주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

본 절차의 전반적인 목표는 MHC Class II 덱스 트리머(dex trimmers)를 사용하여 높은 특이도로 자가 반응성 T 세포를 검출하는 것입니다. 본 영상에서는 myelin protio lipid protein으로 유도된 실험적 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis) 마우스의 뇌에서 대뇌를 채취합니다. 이는 먼저 조직을 주의 깊게 채취하고 aros 블록을 준비함으로써 수행됩니다.

두 번째 단계는 viome을 사용하여 매립된 조직을 200 µm 두께의 절편으로 자르는 것입니다. 그 후 절편을 24웰 플레이트의 조직 챔버로 옮겨 염색 및 고정 과정을 거칩니다. 마지막 단계는 조직 절편을 현미경 슬라이드에 마운팅하는 것입니다.

최종적으로, dex trimmers 및 CD4 항체와 결합된 세포를 보여주기 위해 공초점 현미경을 사용합니다. 우리는 MHC class two dextro ERs가 항원 특이적 자가 반응성 CD4 T 세포를 검출하는 데 있어 기존의 MHC Class two tetramers보다 더 민감하다는 것을 처음 입증했을 때 이 아이디어를 처음 구상했습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 신선한 조직의 섹셔닝과 취급 과정이 상당히 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

절편 제작, 마운팅 및 분석 단계는 까다롭기 때문에 습득하기 어려우므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. Ting과 제 연구실의 박사후 연구원인 Chandy와 Aaron, 그리고 Dr. Zoe 연구실의 Christian이 이 절차를 시연할 것입니다. 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE) 마우스의 안락사 후, 곡선 가위를 사용하여 두개골을 원형으로 절개하여 제거하고 핀셋으로 두개골 뼈를 조심스럽게 들어 올립니다. 깨끗한 메스를 사용하여 둔성 박리로 뇌를 채취합니다.

소뇌에서 rerum을 분리합니다. 차가운 1x 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline) 또는 PBS가 담긴 튜브에 rerum을 넣고, 처리 전까지 튜브를 얼음 위에 둡니다. 얼음 위에 보관된 일회용 딥 베이스 몰드 조직 카세트에 rerum을 넣습니다.

그다음 녹은 4% PBS 완충 저융점 아가로스를 카세트에 붓습니다. 즉시 핀셋으로 대뇌를 부드럽게 눌러 조직을 완전히 잠기게 한 뒤, 응고가 완료될 때까지 카세트를 얼음 위에 둡니다. 응고가 되면 임베딩된 조직의 모든 측면에서 과도한 아가로스를 잘라내고, 대뇌의 복측 표면이 약간 드러나게 합니다.

다음으로, Vibram 조직 블록에 순간접착제를 바르고, 횡단면 절편 제작을 위해 cerebro의 노출된 복측 표면이 접착제 닿는 면에 오도록 aros에 매립된 조직을 접착된 표면 위로 옮깁니다. 조직이 블록 위에 고정되면 움직이지 마십시오. aros 매립 조직이 포함된 vibrate tone 블록을 얼음 위에 놓고 접착제가 15분 동안 건조되도록 둡니다.

그동안 준비된 조직 챔버를 24웰 플레이트에 웰당 하나씩 배치하십시오. 조직 챔버가 들어 있는 웰에 차가운 1X PBS 1 mL를 채우고 플레이트를 얼음 위에 둡니다. 접착제가 마르면, 진동 블레이드를 조직의 상단 표면 높이까지 내립니다.

Vibram 속도를 0.22 millimeters per second로 설정하고, 전진 운동으로 절편 제작을 시작하여 200 micrometer 두께의 절편을 만듭니다. 수채화용 소프트 브러시를 사용하여 뇌 절편 하나를 각각의 조직 챔버로 옮깁니다. 조직의 분해를 방지하기 위해 절편 제작이 완료될 때까지 24 well plate를 얼음 위에 유지하십시오.

