Name: 성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 배우세요 성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4차원 추적 방법을. 이 기술은 줄기세포 틈새 역학과 혈액 질환 치료에 대한 새로운 통찰을 제공합니다.

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영상은 박사 마틴 Spitaler에 의해 관리 임페리얼 칼리지 런던 (Imperial College London)의 FILM 시설 내에있는 수직 라이카 SP5 공 초점 현미경을 실시 하였다. 시편 홀더와 헤드 피스는 사무엘 존스 박사 사이먼 슐츠의 조언과 임페리얼 칼리지 런던 (Imperial College London)의 화학 공학과와 공동으로 이루어졌다. 니콜라 Ruivo, 시스코 디아즈와 임페리얼 칼리지에서 CBS 직원은 마우스 사육에 자신의 지원과 조언을 쓸모 있었다. 마크 스콧 CRUK, KKLF, BBSRC 및 HFSP에 의해 CRUK와 크리스티나 소호되었습니다 Celso에 의해 HFSP 및 FILM, Olufolake Akinduro에 의해 투자된다.

동물의 사용과 관련된 모든 절차는 로컬 법에 따라 수행된다. 우리의 연구는 영국 홈 오피스뿐만 아니라, 임페리얼 칼리지 윤리적 검토 패널에 의해 승인되었습니다. 허용되는 절차는 프로젝트 라이센스 문서에 설명 된 모든 시간에 동물의 복지를 보장 지침을 준수하고 있습니다. 작업이 수행되는 나라의 동물 실험에 대한 법률을 준수해야합니다. 1 레이블과 HSPCs 사출 : <ol><li> 소호되었습니다 Celso 14 ~ 15에 의해 설명 된대로 수확 세포. </li><li> PBS에 10 6 세포 / ml의 농도로 세포를 준비한다. NOTE : 세포를 세는 혈구 또는 셀 소터에 의해 제공된 정보를 사용하여; 표지와 주입되는 셀의 수는 (20,000 - 조혈 모세포, 100,000 - 10,000 예컨대 얼룩 300,000의 HPC)를 세포 종류에 따라 다르며 이하 10 5 세포, PBS 100 ㎕에 재현 탁 작업하는 경우; 혈청 얼룩을 억제로는, 임의의 혈청없이 PBS에서 세포를 갖는 것이 중요하다. </li><li> 5 μM의 최종 농도에서 세포 현탁액에 않았고 용액으로부터 석출 셀 라벨을 실패하지 않는 염료를 보장하기 위해 현탁액을 즉시 와동 추가한다. </li><li> 5 분 동안 500 XG에서 회전 액체를 경사 분리 및 IV 주입 (- 150 μL ~ 100)에 적절한 볼륨의 펠렛을 재현 탁하여 세척 한 후 37 ° C에서 10 분 동안 품어 </li><li> 200 ㎕의 PBS에 재현 탁하고 세포를 인슐린 주사기에 수집한다. 참고 : 마우스로 전체 세포 현탁액을 관리 할 수​​ 있으므로 더 바늘 죽은 공간이 없으며 때문에 인슐린 주사기는 기존의 주사​​기를 통해 권장합니다. </li><li> 꼬리 정맥 주사를 통해 치명적으로 조사 된 마우스로 세포를 주입한다. 주 : TI를 통해 개발 골수 미세 환경 (조혈 및 기질 구성 요소를 모두)에 대한 조사 알려져있다 상당한 영향나. 그것은 일관된 사출 용 타이밍, 셀 주입 (최상 생착 대한 조사에서 4-24 시간) 및 이미징을 유지하는 것이 매우 중요하다. 여기 조사는 주입 전에 6 시간을 수행하고 영상은 주사 후 20 시간 수행됩니다. <ol><li> 꼬리 정맥이 vasodilated 나타날 때까지 따뜻한 챔버 (37 ° C)에 마우스를 놓습니다. </li><li> 제한 수단으로 마우스를 이동 조심스럽게 꼬리 정맥에 바늘을 밀어 넣습니다. </li><li> 정맥에 세포를 주입 - 주입에 아무 저항이 발생 될 수 없습니다. </li><li> 세포가 골수 스페이스로 이주 할 수 있도록하기 위해 마우스 O / N을 남기기. </li></ol></li></ol> 2 이미징을위한 마우스 준비 <ol><li> 미세 겸자 일쌍 한 미세 쌍이 위뿐만 아니라 멸균 환경에서 사용하기 전에 헤드 피스 및 저장소를 압​​력솥. </li><li> 가능한 한 신선한로 마취​​를 확인 (0.38 ML 케타민 + 0.25 ㎖의 Medetomidine + 4.47 ㎖의 물). 참고 : OT이소 플루 란 등의 주사를 포함하여 그녀의 승인 마취제은 너무 유효합니다. 1 시간마다 45 분 관리 50 μL - 설명 칵테일 (30)의 상단 업으로, 체중 10g 당 0.1 ㎖의 복강 내 투여한다. </li><li> 필요한 경우 메시지가 표시되면 다음 단계를 교정, 현미경 및 소프트웨어를 시작 두 광자 레이저에 전환합니다. 레이저에 전환하고 워밍업 및 이미징을위한 마우스를 준비하는 동안 안정화 할 수 있습니다. </li><li> 복강 내 주사를 통해 선택된 마취 용 준비 마취 혼합물 (단계 2.2)를 사용하여 마우스를 마취. 현재와​​ 프로토콜에 걸쳐 정기적으로 페달 반사를 통해 깊은 마취의 발병을 모니터링합니다. 참고 : 마우스가 절차를 통해주의 깊게 모니터링하고 마취가 경감 될 나타나는 경우해야 - (2.2에서 설명하는대로) (일반적으로 +45 60 분) 후 최고 최대 용량을 관리 할 수​​ 있습니다. 다양한 연령과 성별의 쥐 사이에 어떤 변화를 기대합니다. 그것은 떠오입니다적절한 예방 조치를 확인하기 위해 해당 지역의 수의학 담당관 마취 프로토콜을 논의하기 위해 TANT은 마우스의 복지를 보장하기 위해 가져옵니다. </li><li> 마우스의 눈에 들어 에탄올을 얻을 않도록하면서, 조직에 70 % 에탄올로 두피의 상단 면봉. </li><li> 멸균 된 핀셋 및 가위를 사용하여, 신중하게 묘화 될 수있는 두 개관 영역을 노출하는 두피 중앙부를 제거 포셉 피부를 올려 귀 사이의 후두부에 작은 절개를. 피부를 잡고있는 동안, 피부 아래에 가위를 밀어 부드럽게 원하는 이미징 영역의 바깥 쪽을 따라 절단. </li><li> 습기를 유지하기 위해 멸균 PBS에 적신 멸균 면봉 노출 된 뼈를 닦습니다. </li><li> 이미징을위한 준비 마우스의 두개골 금속 헤드 부분을 연결합니다. <ol><li> 이 페이스트가 될 때까지 계량 보트 치과 용 시멘트를 적당량 혼합하고 빠르게 S에 부착된다 헤드 피스의 저면에 적용컬 소장. </li><li> 시멘트 설정하기 전에, 다음, 확인 이미징 영역에있는 모든 치과 시멘트 묻지 않도록하고, 마우스의 두개골에 투구 배치가 설정 될 때까지 기다립니다. </li><li> 두개골 촉촉한 유지 사이트 내 히드로 겔의 작은 금액을 적용합니다. </li></ol></li><li> 홀더에 헤드 피스를 부착하고 홈이 홀더의 홈에 맞춰 보장, 나사를 사용하여 제자리에 고정합니다. </li><li> 현미경으로 전송하기 전에 멸균 PBS로 멸균 면봉 두개골 깨끗한에서 하이드로 젤을 제거합니다. </li><li> 현미경 단계에 홀더를 삽입 마우스 아래에있는 난방 매트를 놓고 직장 온도계 프로브를 삽입하고 접착 테이프로 무대에 장소에 모든 것을 고정합니다. </li><li> 그들이 마취에서 동안 건조하지 않도록 마우스의 눈에 안과 연고의 작은 방울을 놓습니다. 참고 : 마취 상태에서 마우스 이미징 프로세스 중 언제라도 방치하지 마십시오. </li></ol>생체 이미징 : 고해상도 스택 및 시간 경과 취득 <ol><li> 눈 조각을 통해 두개골에 초점을 맞 춥니 다. <ol><li> , 정제, 멸균 물과 물 침지 렌즈를 사용하여 이미지 창을 채우기는 물방울 닿도록 내려 놓습니다. </li><li> 광원으로서 외부 램프를 사용하여, 현미경 접안 렌즈를 이용하여 두개골 위에 초점. </li><li> 중앙 봉합에 촬상 영역을 배치하고 시작 위치로서 코로나 봉합사를 찾는 헤드의 후방을 향해 이동한다. </li></ol></li><li> 여기 및 발광 표에 지정된 해당 형광체의 유효 여기 및 검출을 허용하도록 현미경을 설정한다. 