Name: 생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 배우세요 생물 전자 현미경에서 동결 골절 및 동결 에칭 기술을 사용하여 세포막의 초미세 구조를 관찰하는 방법을. 이 기법은 얼음 결정 형성을 최소화하며 생물학적 및 나노재료 연구에 필수적입니다.

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이 프레젠테이션은 Flight Attendant Medical Research Institute와 미국 환경 보호국의 JLC에 대한 임상 혁신상(Clinical Innovator Award)의 지원을 받았습니다. 이 기사에 설명된 연구는 노스캐롤라이나 대학교 채플힐의 환경 의학, 천식 및 폐 생물학 센터와의 협력 협정 CR83346301 통해 미국 환경 보호국(United States Environmental Protection Agency)의 전체 또는 일부 자금을 지원받았지만, 미국 환경보호국(EPA)의 필수 동료 및 정책 검토를 거치지 않았습니다. 따라서 반드시 기관의 견해를 반영하는 것은 아니며 공식적인 보증을 추론해서는 안 됩니다. 상표명 또는 상용 제품에 대한 언급은 사용에 대한 보증 또는 권장 사항으로 간주되지 않습니다.

동결 골절 / 냉동 에칭을위한 생물 표본의 1 준비 <ol><li> 1 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼에 기존의 EM 고정 제 제제와 같은 2 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde) + 2 % 파라 포름 알데히드를 사용합니다. 생체 조직의 기본 고정을 수행 할 수 있습니다. 참고 : 전에 고정하지 않고 표본의 몇 가지 유형을 동결하는 것이 바람직 할 수 있지만, 보편적 인 혈액 매개 병원균주의 시편은 인간의 조직으로 구성되어 적절한 고정을 의무화. </li><li> 기본 고정에 따라, 더 이상 하나 이상의 시간 동안 0.2 M 자당으로 보충 같은 버퍼에 시편을 씻어. </li><li> 1 시간보다 더 0.1 M 인산염 완충액에서 25 % 글리세롤로 이루어진 동결 방지제 용액에 시편을 전송. </li></ol> 동결 골절에 앞서 2 냉동 및 검체의 보관 <ol><li> 적절한 크기와 시편 형상의 선택 금 또는 구리 시편 스텁이 처리되고 (그림 4 </st룽&gt;). </li><li> 미세 등급 겸자 및 / 또는 금속 시편 스텁 위에 시험편의 작은 게이지 주사기 바늘 위치 작은 조각을 사용. <ol><li> , 스티커로 시험편의 액체 함량을 감소 약간 여과지와 스터브의 가장자리에서 액체를 그려서 일관성 같은 접착제. </li><li> 단일 복제본 스텁에 조직의 마운드를 만드는 작은 게이지 주사기 바늘을 사용합니다. 이중 복제본 들어, 정확하게 스텁 위에 다른 스터브와 위치를 반전하고 샌드위치 (도 5a)을 생성 시험편 표면에 가볍게 놓는다. 이 스텁 사이에서 밖으로 표본을 누르지 마십시오. </li></ol></li><li> 액체 질소와이 절연 듀어 혈관을 입력합니다. 주 : 제 용기는 시판 실린더 (도 5b)에서 프로판 가스의 작은 부피를 액화하는 데 사용되는 작은 잘 함유 금속 포스트를 수용한다. 두 번째 선박에 대한 간단한 선박을 들고 / 파티션 스토리지입니다만민은 액체 질소에서 냉동 표본을 유지. <ol><li> 프로판 웰에 위치하는 실린더 노즐을 사용하여, 실린더 밸브를 열고 가스가 액화되는 제 용기에 잘 흐르게. 참고 :주의! 프로판은 접촉시 부상을 동결 초래할 수 있습니다, 폭발하고, 질식입니다. 그러한 사용은 낮은 온도에 대한 보호 의복을 사용하여, 또한 외부 점화원을 피하기 위해주의하면서 적절한 환기를 유지하기위한 인증 화학 후드에서 프로판을 사용합니다. </li><li> 가능한 한 빨리, 시편은 미세 학년 집게 마운트하고 신속하게 액체 질소의 제 2 유지 용기 (그림 5B)로 전송 몇 초 동안 첫 번째 용기에 액화 가스로 뛰어 픽업. </li><li> 표본이 고정되면, 준비가 될 때까지 액체 질소에서 저장소는 동결 골절 공장으로 전송합니다. 