다음으로, S myelin protio lipid protein 1 39 to 1 51 dextro 및 CD four 항체가 포함된 칵테일 300 microliters를 웰 3개에 첨가하여 두 번째 24 웰 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 대조군인 S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 to 86 dextro 및 CD four 항체 칵테일 300 microliters를 다른 웰 3개 세트에 첨가합니다. 이어서 웰에 라벨을 부착합니다.

그 다음, 특정 dex trimmers로 염색할 절편이 들어 있는 조직 챔버 3개를 24-웰 플레이트의 지정된 3개 웰에 웰당 하나씩 옮깁니다. 마찬가지로, controlled dex streamers로 염색할 절편이 들어 있는 조직 챔버 3개를 해당 웰들에 옮깁니다. 웰당 하나의 챔버가 들어간 상태에서 뚜껑으로 웰들을 덮습니다.

플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고, 상온의 암소에서 1.5시간 동안 완만하게 회전하도록 설정된 로킹 플랫폼(rocking platform) 위에 둡니다. 배양 시간이 지난 후, 조직 절편을 1 mL의 차가운 1 XPBS 세척액이 들어 있는 새 웰로 옮겨 로킹 플랫폼에서 최소 10분 동안 세척합니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다.

조직 절편이 챔버 벽면에 달라붙을 수 있으므로 건조되지 않도록 주의하십시오. 조직 챔버를 새로운 웰로 옮겨 절편을 고정합니다. 필터링된 4% PBS 완충 파라포름알데히드 1 mL가 담긴 24웰 플레이트에 넣고, 로킹 플랫폼 위에서 완만하게 회전시키며 2시간 동안 배양합니다.

절편을 세 번 더 세척한 후, 염색 및 고정이 완료된 절편을 깨끗한 현미경 슬라이드 위에 올립니다. 수채화용 부드러운 붓을 사용하여 절편에 닿지 않게 여분의 물기를 닦아내고, 마운팅 매질을 사용하여 절편을 마운팅합니다. 현미경 커버슬립으로 덮고 슬라이드를 실온에서 하룻밤 동안 건조시킵니다.

암실에서 Nikon A1 Eclipse 90i 공초점 현미경 시스템을 사용하여 일반적인 스캐닝 및 이미지 획득을 수행합니다. 시작하려면 NIS-Elements AR 소프트웨어를 실행하고, 패널에서 tetraethylrumine isothiocyanate(TRITC) 및 cyanine 5(Cy5) 채널을 선택합니다. TRITC 및 Cy5 채널의 여기 및 방출 파장은 기본값으로 표시됩니다.

Trit Sea 채널에는 녹색, SCI five 채널에는 적색의 가색을 할당하십시오. 검사할 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 놓고 100배 배율에서 수동으로 초점을 맞춥니다. HV를 110으로, 오프셋을 0으로 설정한 뒤 focus를 클릭하고 전압을 조정하십시오.

레이저를 최적화하려면 focus scan을 클릭하여 섹션을 위에서 아래로 스캔하고 이미지 획득을 위한 Z 레벨을 설정하십시오. 그런 다음 CH series를 클릭하여 이미지를 순차적으로 획득하십시오. 적색 및 녹색 채널 모두에서 생성된 신호의 공국소화를 바탕으로 노란색 점상 세포로 나타나는 dextro 또는 positive CD four positive T 세포를 식별하십시오.

dextro 또는 CD4 양성 T 세포의 간편한 정량적 수치 계산을 위해 Olympus FV 500 BX 60 공초점 현미경을 사용하십시오. 먼저, flu ovu 소프트웨어를 실행합니다. 드롭다운 메뉴에서 염료 S SI 3와 SCI 5를 선택하고 apply를 클릭하여 해당 레이저를 로드합니다.

검사할 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 놓고, SI 3 레이저가 켜진 상태에서 저배율로 수동 초점을 맞춘 뒤 클릭 포커스를 사용하여 염증 병변에 초점을 맞춥니다. 대물렌즈를 100배 배율로 변경합니다. 드롭다운 메뉴에서 파일 크기를 512 x 512로 설정하고, 클릭 포커스를 누른 후 PMT gain과 offset 값을 조절하여 SI 3와 SI 5 레이저를 각각 최적화합니다. Z 스테이지를 클릭한 다음, 두 레이저가 모두 켜진 상태에서 포커스를 클릭합니다.