참고 : 기존의 검류계 스캔 헤드가 LAS-AF 소프트웨어 플랫폼을 실행하는 라이카 SP5 똑바로 공 초점은 여기에 사용되는 반면, 프로 시저가 쉽게 다른 현미경 / 소프트웨어 플랫폼에 복제 할 수 있습니다. 여기에 사용되는 렌즈는 라이카 HCX IRAPO L 25X W / B를 0.95 NA이며다른 제조사의 유타 해당하는 렌즈는 적절한 배율과 높은 NA 사용할 수 있습니다 <ol><li> 512 X 512 픽셀로 모두 XY 이미지뿐만 아니라 400 Hz에서 3D Z-스택 및 설정 이미징 속도와 해상도를 캡처 모드로 소프트웨어를 놓습니다. 참고 : 설치 및 하드웨어는 여기에 620 μM의 시야 결과이 다른 플랫폼과 다를 수 있습니다. </li><li> 다중 채널 / 트랙뿐만 아니라 수집 방법은 적어도 스택 가능한 경우 또는 프레임들 사이의 설정을 변경하는 설정되도록, 포착 될 수 있도록하는 소프트웨어를 설정한다. 각 스택의 취득의 끝에 레이저 조명을 끄, 세 독립적 인 캡처 설정을 설정한다. 참고 : 세 개의 채널 채널 사이의 크로스 토크를 줄이기 위해이 절차를 위해 필요합니다. </li><li> 설정이 광자 SHG 뼈 신호 (840 nm의 여기, 400-440 nm의 발광)를위한 제 순차 스캔 설정; MP 레이저에 셔터를 열고 M을 보장25 % 및 레이저가 켜진다 - P 이득 및 오프셋이 올바르게 설치하고, 레이저 파워는 12.5이다. 유일한 검출기 등의 적절한 PMT를 선택하고 색상을 흰색으로 변경합니다. 참고 : 사용할 수있는 밝고 깊은 신호를 달성하기 위해 적절한 때 필터 NDD 감지기는 뼈 검출을 위해 사용되어야한다. </li><li> 반복 채널 설정 결합 된 형광도에 대한 GFP 채널에 사용되는 절차 (543 nm의 여기, 560 - 600 ㎚ 방출) 및 DID (633 nm의 여기, 650-720 nm의 방출) 초 설정에서 두 적절한 PMT가를 활용하여 스캔 할 수 있습니다. 자가 형광 녹색, DID 빨간색으로 채널의 색상을 변경합니다. 참고 : 자동 형광 채널이 두 채널 오버레이 아르 DID 양성 세포를 쉽게 감지 할 수 있습니다 녹색으로 사용 - autofluorescent 세포 인해 두 채널의 동안 것에으로 노란색 / 오렌지색으로 표시했다 세포는 그들이 단지에 표시하기 때문에 빨간색으로 표시 채널을했다. 자동 형광 채널표시 목적은 GFP 채널과의 혼동을 피하기 위해, 사용자에 대해, 이것은 다른 컬러로 변경 될 수 있지만하고자하는 경우에만이 비교를 위해 사용되는 모든 최종 분석에 사용되지 않는다. </li><li> 마지막으로, 설치 GFP의 세 번째이자 마지막 스캔 (488 nm의 여기, 500-530 nm의 방출); 필수 후 약 15 %의 488 nm의 레이저 라인의 레이저 파워를 설정하거나 레이저 적절한 수준이 활성 검출기로서 적절한 PMT를 선택하고 녹색에 그 의사 색조를 변경, 사용되는 경우에 셔터가 개방되어 있는지 확인. </li><li> 선택된 채널의 미리보기 스캔을 시작하고 검출기 이득을 조정하고 최적의 노출을 상쇄하기 위해 &#39;라이브&#39;영상 모드를 활성화합니다. 연속 창에서 각 스캔에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> 쉽게 다시 이러한 멀티 채널 스캔의 설정을 저장합니다. 참고 :이 사용자가 이후 세션의 설정을 다시로드 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> &#39;마크라고도 다중 위치 캡처, 활성화차 입증 된 소프트웨어에서 &#39;찾아 좌표 점을 다시 설정합니다. </li><li> 중앙 및 관상 봉합의 교점에서 시작하여 뼈 촬상 영역을 스캔, 모두 자기 형광을 이용하여 골수 영역의 깊이를 스캔 (의사 녹색 컬러) 및 DID (의사 컬러 적색) 복합체보기. 참고 : autofluorescent 세포는 두 채널 모두에 존재하고 표지 세포가 합성 이미지 빨간색 전용 세포로 나타납니다 않은 반면, 합성 이미지에 노란색 / 오렌지 나타납니다. </li><li> 셀이 감지되면 마크 &quot;의 왼쪽에 새로운 위치 아이콘을 추가&quot;찾기 &quot;창을 클릭하여 도구를 새로운 좌표 위치 (X, Y 및 Z)로이 마크 &#39;마크와 찾기&#39; . </li><li> 뷰의 현재의 필드가 검토 된 경우, 왼쪽 / 오른쪽 / 위 / 아래 어느 뷰의 하나의 필드의 무대에게 거리를 이동합니다. 서서히 번째의 좌측 전체 촬상 창 주변 작동 뷰의 각 필드에 대해이 과정을 반복전자 중앙 봉합, 마우스의 코쪽으로 이동. 중앙 봉합 분기점 광경되면 봉합사의 우측으로 이동하여 (코로나 봉합을 향해, 즉 &#39;) 반대 방향으로 좌측 스캔 절차를 반복한다. 사용하여이자의 새로운 세포의 좌표 마크 &#39;표시를하고 찾기&#39;도구를. </li><li> 촬상 화면의 주사가 완료되면, &#39;마크 및 찾기&#39;를 사용하는 점을 검토 툴 (원하는 지점을 선택하고 개별적으로 각 점을 검토). 각 위치에 대한 각 셀 주위에 Z-스택의 상단과 하단을 설정, (많은 소프트웨어 플랫폼은 빈 공간을 캡처 감소 각 위치에 대한 독립적 인 Z-스택을 수행 할 수 있습니다). 각 지점의 경우, 최대 초점을 아래로 3D Z-스택 캡처 상단과 하단 Z 위치를 설정하고의 개별 지점을 업데이트 &#39;마크와 찾기&#39;. 도 5μm에 Z-스택 간격을 설정하고 적절한 품질에 대한 각 순차 스캔 채널에 대한 평균 : 라인 오R 프레임 평균. NOTE : 평균 스캔 할 수 늘리기가 획득 시간을 증가시킨다. </li><li> 전체 스캔 절차를 시작하여 관심있는 각각의 점에 대한 높은 품질 기준을 획득 스택 (종종 오히려 &quot;캡처&quot;보다 &#39;시작&#39;이라 함). 참고 :이 검사는 미래 고속 이미징에 대한 기준 역할을 할 수 있습니다. </li><li> 일단, 고품질의 스캔으로 완성 캡처 저속 설정을 활성화. </li><li> 저속 설정에서 원하는 길이 (예를 들어, 5 시간)으로 5 분, 전체적인 실행 시간에 시간 간격을 설정한다. 전체 스캔 이러한 설정을 &#39;적용&#39;. 주 : 5 분의 시간 경과 간격을 허용하기 위해이 검사 시간을 줄이기 위해, 한 평균화에 사용되는 스캔의 수를 줄일 512 X 512 픽셀의 해상도를 제한 할 필요 위상 정정 (양방향으로 스캐닝을 변환 할 필요가있다 ) 모두 스캔 방향을 정렬 및 / 또는 600 Hz에서 이상 (600 개 이상으로 스캔 속도를 증가Hz에서)를 보여 소프트웨어 플랫폼에 대한 이미징 영역의 확대의 원인이됩니다. 이것은 순차 촬상 모드가 초기 고화질 화상 스택을 획득하기 위해 사용되는 동안, 동시 취득이 경과 촬상 중에 속도를 증가시키는 데 사용된다는 점에 유의하는 것이 중요하다 -이 추가 배치 채널간에 약간의 혼선이 발생할 수있다 정확하게 분리 참조 스택의 초기 캡처에 대한 중요성. </li><li> (입증 된 소프트웨어의 &#39;시작&#39;버튼을 클릭하여 이전) 이미징 시작. 참고 : 건조하고 활력 징후 및 난방 패드의 온도를 모니터링하지 않습니다 정기적으로 필요할 때 마우스를 과잉 섭취하지 않도록주의, 더 작은 용량을 투여하여 마취의 적절한 수준을 유지 목적을 보장하기 위해 물을 위로해야 전역. </li><li> 완료되면, 직장 프로브와 시간에서 와이어를 보장 홀더에서 렌즈를 인상 한 후 현미경 스테이지에서 홀더를 제거매트를 먹는 것은 손상되지 않습니다. </li><li> 무대 홀더에서 투구를 풀고 조심스럽게 마우스를 제거합니다. 자궁 전위를 사용하여 마우스를 추려 두개골 떨어져 끼워 금속 머리 조각을 제거합니다. 디스크에 데이터를 저장하고 나중에 분석을 위해 서버로 전송합니다. 참고 : 머리 조각이 이상적으로 몇 시간 동안 아세톤에 침지 마지막 잔여 시멘트 오프를 문질러 청소한다. </li></ol>

