성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

이 절차의 전반적인 목표는 조혈 줄기 세포와 전구 세포를 포함하는 고해상도 3D 스택을 얻고 다지점 타임 랩스 이미징을 통해 시간 경과에 따라 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 조혈 줄기 및 전구 세포 또는 HSC에 친유성 염료를 표시함으로써 이루어집니다. 그런 다음 HSC를 수신자 마우스에 주입합니다.

마우스는 안정적인 동물 위치를 위해 맞춤형 헤드피스와 표본 홀더를 사용하여 현미경 검사를 준비할 수 있습니다. 다음으로, 조혈 줄기 및 전구 세포 틈새의 고해상도 스택을 얻고 HS PC를 포함하는 여러 골수 위치의 타임 랩스 이미징을 궁극적으로 생체 공초점 내에서 수행하고 두 개의 광자 현미경을 사용하여 골수 공간에서 HSC의 위치 및 움직임을 보여줍니다. 골수 절편에 대한 면역 형광과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 4차원 규모, 3차원 및 시간으로 정보를 캡처할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 함의는 혈액 질환 치료로 확장되는데, 이는 올바른 기능을 보장하기 위해 골수 내 조혈 줄기 세포를 어디로 유도해야 하는지 이해하는 데 도움이 되기 때문입니다. 우리는 시간이 지남에 따라 HS PC를 따라갈 수 있는 것이 얼마나 중요한지 처음으로 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 이 방법은 줄기 세포가 어디에 있고 시간이 지남에 따라 어떻게 행동하는지 알고 싶은 줄기 세포 틈새 분야에 대한 모든 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.

먼저 이 실험실에서 이전 geo 비디오에서 입증하고 텍스트 프로토콜에서 참조한 대로 조혈 줄기 세포와 전구 세포를 수확합니다. 다음으로, 친유성 염료 DID를 최종 농도 5마이크로몰로 세포 현탁액에 첨가합니다. 염료가 용액에서 침전되지 않고 세포에 라벨을 붙이지 않도록 즉시 현탁액을 소용돌이

세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 세포를 세척합니다. 먼저 500배 G에서 5분 동안 회전하고 액체를 디캔팅합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁시키고 인슐린 주사기에 수집합니다.

인슐린 주사기는 바늘 데드 스페이스가 없기 때문에 기존 주사기보다 권장됩니다. 쥐에 전체 세포 현탁액을 투여하여 치명적으로 세포를 주입 할 수 있도록 꼬리 정맥 주사를 통해 쥐를 방사했습니다. 먼저 마우스를 따뜻한 방에 넣습니다.

꼬리 정맥이 혈관 확장되어 나타나면 마우스를 구속기로 이동합니다. 바늘을 꼬리 정맥에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 세포를 정맥에 주입합니다.

주입에 대한 저항이 없어야 합니다. 밤새 마우스를 그대로 두십시오. 세포가 골수 공간으로 이동할 수 있도록 마우스를 마취하고 꽃잎 반사를 통해 심부 마취의 시작을 모니터링합니다.

두피 윗부분을 70% 에탄올로 면봉으로 닦습니다. 마우스의 눈에 에탄올이 들어가지 않도록 주의하십시오. 이미징할 칼바륨 부위를 노출시키려면 피부를 위로 잡고 집게로 피부를 들어 올려 귀 사이의 머리 뒤쪽을 작게 절개합니다.

가위를 피부 아래로 밀어 넣고 원하는 이미징 영역의 바깥쪽을 따라 부드럽게 자릅니다. 노출된 뼈를 멸균 PBS를 적신 멸균 면봉으로 닦아 뼈를 촉촉하게 유지합니다. 이렇게 하면 이미징 품질에 영향을 줄 수 있는 과도한 건조와 흉터를 방지할 수 있습니다.

다음으로, 유청 보트에 적당량의 치과용 시멘트를 반죽이 될 때까지 섞습니다. 두개골에 부착될 오토클레이브 헤드피스의 바닥 표면에 빠르게 적용하십시오. 시멘트가 굳기 전에 헤드피스를 마우스의 두개골에 놓고 이미징 영역에 치과용 시멘트가 묻지 않도록 하고 굳을 때까지 기다립니다.

두개골을 촉촉하게 유지하는 소량의 인트라 하이드로겔을 바르고 시멘트가 건조될 때 시멘트를 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 헤드피스를 홀더에 부착하고 제자리에 고정합니다. 나사를 사용하여 홈이 홀더 노치 내에 맞는지 확인합니다.

현미경으로 옮기기 전에 멸균 면봉으로 하이드로겔을 제거합니다. 그런 다음 홀더를 현미경 스테이지에 삽입하고 마우스 아래에 가열 매트를 배치합니다. 직장 온도계 프로브를 삽입하고 접착 테이프로 스테이지의 모든 것을 제자리에 고정합니다.

마취제를 바르는 동안 눈이 건조해지지 않도록 마우스의 눈에 안과 연고를 한 방울 떨어뜨립니다. 마우스는 마취 상태에서 이미징 과정 중 어느 때도 방치되어서는 안 됩니다. 눈꼬리를 통해 두개골에 초점을 맞춥니다.

먼저, 물 담그기 렌즈를 사용하여 calvarium 이미징 창에 정제된 멸균수를 채웁니다. 물방울에 닿도록 내립니다. 현미경 안안렌즈를 사용하여 두개골 상단에 초점을 맞춥니다.

이미징 영역을 중앙 봉합사에 배치하고 머리 뒤쪽으로 이동하여 관상 봉합사를 찾습니다. 시작 위치로 소프트웨어를 XY 이미지와 3개의 DZ 스택을 캡처하기 위한 모드로 설정합니다. 이미징 속도를 400Hz로 설정하고 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정합니다.