확장을 위해 큰 저장 액체 질소 듀어 병 컨테이너 스텁을 전송원하는 경우,하지만 상관 저장 스텁 해동 허용하지 않도록주의해야한다. </li></ol></li></ol> 동결 골절의 3 조작 기기 및 시료 처리 <ol><li> 황동 홀더와 챔버로 표본을로드 <ol><li> 책자 형 더블 복제 시편 홀더에 금 표본 스텁을로드 또는 액체 질소 하에서 장치를 고정하고 시료 챔버 (그림 6)에 배치 할 준비가있을 때까지 유지한다. </li><li> 챔버는 높은 진공 (약 2 × 10-6 밀리바)를 달성하고 스테이지 액체 질소 온도까지 냉각되면, 펌프를 끄지 챔버를 배기하고, 가능한 한 신속하게 시료 테이블 상에 탑재 된 시료 스텁 위치 . </li><li> 펌프를 켜고 고진공을 다시하고 마이크로톰 팔과 BRI에 표본 테이블 -100 ° C로 온도와 직접 액체 질소를 조정하는 전자 무대와 팔 온도 컨트롤을 사용하여액체 질소 온도로 겨. </li></ol></li><li> 파괴 과정 <ol><li> 액체 질소 온도에서 고진공, -100 ºC의 스테이지 온도 마이크로톰 아암을 달성하면, 원격으로하여 시편 마운트에 시험편을 파쇄 이중 복제본 시편 홀더를 열고 (동결을 fracture_movie1.mov). </li><li> 에칭 다음 골절위한 시편의 경우, 면도 마이크로톰 아암에 클램프 유지 면도날을 사용하여 (즉, 파단) 단계 3.2.1 대신 시험편의 표면 (동결을 etch_movie2.mov). </li><li> 추가 동결 에칭 공정이 수행 될 경우, 몇 분에 하나 파 단면 위에 냉각 마이크로톰 아암 위치. 참고 : 절단면의이 작전은 승화 (즉, 에칭) 물입니다. 이 기동의 효과는 FRA에 더하여, 물의 승화 진정한 세포 표면, 세포 외 기질, 및 / 또는 분자 어셈블리를 공개하는 것이다가능한 화상은 세포막의 지질 이중층을 통과 직면 해있다. </li></ol></li><li> 금속 음영 및 복제 지원 증발 전자총을 사용 <ol><li> 백금 / 탄소 전자 또는 저항 총을 활성화하고 30 °의 각도에서 골절 표면에 백금 / 탄소의 얇은 층 (약 2 nm의) 증발 할 수 있도록 - 45 °. 20 초 -이 문제는 보통 약 15이 필요합니다. </li><li> 단계 3.3.1에서와 같이 탄소 또는 전자 총 저항을 활성화하고 복제본에 지원을 제공하기 위해 직접적으로 부하 (90도)에서 프랙 시험편 표면에 탄소 박막을 증발. 20 초 -이 문제는 보통 약 15이 필요합니다. </li></ol></li><li> 복제본의 검색 <ol><li> 복제 음영 탄소 안정화 완료되면, 진공 펌프를 해제 벤트 챔버와 시료가 탑재 기기로부터 제거한다. </li><li> 미세 등급 포셉 쌍을 사용하여 이중에서 각 금 시험편 스텁을 제거복제 책자 / 클램프 조심스럽게 자리 플레이트 (그림 7)에 물 표면에 스텁을 낮추는 전에 몇 초 동안 해동 할 수 있습니다. NOTE : 물 표면에 뜬다 접착 시험편 재료를 함유 탄소 / 백금 복제본. </li><li> 미세 와이어 루프 또는 미세 등급 집게 몇 시간에 한 50 % 황산에서 5 % 중크롬산 나트륨을 함유하는 다른 스폿 판에 전사에 의해 유지 종래의 구리 전자 현미경 그리드를 사용 복제본 책략. 참고 :이 화장실은 복제본에서 실제 생물 표본 자료를 소화. 전체 강도 가정용 표백제는 중크롬산 염 / 황산 용액 대신 할 수있다. </li><li> 소화가 완료되면, 깨끗한 물 표면으로 다시 복제본을 전송 및 표준 구리 전자 현미경 격자 상으로 검색한다. (참고 : 복제본 소화하는 동안 작은 조각으로 조각 낼 수 있지만, 심지어 아주 작은 복제본 상당한 정보를 포함 할 수 있으며, RETR해야ieved 및 검사.)가 부드러운 핸들링 년 동안 안정적으로 유지 될 것입니다 시중에서 판매하는 그리드 상자에 그리드를 지원하는 저장 복제. </li></ol></li></ol> 동결 골절 / 에칭 복제본의 4 현미경 적 검사 <ol><li> 80 kV의 - 일반적으로 50 내지 가속 전압에서의 투과형 전자 현미경의 레플리카보기. </li><li> 표준 TEM 필름 또는 고해상도 디지털 카메라와 함께 관련 이미지를 기록한다. </li></ol>