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무엇을 성취했다? 프로토콜은 마우스 두개골 골수 정제하여 FACS의 이주, 생체 표지, 이식 HSPCs을 모니터링 경과 다차원 이미징을 사용한다. 하나의 이식 세포의 확인이 달성되었고, 이러한 고정밀 시간 (시간)의 장기간에 걸쳐 모니터링 하였다. 호흡에 의한 움직임 아티팩트는 최소화하고 세포를 반복적으로 오랜 시간에 걸쳐 이미지를 다시하고있다. 향후 방향은 무엇입니까? 기술의 발전은 단축과 주 (마우스에 대해 복구 프로세스를 단순화하기 위해 주 이상 및 이소 플루 란과 같은 가스 마취제의 사용 과정을 통해, 여러 날 촬상 있도록 회복 실험 진전 수 : 회복 실험이 엄격하게 필요 무균 수술 조건으로 적절한 진통제의 투여). 데브생체 염료의 큰 컬러 팔레트뿐만 아니라, 또한, 멀티 - 표지 실험을 용이 골수 내의 세포 - 세포 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공하고, 미래에 더욱 복잡한 실험 허용 조혈 세포의 효율적인 유전자 표지의 elopment. 또한, 다수의 골수 구조 및 기질 성분의 동시 라벨링 HSPC 틈새에서 발생하는 이벤트의보다 완전한 화상을 제공 할 것이다. 시간 경과 영화 이미지 안정성은 현미경을 안정화뿐만 아니라, 상기 이미지 정렬 알고리즘을 사용하여 샘​​플과 postacquisition에서 온도 구배를 최소화함으로써 preacquisition을 향상시킬 수있다. 제한 사항 : 설명이 기술은 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 주 사용 마취제의 투여 후 쥐의 생존은 예측 불가능하며 개별 응답에 따라 경험 합병증에 매우 쉽습니다마취. 마우스를 마취로부터 회복하고 마우스 이상적 시간 경과 영상의 재생 시간을 제한하는, 복구 할 경우주의 깊게 계획하는 것이 중요하다 위해 일반적으로 촬상 세션 이상 어렵게이다. 주 사용 마취제의 사용은 각 이미징 세션이 지속될 수있는 시간을 제한한다. 이 마취제의 작은 투여하여 마취 readministering을 연장하는 것이 가능하지만, 그것은 어려운이 정확하고 마우스를 과잉 투여하는 것은 생체 내 이미징의 조기 종료의 가장 흔한 원인 중 하나로 수행된다. 이소 플루 란의&gt; 2 시간 오랫동안 관리가 거의 성공 후 가스 마취 마우스 그러나 빠른 회복, 적은 독성이 더 긴 초기 이미징 세션 수 있습니다. 또 다른 기술의 한계로 인해 급속하게 이미지를 수집 할 필요성으로, 다점 경과 촬상 동안 얻을 수있다 화상의 해상도가 제한된다. 초점 드리프트 또는 필드 결합이, (디스크 점프) 위 ussed, 세포의 추적을 어렵게 만들 수 있습니다. 다른 방법과의 비교 : HSPCs는 일반적했던 친 유성 염료로 표시되어 있지만, [16]에서 검토로 DIR 및 DII 염료는, 대신 할 수있는 대체 및 다른 세포 염료만큼 충분히 밝은 사용할 수 있습니다. 세포의 체외로 라벨링이 조혈 모세포의 장기 기능에 영향을주지 밝혀졌다 않았지만, 그것은 세포 분열에 희석 DID 제한 (또는 다른 화학적 염색)를 갖는다. 조혈 모세포 이식 후 처음 일 동안 증식 때문에, 이러한 셀들에 대한 신호 대 잡음비가 급격히 저하된다. 유전자 조작 및 형광 단백질의 발현에 의해 세포의 내생 라벨링 형광 단백질 두개골 뼈를 통해 검출 신호를 생성하기에 충분히 높은 수준으로 발현되는만큼, 대안 방법이다. 대안 TECHN에는 여러 가지가 있습니다사용할 iques 자신 장점과 한계, 골수 공간 내 각 HSPCs의 촬상을 수행한다. 공 촛점 이미지는 외과 드릴 경골 뼈 에나멜 얇아 수술 노출을 따르면서 광섬유 기반 이미징 장치의 삽입은, 긴 뼈 [8]에서 골수 재구성의 촬상 허용 [12] HSPCs가 거주의 상세한 이미지를 생성 긴 뼈의 주연 영역. 그러나 이러한 방법은 훨씬 더 침습적 여기서 설명과 동일하므로 마우스 내의 동일 골수 영역에 초점을 촬상 세션을 반복하도록 허용하지 않는 한보다. 또한, 이들 기술은 주변 조직에 큰 손상을 피할 응답 주어진 관찰 세포에 영향을 미칠 수 있다는 것이 가능하다. HSPCs은 절제, 골절 된 대퇴골 [11] 위에 배치 된 커버를 통해 짧은 시간 동안 묘화되어, HSPCs에 조직이 거칠고 준비하지만 영향 클레아 아니다R 및 기술은 하나의 시점에 관찰을 얻기 위해 고유 사용 하였다. 고정 뼈 염색, 직렬 섹션으로 절단하고, 얻어진 화상이 혈관 캐스트가 사용되는 특히 우수한 3D 해상도를 제공하는, 3 차원 모델로 재구성되었다 [17], 최근에는 레이저 스캐닝 세포 계측법 (LASC) 정량적 얻기 위해 사용되었다 현장에서 HSPCs에 대한 조치는 [18] 면역 염색에 의해 강조하지만, 세포의 행동에 대한 시간 정보를 제공 할 수 없습니다. 이 새로운 기술에 설명 된 기술들은 4d에 셀을 모니터링하는 차원에서 양호한 해상도, 충분한 시간적 샘플링의 조합을 제공하고 따라서 골수와 상호 작용 HSPCs 장기간 모니터링을 달성하기 위해 적합한 방법을 제공하고, 상대적으로 비 침습 미시.

