조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

이 절차의 전체적인 목표는 쥐 조직으로부터 순수하고 호흡 능력이 있는 미토콘드리아를 빠르게 분리하는 것입니다. 이는 먼저 조직 샘플을 결합하고 균질화함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 균질액에 subin A를 혼합하여 얼음 위에서 배양하는 것입니다.

이어서 균질액을 BSA와 혼합하여 여과한 후, 다시 한번 여과합니다. 마지막 단계로 여과액을 원심 분리하고 미토콘드리아 펠릿을 호흡 완충액(respiration buffer)에 재현탁합니다. 최종적으로, 호흡 분석과 ATP 발광 분석(ATP luminescence assay)을 통해 분리된 미토콘드리아가 생존해 있으며 호흡 능력이 있음을 확인할 수 있습니다.

미토콘드리아 분리 시간이 60분에서 100분까지 소요되는 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 생존 가능하고 호흡 능력이 있는 미토콘드리아를 30분 이내에 분리할 수 있다는 점입니다. 협력 연구실의 기술자인 Allison mackay가 시작 직전에 ATP 발광 분석법(ATP luminescence assay)을 시연할 예정입니다. subin A를 균질화 버퍼 1 mL에 녹이고, BSA 또한 균질화 버퍼 1 mL에 녹이십시오.

이제 6mm 생검 펀치를 사용하여 신선한 조직 샘플 두 개를 채취하고, 50mL 원심분리 튜브에 담긴 XPBS 내의 얼음 위에 보관하십시오. 준비가 되면 조직을 5mL의 차가운 균질화 완충액이 들어 있는 해리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 조직 해리 장치에 장착하고 미리 설정된 미토콘드리아 분리 사이클을 선택하여 조직을 균질화하십시오.

완료되면 튜브를 다시 얼음 위에 놓고 250 µL의 sub to lyin 스톡 솔루션을 첨가합니다. 도립 혼합하여 섞어줍니다. 혼합물이 균일하게 분포된 것으로 보이면, 균질액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.

다음으로, 50 milliliter 원추형 원심분리 튜브에 40 micron 메쉬 필터를 장착하고 이를 얼음에 박아둡니다. 균질화 완충액으로 필터를 적신 후, 해당 완충액은 폐기물 용기에 버립니다. 모든 준비가 완료되면, 균질액을 부어 여과액을 수집합니다.

BSA 스톡 솔루션 250 µL를 첨가하고 뒤집어서 혼합합니다. 단, 미토콘드리아 단백질 분석의 경우 이 단계는 생략해야 합니다. 이제 두 개를 더 준비하십시오.

얼음 위에 50 milliliter 원뿔형 원심분리 튜브 두 개를 준비하여, 하나에는 40 micron 필터를, 다른 하나에는 10 micron 필터를 장착합니다. 두 필터 모두 소량의 균질화 버퍼(homogenizing buffer)로 적신 후, 이 버퍼는 버립니다. 그다음 균질액을 먼저 40 micron 필터에 통과시키고, 이어서 10 micron 필터에 통과시킵니다.

이러한 여과 단계는 미토콘드리아의 순도를 상당히 높여줍니다. 이제 여과액을 미리 냉각된 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브 두 개에 나누어 담고, 4 °C에서 9,000 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 제거하고, 정제된 두 개의 미토콘드리아 펠릿을 재부유하여 하나로 합칩니다.

1 mL의 얼음처럼 차가운 호흡 완충액 내에서, 전체 과정이 4 °C에서 수행되는 것이 매우 중요합니다. 이제 정제된 미토콘드리아를 통해 분리된 미토콘드리아의 대사 활성을 측정할 수 있습니다. ATP assay 키트를 사용하여 ATP 발광 분석을 수행할 수 있습니다.

먼저, 키트 시약을 상온으로 맞춥니다. 다음으로, HT P 표준 용액을 준비하여 얼음에 둡니다. 그다음 단계는 동결 건조된 기질 용액에 5 mL의 기질 완충액을 첨가하는 것입니다.

이를 부드럽게 혼합한 후 암소에 보관하십시오. 그다음 불투명한 검정색 96 웰 플레이트의 각 웰에 100 µL의 호흡 완충액을 첨가하십시오. 준비된 미토콘드리아 10 µL를 ATP 표준 시료 아래의 웰들에 첨가하십시오.