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도입 및 상용화 다음 몇 년 동안, 동결 골절 / 에칭 과정은 널리 생물학적 막 구조의 연구에 활용 하였다. 실제로, 막 구조 전문의 일부 가장 관점 동결 골절 / 에칭 제제로 얻어졌다. 이러한 연구뿐만 아니라 세포막의 구조적 조직의 이해에 기여뿐만 아니라 구조와 기능이 관련되는 방법에 대한 통찰력을 제공했다. 루틴 생​​물학적 전자 현미경의 출현은 생물학적 시료에 차등 전자 밀도를 부여하기 위해 요구되는 알데히드 고정 제, 반응성 화학 물질, 중금속과 화학적 처리 자체가 아티펙트의 생성에 기여한다는 인식을 초래. 동결 골절 기술의 개발은 처리 아티팩트를 감소하기위한 노력에 부분적으로 기초 하였다. 그럼에도 불구하고, 그 동결 골절을 인정 받고/ 에칭 얼음 결정 손상하는 중요한 하나의 유물 자신의 세트를 소개합니다. 티슈 인해 미세 내용을 말살 얼음 결정의 형성을 초래 시험편을 둘러싼 질소 가스의 절연 층의 형성에 액체 질소 환경에 직접 환원 냉각 속도 급감. 이 문제는 글리...