줄기 세포 틈새는 후각 망울, 근육 섬유, 모낭 돌출 또는 CNS 뇌실 영역 4-7로 수십 세를 인정하고 잘 많은 조직에서 특징졌습니다에도 불구하고, 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 및 골수 미세 환경 사이의 상호 작용 ( BM)은 여전히​​ 좋지 의한 직접 뼈를 통해 단일 ​​세포뿐만 아니라 조직 자체의 유체 극히 자연 관찰의 어려움으로 이해된다. 이는 다른 세포 유형 및 규제 신호의 복잡한 네트워크가 정지 사이의 정교한 균형을 조절하는 책임이 있는지, 절제 또는 조혈 모세포 또는 미세 자체의 간질 세포 중 특정 유전자를 과발현에 기초한 기능적 많은 연구를 통해 밝혀졌다 , 증식, 확장 및 조혈 모세포 1-2의 차별화. 조혈 모세포와 그 틈새 사이의 크로스 토크는 직접 관찰을 통해 깊이 이해 될 수있다. 이 ACH입니다뿐만 현미경의 관점에서 가능한 기술을 조합 한 고급 이미징 프로토콜 개발 ievable 덕분뿐만 아니라 시편 홀더 솔루션 및 수집 소프트웨어. 마우스의 두개골 뼈의 BM 실에서 이식 된 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 단일 셀 해상도 라이브 영상은 engrafting의 HSPCs 더 미성숙 세포 SDF-1, VCAM-1 양성 혈관 8-9의 근접 것을 지역화 것으로 나타났다 자신의 자손이 10보다 원위부 동안 GFP 양성 골아 세포 (조골 세포 제한 콜라겐 1α 프로모터는 GFP 발현을 구동하는 Col2.3-GFP 유전자 변형 마우스 라인)에서 20 미크론 - 15 내에서 발견된다. 유사 관찰 해부 및 뼈 골절 된 대퇴골 (11)로부터와 박형화 tibeal 뼈 (12)로부터 수득 하였다. 개관 골수 내 이미징 번째 HSPCs 직접적인 시각화를 달성하기 위해 최소 침습 접근 남아EIR 기본 미세. 모든 살아있는 검체 이미징 인해 샘플 불필요한 움직임 아티팩트를 회피 할 수만큼 샘플을 여전히 유지하는 고유의 필요성이 존재한다. 호흡 개관 골수 촬상시 회피해야 마우스 헤드의 진동 운동을시킨다. 그들은 정면 뼈를 방해하기 때문에 뇌 영상 및 전기 생리학에 대한 예를 들어 사용되는 기존의 정위 홀더, 두 개관 영상에 적합하지 않습니다. 라이브 영상과 전기 생리학 연구 13시 고통을 최소화 할 마우스 홀더부터는 두 성분 홀더와 고정하거나 보장 큰 아암에 연결된 촬상 윈도우를 생성하는 마우스의 머리에 고정 작은 조각으로, 개발 현미경 단계에 단단히 고정 무거운베이스 플레이트. 여전히 제자리에 헤드를 고정화하고 적절 m을 제거하면서 마우스 두개골에 머리 부재를 고정하는 자유를 허용 호흡호흡에 의한 ovements. 홀더 본체에 헤드 부분을 연결하는 A &#39;로크 및 키&#39;기구는 윈도우의 크기가되므로 수술을 간소화, 측위 정밀도가 향상뿐만 아니라 최소로 할 수 있도록하고, 스테이지에베이스 플레이트의 착용감 현미경에 대한 정확한 정렬 할 수 있습니다. 세포 운동성을 정확하게 모니터링하기 위해, 멀티 - 포인트 시간 경과 프로토콜은 시점 ​​간 5 분 간격으로 시간이 지남에 따라 세포의 추적을 할 수 있도록 설계되었다. 여기에, 표시 DID 조혈 모세포는 col2.3GFP의 osteoblasitc 기자 마우스 10, 14에 주입 약 20 시간 후 몇 군데 있습니다. 디자인 된 여러 시간에 걸쳐 동일한 부분을 신속 다점 경과 이미징을 수행하는데 필요한 촬상 설정을 상세하게 설명한다 마우스 홀더.