각각의 고유한 미토콘드리아 샘플은 3반복으로 플레이팅해야 하며, 음성 대조군으로서 호흡 완충액만 들어있는 웰 3개를 함께 플레이팅합니다. 로딩이 완료되면 모든 웰에 포유류 세포 용해액 50 µL를 첨가합니다. 플레이트를 120 RPM의 오비탈 셰이커에서 37 °C로 5분간 배양합니다.

인큐베이션 동안, 0.1 mM에서 0.1 µM 범위의 ATP 표준액 희석액을 준비합니다. 인큐베이션 후, 각 ATP 표준액 10 µL를 플레이트 맵에 표시된 해당 웰에 첨가합니다. 다음으로, 각각에 재구성된 기질 용액 50 µL를 첨가합니다.

그 다음, 이전과 동일하게 플레이트를 5분 동안 다시 배양하십시오. 플레이트 리더기에서 플레이트를 검사하는 단계를 진행하십시오. 아래의 소프트웨어를 실행하십시오.

새 항목을 생성합니다. 실험을 클릭하십시오. 그런 다음 기본 프로토콜을 클릭하고 확인을 클릭하십시오.

왼쪽 열에서 프로토콜을 선택하십시오. 그런 다음 절차를 선택하고 Next를 누릅니다. 다음으로 지연 시간을 선택하고 10분으로 설정하십시오. 그런 다음 입력 사항을 확인(okay)하십시오.

이제 선택 후, 드롭다운 메뉴에서 luminescence를 읽기 항목으로 선택하십시오. 나머지 설정은 다음과 같이 조정합니다. Read type은 endpoint, integration time으로 설정하십시오.

1초로 설정하십시오. 필터 세트의 방출 홀 광학 위치를 설정하고, 최고 감도를 100으로, 상단 프로브 수직 오프셋을 1 mm로 설정하십시오. 이러한 설정 변경을 완료한 후 확인을 클릭하십시오.

플레이트 레이아웃을 클릭하고 그에 맞게 설정하십시오. 확인을 클릭합니다. 모든 설정이 완료되면, 상단 행의 플레이트 읽기 아이콘을 클릭하고 읽기를 클릭하십시오.

분광광도계가 열리면, A1 웰이 왼쪽 상단 모서리에 오도록 플레이트를 트레이에 놓습니다. 이제 온도를 표시하는 상자가 나타나면 확인을 클릭한 후 데이터 분석을 진행합니다. 입자 크기 계수를 기준으로, 습중량 약 0.18 g의 골격근 샘플에서 약 240억 개의 미토콘드리아가 얻어졌습니다.

동일한 크기의 간 샘플에서 수십 억 개가 더 얻어졌습니다. 입자 계수기를 사용했을 때 미토콘드리아 혈구계수기 측정값이 과소평가되었습니다. 대표적인 추적 곡선을 얻었으며, 이는 분리된 미토콘드리아가 평균 직경 약 0.4 µm의 단일 피크 아래에 국한되어 있음을 보여줍니다.

이는 bi acid assay를 이용한 이전 보고들과 일치합니다. 골격근과 간 조직의 미토콘드리아 단백질은 조직 1g당 수 mg으로 측정되었습니다. 생성물은 생존 가능했으며 호흡 능력을 갖추고 있었습니다.

임상 및 외과적 치료 개입에 적합한 시간 범위 내에서 미토콘드리아를 분리하였습니다. 투과전자현미경 사진 확인 결과, 분리된 미토콘드리아는 모두 전자 밀도가 높았으며 손상률은 10,000개당 1개 미만이었고, ATP 분석 결과 오염도는 100,000개당 1개 미만이었습니다. 분석 결과 미토콘드리아는 활성 상태였으며, ATP 함량은 미토콘드리아 단백질 mg당 약 11 또는 15 nanomoles였습니다.

Clark 타입 전극을 사용하여 미토콘드리아 호흡 분석을 수행한 결과, 산소 소비량은 미토콘드리아 단백질 1 mg당 분당 약 180 nmol의 산소로 나타났습니다. RCI 값은 각각 약 2.5였으며 간 점수가 약간 더 높았습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있습니다.