개념 및 생물학적 시료의 동결 골절 처리의 실용적인 응용 프로그램은 한 세기 전 반 이상 스티어 (1)에 의해 소개되었다. 초기 장치는 작업 자체에 포함 된 유닛 하나에 서로 다른 구성 요소를 충당. 원래 장치는 개질 및 원격 조작, 고진공의 유지를위한 중요한 요구를 수용하기 위해 상업적으로 이용 가능한 기기로 정제하고, 탄소 및 금속의 증발은 투과형 전자 현미경 (도 1 및도 검진 적합한 복제본을 생성시켰다 2). 전형적인 장비는 시료 테이블과 마이크로톰 팔 regulable 액체 질소 처리량을 갖는 (그림 1)과 높은 진공 챔버로 구성되어 있습니다. 챔버는 또한 시료 스테이지 90 ° 각도 plati위한 다른 위치에서 탄소 증발을 안정화 개의 전자총 번을 수납45 ° (그림 2) - 각도 조절, 일반적으로 15 °에 그림자 NUM / 탄소. 장치의 전원이 진공 펌프를 작동하기 위해 적용되며, 전자는 패널 온도 조정 및 전자총 제어를 조절한다. 원래 시험 및 세포막의 분석 및 그들의 전문이, 3 기술로서 더욱 인기를 얻고 골절 동결 바이러스의 개선 된 이미징을 달성하기위한 수단으로 생각. 사실,이 절차는 세포와 조직과 이러한 연구의 대부분은 세포 및 분자 생물학 4-9 고전적인 기여로 서의 구조 / 기능의 관계를 해명에 통합되었습니다. 동결 골절 기술의 개발을위한 주요 목표와 이론적 근거는 종래 생물학적 전자 현미경에 사용되는 화학 물질과 정착 처리에서 도출 전자 현미경 관찰 아티팩트 해상도를 제한하는 것이었다. 여기서의 목표는 화학을 제한하는 것정착 충분한 속도로 자주 얼음 결정 생성 등의 동결 아티팩트를 제한하기 위해서 동결 방지제의 존재 하에서 시험편을 동결하고. 최근,이 기술은 나노 입자와 나노 물질의 검사를위한 분자 생물학 및 재료 과학 연구자들의 관심의 부활을 발견했다. 골절을 동결하고 동결 에칭 이미지 입체 문자를 나타내고 때로 주사 전자 현미경으로 오인한다. 그러나, 동결 골절 제제는 투과 전자 현미경에 의해 검사하는 것으로 고해상도 형태 학적 연구에 큰 기여들은 세포막의 구조 / 기능 요소의 독특한 표현이다. 냉동 처리는 골절 및 / 또는 글리세롤과 같은 동결 방지제 처리제를 이용하여 얼음 결정을 제한하기에 충분한 속도로 세포와 조직을 동결에 의해 개시된다. 표본은 다음 진공 및 담당자 파단 아르리카는 골절 표면에 탄소와 백금의 증발에 의해 생성된다. 원래 시편은 표준 EM 표본 그리드에 검색되는 복제본에서 소화된다. 동결 골절 화상의 또 다른 일반적인 오해들은 세포 표면을 묘사한다는 것이다. 동결 골절의 기본 전제는 생체막가 파괴 과정 (그림 3)에 의해 지질 이중층을 통해 분할된다는 것입니다 그러나. 생체막에이 과정이 골절면, 세포에 인접한 막의 이분자 전단지의 절반을 계시 세포질, PF-면에 인접 멤브레인의 절반의 구성을 보여준다 하나, 하나를 얻을 적 환경, EF-얼굴입니다. 트루 세포 표면 동결 골절 이미지로 표현했지만 파괴 절차에 따라 동결 에칭 이후 추가 단계가 사용되는 경우에만 표시되지 않는다. 효과적으로 표면 detai을 공개하는 이전 파단 시험편을 에칭하기 위해서는리터는 표본은 빠른 속도와 unetchablecryoprotectant없이 고정해야합니다. 기본 기능을 드러내는 골절 시험편의 표면으로부터 물의 에칭 시험편 채 상기 스테이지 사이의 온도 차이를 생성 시험편 스테이지 위에 냉각 마이크로톰 아암과 표면으로부터 승화 물을 일으키는 냉각 마이크로톰 아암을 위치시킴으로써 달성된다. 물이 동결 에칭 기동 중에 골절 시험편의 표면으로부터 승화 될 경우, 실제의 세포 표면, 세포 외 기질, 세포 골격 구조, 분자 어셈블리의 양태는 높은 해상도로 밝혀 질 수있다. 따라서 동결 골절 및 에칭을 정지하면 교체 규정하지 않지만 오히려 후자는 어느 특정 연구의 요구에 따라 필요하거나 바람직하지 않을 단계별 과정을 반영한다. 골절 다음 동결 / 동결 에칭 절차, 파 단면이 지시 evapora을 실시복제에 대한 지원과 영상 대조를 제공하기 위해 탄소와 백금의 코트를 포지티브,. 백금 / 탄소 촬상 증발 단방향 또는 회전 될 수 있고, 저항 또는 전자총 중 하나에 의해 달성된다. 알려진 각도, 일반적으로 30 °에서 단방향 그림자 - 45 °는 특정 형태 계측 학적 계산을 수행하기에 유용하다. 깊은 에칭 대상이 된 표본은 일반적으로 그림자가 회전하고이 표본의 결과 이​​미지는 사진으로 평가를 위해 반전된다. 과거뿐만 아니라 동결 골절 / 동결 에칭 기술의 본 목적은 종래보다 투과 전자 현미경 절차와 관련된 아티팩트 시험편 화학 고정 및 처리를 제한 할 수있다. 그러나,이 기술 및 N, 입체 내용을 부여함으로써 생물학적 물질 과학에서 형태 계측 데이터의 수집을 용이하게하는 기능에 실질적인 이점을 제공한다anotechnology 표본. 골절 동결 및 동결 에칭 절차는 복잡하고 다면적이며, 그 응용 프로그램의 일부 측면은 사용자 정의됩니다. 이 프레젠테이션 방법의 주요 특징의 조사 뷰를 제공하며, 리더가 특정 요구에 대한 연구 과정을 상세 해결하고 정의하기 위해 광범위한 프로토콜 번역 10, 11로 지칭된다.