<table><tbody><tr><td>케타민 (Narketan 100 mg/ml)</td><td>Vetoquinol</td><td>407575 0107 C</td><td>이 대신 다른 마취제를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>메데토미딘 (Domitor 1 mg/ml)</td><td>엘랑코</td><td>134800-2</td><td>이 대신 다른 진통제를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>생생한 DiD 세포 라벨링 솔루션</td><td>Roche Products Ltd.</td><td>V22887</td><td>다른 색상을 사용할 수 있으며 필요한 경우 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Lacrilube ophtalmic entintment</td><td>Allergan</td><td>n/a</td><td>현지 수의사</td></tr><tr><td>Kemdent "Diamond Carve" 유리 이오노머 시멘트</td><td>Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td><td>SUN527</td><td>우리는 그늘 A3를 사용하지만 모든 색조의 시멘트를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>다중 등가</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>SS10M3109</td><td>1 ml, 31 G</td></tr><tr><td>마우스 억제</td>기 <td>Harvard Apparatus</td><td>340031</td><td>콘 타입 (소형)</td></tr><tr><td>오토클레이브 겸자 및 가위</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT577 AGT5034</td><td>아이리스 가위 - 90 mm; Dumont HP 핀셋(팁 0.06mm)</td></tr><tr><td>계량 보트 및 시멘트 교반기</td><td>VWR</td><td>611-1996/231-0370</td><td>5ml 계량 보트(검은색)/ 나무 혀 압착</td></tr>기 <tr><td>Leica SP5 전동 스테이지 및 이광자 레이저가 있는 정립 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td> 견<td>적 요청</td></tr><tr><td>25x 수침 대물 렌즈(N.A. = 0.95)</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506323</td><td>HCX IRAPO L 렌즈</td></tr><tr><td>사용자 정의 설계된 마우스 홀더</td><td>임페리얼 칼리지 엔지니어링 워크샵</td><td></td><td>자세한 내용은 그림 1을 참조하십시오</td></tr><tr><td>직장 온도계 프로브가있는 가열 패드</td><td>BASi 계측</td><td>FHC-40902 / FHC-40908 / FHC-4090502</td><td>히트 매트 / 컨트롤 박스 / 온도계 프로브</td></tr></tbody></table>