위아래 화살표를 클릭하여 Z 스테이지의 두께를 설정하십시오. Z 간격을 2 µm로 설정하십시오. 중지 버튼을 클릭하고 선택하십시오.

1, 2, 3 축을 탐색하십시오. 그런 다음 X, y, Z를 클릭하고 염증 초점 내의 선택된 영역에 대해 Z-시리즈 이미지 획득을 시작하며, Z-시리즈 이미지를 VI 파일로 저장하십시오. 이미지 파일을 저장하려면 Z-시리즈 이미지에서 이미지를 선택한 다음 TIFF 형식으로 저장하십시오.

항상 multi TIFF 이미지로 저장하십시오. 데이터 보호를 위한 첫 번째 단계 이후, 두 세트의 dex trimmers로 모두 염색된 세 개의 쌍을 이룬 절편을 검사합니다. 먼저, 동일 초점 내에서 Z 시리즈가 중복되는 것을 방지하기 위해 슬라이드를 가로-세로-위-가로-세로-아래 방향으로 스캔하여 Z 연속 이미지를 촬영하십시오.

Z-축 연속 이미지를 캡처한 후, 슬라이드 번호, 절편 명칭 및 촬영한 Z-축 연속 이미지 수를 식별하여 파일 이름을 지정하십시오. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 CD4 양성 T 세포의 총 수 대비 dextro 양성 CD4 양성 T 세포의 수를 측정하십시오. ImageJ에서 카운터 유형을 선택하고 'show all'을 체크한 다음, 각 세포의 중심을 클릭하여 계수를 시작하고 측면 화살표를 사용하여 서로 다른 Z-축 연속 이미지에서 계수를 계속하십시오.

모든 CD4 T 세포를 계수한 후, 다른 유형의 카운터를 선택하여 dextro 양성 CD4 양성 T 세포를 계수하십시오. 결과 탭을 클릭하여 두 가지 서로 다른 카운터로 계수된 총 세포 수를 확인하십시오. myelin protio lipid protein 또는 PLP 특이적 CD4 T 세포의 검출은 EAE 마우스에서 유래하여 신선하게 절단된 대뇌 절편을 사용하여 수행되었으며, anti CD4 및 PLP 1 39 to 1 51 Dexter 또는 대조군 TMEV 70 to 86 Dexter를 포함하는 칵테일로 염색한 후 LSCM으로 관찰하였습니다.

이중 염색된 뇌 절편을 분석하면 red로 표시된 PLP 1 39 to 1 51 dex trimmers 양성 세포와 green으로 표시된 CD four 항체 양성 세포가 나타나며, 이중 양성 세포는 yellow로 나타납니다. 이중 염색된 세포들은 주변부에 점상 반점(punctate dots)을 보였습니다. 이러한 특징은 대조군인 TMEV 70 to 86으로 염색된 절편에서는 나타나지 않았습니다.

심장 마이오신 특이적 CD4 T 세포를 검출하기 위해 cardiac myosin heavy chain alpha 3 34 to 3 52 Dexters를 이용한 in situ 염색이 수행되었습니다. LSCM을 통해 이러한 이미지들을 분석한 결과, MYHC 3 34 to 3 52 dexters 양성 세포는 빨간색으로, CD4 양성 세포는 초록색으로, 그리고 Dexter와 CD4 모두에 결합된 세포는 노란색 점상 세포로 나타남을 확인하였습니다. 대조군 RNA인 43 to 56 Dexters의 배경 염색은 무시할 수 있는 수준이었습니다. 이 기술을 숙달하여 적절히 수행한다면, 기존에 발표된 다른 프로토콜의 3일이 소요되는 것과 달리 약 8~10시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 실험 과정을 수행할 때는 시약을 미리 준비하고 각 단계를 체계적으로 따르는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 표적 조직 내 C-반응성 CD4 T 세포의 수를 측정하기 위해 조직을 절편화하고 염색하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.