<table><tbody><tr><td>발저스 동결 파괴 / 동결 에칭 공장</td><td>발저스</td><td>BAF400T</td><td></td></tr><tr><td>표준 버퍼 다양한</td><td>공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>표준 알데히드 정착제</td><td>다양한 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>중크롬산 나트륨</td><td>다양한 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>황산,</td><td>다양한 공급 업체</td><td></td><td></td></tr> 일회용 <tr><td>소모품 백금/탄소 증발,</td><td>Technotrade International</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>액체, 질소</td>, <td>다양한 공급업체</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>프로판</td>, <td>다양한 공급업체</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>전자 현미경용 일회용 소모품</td><td>, 전자 현미경 과학,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투과, 전자 현미경</td>, <td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

자연 표본, 일반적으로 생물 또는 나노 재료, 골절, 냉동 및 탄소 / 백금 &quot;캐스팅&quot;투과 전자 현미경에 의한 검사 대상을 생성하기 위해 복제된다 동결 골절 / 동결 에칭 프로세스에 대해 설명합니다. 시료는 액체 질소가 고 진공 하에서 냉각 온도에서 시편의 후속 파쇄와 종종 얼음 결정의 형성을 제한하는 cryoprotective 에이전트의 존재 ultrarapid 동결 속도로 실시된다. 결과 절단면 복제 및 캐스트에 표면을 세 차원 세부 사항을 부여 각도에서 탄소와 백금의 증발에 의해 안정화된다. 이 기술은 세포막과 전문 분야의 조사를 위해 특히 계몽 입증했다 및 관련 세포의 기능을 세포 형태의 이해에 크게 기여하고있다. 이 보고서에서 우리는 수행하기위한 장비 요구 사항 및 기술적 프로토콜을 조사동결 골절, 관련 용어 및 파괴 평면의 특성, 동결 골절 이미지의 해석에 대한 기존의 절차에 대한 변화 및 ​​기준. 이 기술은 널리 세포 생물학의 많은 지역에서 미세 구조 조사에 사용되는 분자, 나노 기술에 대한 새로운 이미징 기술 등의 약속을 보유하고, 재료 과학 연구되고있다.

동결 골절 화상 해석의 핵심 전제는 골절면이 규칙 PF - 얼굴 (플라즈마 골절면)와 EF-얼굴 (세포 외 골절면) (그림에 의해 호출이 골절의 얼굴을 부여하는 세포막의 지질 이중층을 통과한다는 것입니다 3). PF-얼굴 셀 EF-얼굴의 세포질에 인접 멤브레인 지질 이중층의 절반 엑스트라 셀룰러 인접 세포막 지질 이중층의 절반이다. 동결 골절 기술은 막 구조물의 조사에 특히 유용하고 두면은 일반적 PF-면을 적게 포함 EF-얼굴 달리 많은 멤브레인 연결된 입자로 채워지으로 명쾌 다르다. 동결 골절 세포의 세포질 내용은 외관에서 일반적으로 거친 아르와 같은 핵 및 골지체로 막 결합 소기관이 쉽게 식별 할 수 있지만, 특히 공개되지 않습니다. 특히 관심을 INVE합니다이 기술을 사용 stigators 그들의 기능에 대해 해석 될 수있는 막 구조의 특수화이다. 이러한 멤브레인 관련 입자의 특정 분포, 섬모 막 전문화 및 세포 간 접합을 포함한다. <p class="...

기본 기술과 투과 전자 현미경에 의한 검사에 대한 생물 표본 및 나노 물질의 동결 골절 처리의 개선이 설명되어 있습니다. 이 기술은 미세 기능과 생체막의 전문을 공개 및 재료 과학 및 나노 기술 제품에 미세 수준의 차원과 공간 데이터를 얻기위한 바람직한 방법이다.