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

정지 및 증식, 자기 갱신과 차별화 된 자손의 생산 사이의 미묘한 균형을 통해 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는 모든 성숙한 혈액 세포 계통의 매출을 유지한다. 특정 HSC 운명에 이르는 복잡한 신호의 조정은 조혈 모세포 아직도 제대로 이해하는 복잡한 골수 미세 환경, [1-2] 사이의 상호 작용에 의존한다. 우리는 다단계 촛점 및 생체 영상 기술의 이광자 안정된 동물 포지셔닝 새롭게 개발 시험편 홀더를 조합함으로써, 높은 해상도 3D HSPCs 함유 스택 및 그 주변 틈새를 수득하고 시간이 지남에 따라이를 모니터링 할 수있다 방법을 설명 멀티 포인트 시간 경과 영상을 통해. 고화질 영상은 검출 생체 표지 조혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)가 골수 내에 거주 할 수 있습니다. 또한, 멀티 포인트 시간 경과 3D 이미징, 오빠른 취득 설정 btained, HSPC 운동과 HSPCs 간질 세포 사이의 상호 작용에 대한 정확한 정보를 제공합니다. GFP 긍정적 인 조골 세포 관련 HSPCs의 추적이 방법의 예시적인 응용 프로그램으로 표시됩니다. 이 기술은 두 개관 마우스 골수 공간 내에서 관심있는 적절히 표지 된 기질 또는 조혈 세포를 추적하는 데 이용 될 수있다.

만든 사용자 정의는 두 개관 영상 창을 포함하여 고정밀 마우스 홀더는 치명적으로 조사받는 마우스 (그림 1A)에 주입 FACS 정제, 표시 HSPCs의 장기 이미징을 할 수 있습니다. 일반적으로 15 사이의 주사 후 - 천 (20) 레이블 세포, 8-15 세포는 두개골 다음 일의 골수 이미징 영역 내에서 일반적으로 인식 할 수 있습니다. 확인 된 HSPCs (그림 1C 및 동영상)의 4D 시간 경과 영화 다음 120 μm의 두께 (그림 1B) - 여기에는 약 90의 골수 영역을 HSPC이 함유 단일 셀 해상도 3D 스택을 취득하는 방법에 표시됩니다. 치과 용 시멘트가 최적으로 제조되지 않은 경우 차선의 결과는, 예를 들면 물과는 홀더의 상부로부터 얹어 될 수 있더라도, 비 밀봉 영역으로부터 누출 수 얻어지는, 시간의 기간이되는 렌즈를 침지되지 않는다 물에 검은 색 F 리드<html> rames. 이미지의 일부 드리프트 갑작스런 점프 선도 그러나 그것은 마우스 프로그레시브 박리로 이어지는 차선 시멘트 밀착성 의해 지기도하고, 설정된 촬상의 섭동에 의해 수 인해 마우스 홀더의 재료의 열팽창에 불가피 시간 경과 이미징 동안 초점. 이전에 몇 군데 위치를 다시 방문 할 때 멀티 포인트 시간 경과 이미징 동안 드리프트는 무대의 움직임에 부정확 발생할 수 있습니다. 시간 경과 영화 드리프트와 더듬 유물 이미지 등록 알고리즘을 사용하여 보정 할 수 있습니다. 표 1 여기 및 방출 설정. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> 컬러 채널 </td><td style="width:213px;"> 여기 </td><td style="width:208px;"> 방출 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 nm의 </td><td style="width:208px;"> 500-530 nm의 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> 자기 형광 </td><td style="width:213px;"> 543 nm의 </td><td style="width:208px;"> 560-610 nm의 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> DID </td><td style="width:213px;"> 633 nm의 </td><td style="width:208px;"> 640-700 nm의 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 nm의 (MP) </td><td style="width:208px;"> 400-450 nm의 </td></tr></tbody></table><img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> 마우스 두 개관에서 HSPCs의 생체 4D 영상에서 그림 1. 실험의 (A) 개요 (B - C).. 얻어진 결과의 예 (B) 3D 스택에서 2D 조각 (총 깊이 114 μm의 경우), 콜라겐 뼈 (흰색)에서 신호를 포함하는 표시 DID 세포 (적색) , autofluorescent CELLS (노란색)와 조골 세포 (녹색). 스케일 바 :. 골아 세포 (녹색)에 근접하여 마이그레이션 레이블 않았다 HSC (빨간색)를 보여주는 4D 시간 경과 영화에서 100 μm의 (C) 2D 조각. 점선은 셀의 변위를 강조한다. 스케일 바 : 50 μm의 (B) 및 100 μm의 (C). 참고 :. 비디오 문서에 보이는 (C)의 시간 경과 수집에서 얻은 동영상 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