여러 채널이 캡처되도록 소프트웨어를 설정하고 수집 방법을 설정하여 스택 간 또는 프레임 간 설정을 변경합니다. 세 가지 독립적인 캡처 설정을 지정합니다. 각 스택의 획득이 끝날 때 레이저 조명을 끕니다.

그런 다음 두 광자 두 번째 고조파 생성 뼈 신호에 대한 첫 번째 순차 스캔을 설정합니다. 다중 광자 레이저의 셔터를 열고 다중 광자 레이저 게인 및 오프셋이 올바르게 설정되었는지 확인합니다. 또한 레이저 출력이 12.5-25%이고 레이저가 켜져 있는지 확인하십시오.

적절한 PMT를 유일한 검출기로 선택하고 색상을 흰색으로 변경합니다. 두 번째 설정에서 자가형광과 DID를 결합한 채널 설정 절차를 반복합니다. 두 개의 적절한 p mts를 사용하여 스캔합니다.

자가형광의 경우 채널 색상을 녹색으로, DID의 경우 빨간색으로 변경합니다. 마지막으로 GFP 감지를 위한 세 번째이자 마지막 스캔을 설정합니다. 488 나노미터 레이저 라인의 레이저 출력을 약 15%로 설정합니다.적절한 광 증배관 또는 PMT를 유일한 활성 검출기로 선택하고 의사 색상을 녹색으로 변경합니다.

라이브 이미징 모드를 활성화하여 사전을 시작합니다.view 선택한 채널의 스캔을 선택하고 최적의 노출을 위해 검출기 게인과 오프셋을 조정합니다. 순차 창에서 각 스캔에 대해 이 작업을 반복하고 쉽게 재사용할 수 있도록 이러한 다중 채널 스캔의 설정을 저장합니다. 그런 다음 이 소프트웨어에서 mark and find라고 하는 다중 위치 캡처를 활성화하고 좌표 점을 재설정합니다.

다음으로, 중심 봉합사와 관상 봉합사 사이의 교차점에서 시작하여 뼈 이미징 영역을 스캔합니다. 복합 보기로 자가형광과 DID를 모두 사용하여 골수 영역의 깊이를 스캔합니다. 셀이 감지되면 마크와 창의 왼쪽에 있는 새 위치 추가 아이콘을 클릭하여 이를 새 좌표 위치로 표시합니다.

현재 시야를 검사한 후 스테이지를 한 시야각의 거리만큼 이동합니다. 각 시야에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 중앙 봉합사의 왼쪽에 있는 전체 이미징 창 주위를 점차적으로 작업하면서 마우스의 코를 향해 이동합니다.

중앙 봉합사 분기점이 보이면 봉합사의 오른쪽으로 이동하여 절차를 반복합니다. 왼쪽을 반대 방향으로 스캔합니다. Mark and Find 도구를 사용하여 관심 있는 새 셀의 좌표를 표시합니다.

점을 검토하려면 각 위치에 대한 각 셀 주위에 Zs 스택의 위쪽과 아래쪽을 설정합니다. 각 포인트에 대해 위아래로 초점을 맞추고 3개의 DZ 스택 캡처를 위한 상단 및 하단 Z 위치를 설정합니다. 마크 및 찾기의 개별 지점을 업데이트하고 Zack 간격을 5마이크로미터로 설정하고 각 순차 스캔 채널의 평균을 적절한 품질로 설정합니다.

전체 스캔 절차를 시작하여 각 관심 지점에 대한 고품질 참조 스택을 확보합니다. 고품질 스캔이 완료되면 캡처에 대한 타임랩스 설정 및 타임랩스 설정을 활성화합니다. 시간 간격을 5분으로 설정하고 전체 런타임을 원하는 길이로 설정합니다.

이러한 설정을 전체 검사에 적용합니다. 이 예는 3개 이상의 포인트 획득을 수행하는 방법을 보여줍니다.이러한 설정을 수정하면 해상도를 512 x 512 픽셀로 제한하는 평균화에 사용되는 스캔 수를 줄여 5분 타임랩스 간격을 허용하도록 스캔 시간을 줄일 수 있습니다. 스캔을 양방향으로 변환하거나 스캔 속도를 600헤르츠 이상으로 높이면 시작 버튼과 시연된 소프트웨어를 클릭하여 이전과 같이 이미징을 시작합니다.

이미징이 완료되면 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 마우스 안락사를 수행합니다. calvarium imaging window를 포함한 맞춤형 고정밀 마우스 홀더를 사용하면 콜라겐에서 약 90-120 μm 두께의 골수 영역을 포함하는 HSPC의 단일 세포 해상도 3D 스택에 주입 된 라벨링 된 HS PC의 장시간 이미징을 가능하게합니다. 뼈는 흰색으로 표시되며, DID로 표시된 세포는 빨간색으로 표시됩니다.

자가형광 세포는 노란색으로, 조골세포 세포는 녹색으로 표시됩니다. 여기에 표시된 것은 식별된 HS PC의 40 타임랩스 동영상으로, 빨간색으로 표시된 HSC로 표시된 DID가 녹색의 조골 세포 근처에서 이동하는 것을 보여줍니다. 이 기술은 수술 및 초기 이미징을 위해 약 한 시간 내에 수행할 수 있어야 하며 타임랩스 이미징을 위한 적절한 시간이 뒤따라야 합니다.

이 비디오를 시청하고 나면 마우스 캘버의 이미징을 설정하고 시간이 지남에 따라 여러 HS PC를 볼 수 있다는 데 상당한 자신감을 갖게 될 것입니다.