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

다음 실험의 목적은 투과 전자 현미경으로 관찰하기 위해 생물학적 또는 기타 재료의 탄소-백금 시료 복제본을 제작하는 것입니다. 이를 위해 이중 및 단일 복제본으로 준비된 시료를 초급속 냉동하여 얼음 결정 형성을 제한합니다. 그 다음, 고진공 상태의 액체 질소 온도에서 원격 조작을 통해 냉동된 시료를 파쇄하면, 지질 이중층을 통해 막이 분리되면서 세포 외면과 세포질 측에 인접한 면이 생성됩니다.선택적인 추가 단계로서, 냉각 마이크로톰 암을 시편 스테이지 위에 배치하여 온도 차이를 생성하면 파단된 시편 표면에서 물이 승화되어 사라지며, 이를 통해 하부의 특징들이 드러날 수 있습니다. 그다음, 파단 표면 위에 탄소와 백금을 증착시켜 복제본을 생성합니다.원래의 표본은 투과전자현미경 시편 그리드 위에 회수한 복제본으로부터 소화됩니다. 최종적으로 동결 파쇄 동결 식각(freeze fracture freeze etch)법을 사용하여 투과전자현미경으로 관찰함으로써 세포막, 분자 배열 및 나노 물질의 3차원 구조적 세부 사항을 보여줍니다. 초박절편 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 관심 대상물을 전자현미경 해상도의 3차원으로 관찰할 수 있다는 점입니다.이 방법은 세포막의 치수 및 구조적 특성과 분자 및 나노 물질 배열의 구성과 같이 세포 및 분자 생물학 및 나노 기술 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저는 유사한 연구가 진핵 미생물을 대상으로 수행되어 중요한 발견이 있었음에도 불구하고, 인간 건강과 관련된 주제에는 관심이 제한적이었다는 점을 인식했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 동결 파쇄 동결 에칭을 위한 생물학적 시료 준비부터 이 절차를 시작하십시오.미세 핀셋 또는 소구경 주사바늘을 사용하여 처리할 시료에 적합한 크기와 모양의 금 또는 구리 시료 스터브를 선택합니다. 시료의 작은 조각들을 금속 시료 스터브 상단에 배치합니다. 단일 복제본의 경우, 거름종이로 스터브 가장자리의 액체를 흡수시켜 시료의 액체 함량을 끈적거리는 접착제와 유사한 상태가 될 때까지 줄입니다.이중 복제물을 제작하기 위해 가는 게이지의 주사바늘을 사용하여 스텁 위에 조직을 둥글게 쌓아 올립니다. 다른 스텁을 뒤집어 기존 스텁의 정확히 위쪽에 배치한 다음, 시료 표면 위에 가볍게 놓습니다. 이를 통해 샌드위치 구조를 형성합니다.두 개의 스터브 사이에서 시료를 눌러 짜내지 마십시오. 다음으로, 두 개의 절연 듀오 용기를 액체 질소로 채웁니다. 첫 번째 용기에는 작은 웰이 포함된 금속 포스트가 들어가며, 이는 시판 실린더로부터 소량의 프로판 가스를 액화시키는 데 사용됩니다.두 번째 용기는 액체 질소 하에서 냉동 표본을 잠시 유지하기 위한 분할 저장 보관 용기입니다. 프로판은 해당 용도로 인증된 화학 흄 후드 내에서만 사용하십시오. 프로판은 폭발성 물질이므로 외부 점화원을 피하고, 저온 보호복을 착용하며, 적절한 환기를 유지하는 데 주의하십시오.접촉 시 동상을 유발할 수 있으며 질식제입니다. 프로판 내에 위치한 실린더 노즐을 사용하여 실린더 밸브를 완전히 열고 가스가 첫 번째 용기의 웰로 흘러 들어가 가능한 한 빨리 액화되도록 합니다. 정밀 핀셋으로 시료 마운트를 집어 첫 번째 용기의 액화 가스에 수 초 동안 담급니다.그런 다음 액체 질소가 담긴 두 번째 보관 용기로 빠르게 옮깁니다. 시료가 동결되면, 동결 파쇄 장치(freeze fracture plant)로 옮길 준비가 될 때까지 액체 질소 하에 보관하십시오. 액체 질소 상태에서 금 시료 스터브를 북 형태의 이중 복제 시료 홀더 또는 클램프 장치에 장착하고, 시료 챔버에 배치할 준비가 될 때까지 해당 상태를 유지하십시오.챔버가 고진공 상태에 도달하고 스테이지가 액체 질소 온도까지 냉각되면, 펌프를 끄고 챔버를 벤팅한 후 장착된 시편 스텁을 시편 테이블 위에 최대한 빠르게 배치하십시오. 그 다음 펌프를 켜서 고진공 상태를 다시 설정하고, 전자 스테이지 및 암 온도 제어 장치를 사용하여 시편 테이블 온도를 -100 °C로 조정하십시오. 또한 마이크로톰 암에 액체 질소를 직접 공급하여 액체 질소 온도까지 냉각시키십시오.고진공 상태에 도달하면, 스테이지 온도를 -100 °C로 설정하고 마이크로톰 암(arm)을 액체 질소 온도로 유지한 상태에서 원격으로 이중 복제 시편 홀더를 열어 시편 마운트에 고정된 시편을 파단시킵니다. 선택적인 추가 단계로, 파단 후 하부 구조를 드러내기 위해 시편을 식각(etching)할 수 있습니다. 