본 절차의 전반적인 목표는 조혈 모세포 및 전구 세포를 포함하는 고해상도 3D 스택을 획득하고, 다지점 타임랩스 이미징을 통해 이들을 시간에 따라 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 지질 친화성 염료로 조혈 모세포 및 전구 세포(HSCs)를 표지함으로써 수행됩니다. 그 후 표지된 HSCs를 수여 마우스에 주입합니다.안정적인 동물 고정을 위해 맞춤형 헤드피스와 시료 홀더를 사용하여 마우스를 현미경 관찰에 맞게 준비합니다. 다음으로, 조혈 모세포 및 전구세포 틈새(niche)의 고해상도 스택 이미지를 획득하고, HSPC가 포함된 여러 골수 위치에 대해 타임랩스 이미징을 수행합니다. 최종적으로 생체 내(intra vital) 공초점 및 이광자 현미경을 사용하여 골수 공간 내 HSC의 위치와 이동을 보여줍니다. 골수 절편의 면역형광염색과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 3차원에 시간을 더한 4차원 척도로 정보를 포착할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 조혈모세포가 제대로 기능하기 위해 골수 내 어디로 유도되어야 하는지 이해하는 데 도움을 주기 때문에 혈액 질환 치료로까지 확장됩니다. 우리는 HS PC를 시간에 따라 추적할 수 있는 능력이 얼마나 중요한지 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 이 방법은 줄기세포가 어디에 거주하며 시간이 지나면서 어떻게 행동하는지 알고자 하는 줄기세포 니치(niche) 분야의 모든 의문점에 답하는 데 도움을 줍니다.먼저 본 실험실의 이전 geo 비디오에서 시연하고 텍스트 프로토콜에 언급된 방법대로 조혈 줄기세포 및 전구세포를 수확하십시오. 다음으로, 세포 현탁액에 친유성 염료인 DID를 최종 농도 5 µM이 되도록 첨가합니다. 염료가 용액에서 침전되어 세포 표지가 제대로 되지 않는 것을 방지하기 위해 현탁액을 즉시 볼텍싱하십시오.세포를 세척하기 위해 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 먼저 500 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 따라 버립니다. 그런 다음 세포를 200 µL의 PBS에 재현탁하여 인슐린 주사기에 수집합니다.바늘의 dead space가 없으므로 일반 주사기보다 인슐린 주사기 사용을 권장합니다. 이를 통해 치사량의 방사선 조사를 받은 마우스의 꼬리 정맥에 세포를 주입할 때, 세포 현탁액 전체를 투여할 수 있습니다. 먼저 마우스를 가온 챔버에 넣습니다.꼬리 정맥이 혈관 확장되어 보이면, 마우스를 보정기에 넣습니다. 바늘을 꼬리 정맥 속으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 정맥 내로 세포를 주입합니다.주입 시 저항이 느껴지지 않아야 합니다. 마우스를 하룻밤 동안 그대로 둡니다. 세포가 골수 공간으로 이동할 수 있도록 마우스를 마취하고, 페탈 반사(petal reflex)를 통해 깊은 마취 상태가 되었는지 확인합니다.티슈에 70% ethanol을 묻혀 두피 상단을 닦아냅니다. 이때 ethanol이 마우스의 눈에 들어가지 않도록 주의하십시오. 이미지 촬영을 위해 두개골 영역을 노출시키려면, 포셉으로 피부를 들어 올린 상태에서 양쪽 귀 사이의 머리 뒷부분에 작은 절개를 가합니다.가위를 피부 아래로 밀어 넣어 원하는 영상 촬영 영역의 외곽을 따라 조심스럽게 절개합니다. 멸균 PBS를 적신 멸균 면봉으로 노출된 뼈를 닦아 뼈의 습기를 유지합니다. 이는 영상 품질에 영향을 줄 수 있는 과도한 건조 및 흉터 형성을 방지하기 위함입니다.다음으로, 치과용 시멘트 적당량을 웨이 보트(whey boat)에 넣고 페이스트 상태가 될 때까지 섞습니다. 이를 두개골에 부착할 오토클레이브 헤드피스의 바닥 표면에 빠르게 도포합니다. 시멘트가 굳기 전에 헤드피스를 마우스의 두개골 위에 올리되, 영상 촬영 영역에 치과용 시멘트가 묻지 않도록 주의하며 완전히 굳을 때까지 기다립니다.두개골의 습도를 유지해 주는 인트라 하이드로젤(intra hydrogel)을 소량 도포하되, 시멘트가 건조되는 동안 방해되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 헤드피스를 홀더에 부착하여 고정합니다. 나사를 사용하여 홈이 홀더의 노치(notch) 안에 잘 맞도록 고정하십시오.현미경으로 옮기기 전, 멸균 면봉을 사용하여 하이드로젤을 제거하십시오. 다음으로 홀더를 현미경 스테이지에 삽입하고 가열 매트를 마우스 아래에 배치하십시오. 직장 온도계 프로브를 삽입하고 접착 테이프로 스테이지 위의 모든 장치를 고정하십시오.마우스가 마취 상태에 있는 동안 눈이 건조해지지 않도록 안과용 연고를 소량 도포합니다. 마취 하의 영상 촬영 과정 중 어느 시점에서도 마우스를 방치해서는 안 됩니다. 접안렌즈를 통해 두개골에 초점을 맞춥니다.먼저, 워터 디핑 렌즈(water dipping lens)를 사용하여 정제된 멸균수로 두개골 영상 촬영창을 채웁니다. 렌즈를 내려 물방울에 닿게 합니다. 현미경 접안렌즈를 사용하여 두개골 상단에 초점을 맞춥니다.이미징 영역을 중앙 봉합선에 맞춘 후, 머리 뒤쪽으로 이동하여 관상 봉합선을 찾습니다. 초기 설정으로, 소프트웨어를 XY 이미지 및 3개의 DZ 스택을 캡처하는 모드로 설정하십시오. 이미징 속도는 400 hertz로, 해상도는 512 by 512 pixels로 설정합니다.여러 채널이 캡처되도록 소프트웨어를 설정하고, 수집 방법을 스택 간 또는 프레임 간에 설정을 변경하도록 설정하십시오. 세 가지의 독립적인 캡처 설정을 구성하십시오. 각 스택의 획득이 끝날 때 레이저 조명을 끄도록 설정합니다.그런 다음 이광자 제2고조파 생성 골 신호를 위한 첫 번째 순차 스캔을 설정합니다. 다광자 레이저의 셔터를 열고 다광자 레이저의 게인(gain)과 오프셋(offset)이 올바르게 설정되었는지 확인합니다. 또한, 레이저 출력이 12.5~25%이며 레이저 전원이 켜져 있는지 확인하십시오.유일한 검출기로서 적절한 PMT를 선택하고 색상을 흰색으로 변경하십시오. 두 번째 설정에서 결합된 자가형광 및 DID에 대한 채널 설정 절차를 반복하십시오. 두 개의 적절한 PMT를 사용하여 스캔하십시오.자가형광 검출을 위해 채널 색상을 녹색으로, DiD 검출을 위해 적색으로 변경하십시오. 마지막으로 GFP 검출을 위한 세 번째이자 최종 스캔을 설정합니다. 488 nanometer 레이저 라인의 레이저 출력을 약 15%로 설정하십시오. 유일한 활성 검출기로서 적절한 광전자 증배관(PMT)을 선택하고 해당 PMT의 의사 색상을 녹색으로 변경하십시오.실시간 이미징 모드를 활성화하여 선택한 채널의 프리뷰 스캔을 시작하고, 최적의 노출을 위해 검출기 게인(gain)과 오프셋(offset)을 조정하십시오. 순차 창의 각 스캔에 대해 이 과정을 반복하고, 다중 채널 스캔 설정을 저장하여 쉽게 재사용할 수 있도록 하십시오. 그런 다음, 본 소프트웨어에서 mark and find라고 지칭하는 다중 위치 캡처를 활성화하고 좌표점을 재설정하십시오.다음으로, 중앙 봉합선과 관상 봉합선의 교차점부터 뼈 영상 영역을 스캔하십시오. 자가형광과 DID를 이용한 합성 뷰를 사용하여 골수 영역의 깊이를 스캔합니다. 세포가 검출되면, 표시 및 창의 왼쪽에 있는 새 위치 추가 아이콘을 클릭하여 이를 새로운 좌표 위치로 표시하십시오.현재 시야의 검사가 끝나면, 스테이지를 한 시야 거리만큼 이동합니다. 각 시야마다 이 과정을 반복합니다. 중앙 봉합선의 왼쪽 이미지 윈도우 전체를 마우스의 코 방향으로 이동하며 점진적으로 작업합니다.중앙 봉합선 분기점이 보이면, 봉합선의 우측으로 이동하여 절차를 반복하십시오. 왼쪽은 반대 방향으로 스캔합니다. mark and find 도구를 사용하여 관심 있는 새로운 세포의 좌표를 표시하십시오.지점을 검토하려면, 각 위치의 각 세포 주변으로 Zs 스택의 상단과 하단을 설정하십시오. 각 지점에 대해 위아래로 초점을 맞춘 후, 3개의 DZ 스택 캡처를 위해 상단 및 하단 Z 위치를 설정하십시오. '마크 앤 파인드(mark and find)'에서 개별 지점을 업데이트하고, Zack 간격을 5 µm로 설정하며, 각 순차 스캔 채널의 평균값(averaging)을 적절한 품질로 설정하십시오.전체 스캔 절차를 시작하여 각 관심 지점에 대한 고품질 참조 스택을 획득하십시오. 고품질 스캔이 완료되면, 캡처를 위한 타임랩스 설정 및 타임랩스 설정을 활성화하십시오. 시간 간격은 5분으로 설정하고, 전체 실행 시간은 원하는 길이로 설정하십시오.이 설정들을 전체 스캔에 적용하십시오. 이 예제는 3개 이상의 지점을 획득하는 방법을 보여줍니다. 이러한 설정을 수정하여, 평균화에 사용되는 스캔 횟수를 줄이고 해상도를 512 by 512 픽셀로 제한함으로써 스캔 시간을 단축하여 5분 간격의 타임랩스가 가능하도록 할 수 있습니다. 스캔 방식을 양방향으로 전환하거나 스캔 속도를 600 hertz 이상으로 높이십시오. 이전과 마찬가지로 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하여 이미징을 시작하십시오.영상 촬영이 완료되면 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 마우스를 안락사시킵니다. 두개골 영상 창이 포함된 맞춤형 고정밀 마우스 홀더를 통해 치사량의 방사선을 조사한 수여 마우스에 주입된 표지된 HS PC의 장기 영상 촬영이 가능합니다. 여기에 표시된 것은 콜라겐 신호가 약 90~120 µm 두께인 HSPC 함유 골수 영역의 단일 세포 해상도 3D 스택의 2D 슬라이스입니다. 뼈는 흰색으로, DiD 표지 세포는 빨간색으로 표시됩니다.자가형광 세포는 노란색으로, 조골 세포는 녹색으로 표시되어 있습니다. 여기에서는 적색으로 표지된 DiD HSC가 녹색의 조골 세포 인근으로 이동하는 모습을 보여주는 HS PC 식별 40배 타임랩스 영상이 제시되어 있습니다. 숙련된 경우, 본 기술은 수술과 초기 이미지 촬영에 약 1시간이 소요되며, 이후 타임랩스 이미지 촬영을 위해 필요한 충분한 시간이 소요됩니다.이 영상을 시청하고 나면, 생쥐 종아리(calf)의 이미징을 설정하고 시간에 따라 여러 개의 HS PC를 관찰하는 방법에 대해 충분한 자신감을 갖게 될 것입니다.

