는 녹색이며 덱스터와 CD 4는 노란색 반점 세포로 결합했습니다. 대조군 RNA 43 - 56 덱스터에 대한 배경 염색은 무시할 수 있는 수준이었지만, 일단 마스터하면 이 기술은 약 8-10시간 내에 완료할 수 있으며, 적절하게 수행된다면 다른 발표된 프로토콜로는 3일이 소요됩니다.

이 프로세서를 시도하는 동안 미리 시약을 준비하고 단계를 체계적으로 따라야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 타겟 타겟에서 C-반응성 CD 4개의 T 세포를 계수하기 위해 조직을 절단하고 염색하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.