식각을 수행하려면 마이크로톰 암의 클램프에 고정된 면도날을 사용하여 시편 표면을 얇게 깎아냅니다. 냉각된 마이크로톰 암을 파단된 표면 위에 1분에서 수 분 동안 위치시켜 수분을 승화시킴으로써, 실제 세포 표면, 세포외 기질 및/또는 분자 어셈블리를 드러나게 합니다.다음으로, 백금 탄소 전자총 또는 저항 가열총을 작동시켜 파단면 위에 30도에서 45도 각도로 백금 탄소 얇은 막을 증착합니다. 이 과정은 일반적으로 약 15~20초가 소요됩니다. 이어서 탄소 전자총 또는 저항 가열총을 동일한 방식으로 작동시켜, 복제본을 지지할 수 있도록 파단 시편 표면의 수직 상단 90도 방향에서 탄소 얇은 막을 증착합니다. 이 과정 또한 일반적으로 약 15~20초가 소요되며, 이로써 복제, 섀도잉 및 탄소 안정화 작업이 완료됩니다.진공 펌프와 챔버의 전원을 끄고 장치에서 시편 마운트를 제거합니다. 정밀 핀셋을 사용하여 이중 복제 북클릿 클램프에서 각 금 시편 스텁을 제거하고, 몇 초 동안 해동시킨 후 스팟 플레이트의 수면 위로 스텁을 조심스럽게 내립니다. 정밀 와이어 루프 또는 정밀 핀셋으로 잡은 일반적인 구리 전자현미경 그리드를 사용하여 복제물을 조작하고, 50% 황산에 5% 중크롬산나트륨이 포함된 다른 스팟 플레이트로 옮겨 1시간에서 수 시간 동안 둡니다. 이 용액 처리를 통해 복제물에서 실제 생물학적 시편 물질을 제거합니다.소화가 완료되면 레플리카를 다시 깨끗한 수면으로 옮기고 표준 구리 전자 현미경 그리드 위로 회수합니다. 레플리카 지지 그리드는 시판되는 그리드 박스에 보관하며, 이 상태로 수년간 안정적으로 유지됩니다. 조심스럽게 다루거나 동결 파쇄, 에칭 레플리카의 초미세 구조 검사를 수행할 때는 일반적으로 50에서 80 kilovolts의 가속 전압을 가진 투과 전자 현미경으로 레플리카를 관찰합니다.표준 TEM 필름 또는 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 관련 이미지를 기록하십시오. 각 진핵세포 기저부의 세포막에 위치합니다. 섬모와 편모는 섬모의 축을 둘러싸고 있는 가닥 형태로 조직된 막 결합 입자 배열이며, 이는 섬모 목걸이(ciliary necklace)로 알려져 있습니다. 특수 막 입자 배열은 섬모 형성(Clio Genesis) 과정에 있는 상피 세포의 루멘 경계에서 나타납니다.이러한 입자 배열은 신생 섬모 목걸이를 나타내며, 이는 형성 중이거나 성숙한 섬모의 기저부에 위치합니다. 다양한 상피 세포의 동결 파쇄 연구에 따르면, 기저-외측 경계의 정단면을 둘러싸고 있는 서로 연결된 가닥 및 홈 구조의 정교한 조직이 드러납니다. 상피 세포막을 통과하는 파쇄 시, 밀착 연접의 세포질 파쇄면은 가닥 형태로 나타나는 반면, 세포외 파쇄면은 이에 상응하는 홈 형태를 보입니다.간극연결(Gap junctions)은 다양한 조직의 동결 파쇄 표본에서 나타나며, 세포막 파쇄면의 조밀한 입자 배열과 세포외 파쇄면의 상보적인 구멍(pit)으로 표현됩니다. 여기서는 심부 식각 및 회전 섀도잉(deep etching and rotary shadowing)을 동반한 급속 냉각의 예시가 제시되어 있습니다. 상피세포의 세포질을 통해 파쇄가 이루어졌으며, 화살표 뒤로 세포막 파쇄면이 뚜렷하게 관찰됩니다.후속 식각 과정을 통해 드러난 실제 세포 표면입니다. 일단 숙달되면, 이 기법은 적절히 수행되었을 때 약 3시간 동안 지속되는 한 주기로 1~3개의 시편을 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 개별 단계들이 매우 상호 의존적이며 한 단계에서의 실수가 현상 후 검사 및 평가에 부적합한 결과를 초래할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 기술은 세포 및 분자 생물학 분야의 연구자들이 유전자 돌연변이가 세포 내 구조적 이상을 어떻게 유발하며, 이것이 어떤 방식으로 병리적 상태와 질병을 일으키는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Schönherr, S., et. al. 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특이적 배열을 조사하기 위해 광유전학 및 동결 파괴 복제 면역 라벨링을 결합했습니다. J. Vis. 특급. (2016)이 비디오는 전자 현미경을 위한 마우스 뇌 조직의 동결 파괴 복제본의 면역 라벨링을 보여줍니다. 파쇄되고 코팅된 복제품은 수용체를 노출시키기 위해 소화됩니다. 1차 및 골드 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 특정 신경세포막 수용체를 표지합니다. 복제본은 그리드에 장착되고 전자 현미경으로 시각화됩니다.