in-vivo-4-dimensional-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

골수의 조직학적 데이터를 정량적으로 분석하는 전략을 제시합니다. 조직 절편에서 형광 표지된 세포에 대한 컨포칼 현미경 검사는 자동으로 분석되는 2차원 이미지를 생성합니다. 다양한 세포 유형의 공동 국소화 분석을 시뮬레이션된 이미지의 데이터와 비교하여 세포 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공합니다.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

이 프로토콜은 생체 내에서 대퇴골수에서 세포의 움직임을 추적하는 데 사용할 수 있는 새로운 쥐 대퇴골 창 챔버 모델을 설명합니다. 생체 내 다광자 형광 현미경은 시간이 지남에 따라 대퇴골수의 세 가지 구성 요소(혈관 구조, 콜라겐 매트릭스 및 호중구)를 이미지화하는 데 사용됩니다.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

생쥐에서 다른 인간화 된 골수 틈새를 만들고 살아있는 방법이 제시됩니다. human mesenchymal cells에 의해 만들어지는지지 적 틈새를 기반으로, 인간 내피 세포의 첨가는 인간 혈관의 형성을 유도하는 반면, rhBMP-2의 첨가는 인간 - 마우스 키메라 성숙한 뼈 조직의 형성을 유도한다.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

우리는 여기에서 2개의 광자 현미경 검사를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈의 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet를 화상 진찰하는 방법을 설명합니다.

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

이 프로토콜은 쥐 이종 이식 모델에서 유전자 편집 세포를 포함한 몇 가지 조혈 또는 백혈병 줄기 세포의 대퇴 내 주사를 설명하며, 이를 통해 세포의 빠르고 안전한 이식뿐만 아니라 골수의 연속 분석도 가능합니다.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

생체 내 현미경 검사를 통해 조직 재생 및 종양 발달과 같은 동적 생물학적 과정을 연구할 수 있습니다. 매우 역동적인 조직인 calvarial bone marrow는 조혈과 혈관 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 생체 적합성 3D 프린팅 머리 고정 임플란트를 사용하면 반복적인 종방향 이미징이 가능하여 조직 역학 및 종양 미세환경에 대한 이해가 향상됩니다.

Intravital Longitudinal Imaging of Vascular Dynamics in the Calvarial Bone Marrow(갈바리골수에서 혈관 역학의 생체 내 종단 영상)

배우세요 성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4차원 추적 방법을. 이 기술은 줄기세포 틈새 역학과 혈액 질환 치료에 대한 새로운 통찰을 제공합니다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

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