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

극저온 전자 현미경은 스캐닝 (SEM) 또는 전송 (TEM) 중 하나는, 널리 높은 수분 함량 1 생체 시료 또는 기타 자료의 특성에 사용됩니다. SEM / 집중 이온 빔 (FIB)는 샘플에 대한 관심의 기능을 식별하고 극저온 TEM에 전송을위한 얇은 전자 투명한 얇은 판을 추출하는 데 사용됩니다.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

고품질 투과 전자 현미경 이미지를 얻는 것은 특히 물이 채워진 큰 액포와 폭기 공간이 풍부한 식물 세포의 경우 어렵습니다. 직렬 고압 동결 및 급속 동결 대체는 TEM을 위한 식물 샘플의 준비 시간을 크게 단축하는 동시에 탁월한 초구조 보존력을 가진 샘플을 생성합니다.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

이 논문은 투과형 전자 현미경으로 현탁 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 cryofixation 방법을 설명한다.

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

우리는 MS 시간적 해상도 막 역학의 시각화를 가능하게 전자 현미경, "플래시와 동결"에서 새로운 기술을 개발했다. 이 기술은 고압 동결 optogenetic 뉴런의 자극을 결합한다. 여기서 우리는 절차를 설명하고 상세하게 프로토콜을 설명합니다.

플래시 및 동결 : 전자 현미경으로 막 역학을 캡처하는 소설 기법

여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

여기서 우리는 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리 된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 샌드위치 동결 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 급속한 동결 후에 초박단면도를 위한 견본을 준비하는 방법을 보여줍니다.

전자 현미경 검사에서 생물학적 표본의 좋은 초구조 보존을 위한 샌드위치 동결 장치를 사용하여 급속한 동결

이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

우리는 암성 비뇨생식기 세포로부터 기원되는 세포밖 소포(EVs)의 분리 및 동결 파쇄를 위한 프로토콜을 제시한다. 동결 파괴 기술은 EV의 직경과 모양, 그리고 EV 멤브레인의 내부 조직을 독특한 특징으로 드러냈다. 이는 EV가 수신자 멤브레인과 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 데 매우 중요합니다.

세포 밖 소포 분석을 위한 동결-골절 전자 현미경 검사

배우세요 생물 전자 현미경에서 동결 골절 및 동결 에칭 기술을 사용하여 세포막의 초미세 구조를 관찰하는 방법을. 이 기법은 얼음 결정 형성을 최소화하며 생물학적 및 나노재료 연구에 필수적입니다.

생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

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