생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

다음 실험의 목적은 투과 전자 현미경으로 관찰하기 위해 생물학적 또는 기타 재료의 탄소-백금 시료 복제본을 제작하는 것입니다. 이를 위해 이중 및 단일 복제본으로 준비된 시료를 초급속 냉동하여 얼음 결정 형성을 제한합니다. 그 다음, 고진공 상태의 액체 질소 온도에서 원격 조작을 통해 냉동된 시료를 파쇄하면, 지질 이중층을 통해 막이 분리되면서 세포 외면과 세포질 측에 인접한 면이 생성됩니다.

선택적인 추가 단계로서, 냉각 마이크로톰 암을 시편 스테이지 위에 배치하여 온도 차이를 생성하면 파단된 시편 표면에서 물이 승화되어 사라지며, 이를 통해 하부의 특징들이 드러날 수 있습니다. 그다음, 파단 표면 위에 탄소와 백금을 증착시켜 복제본을 생성합니다.

원래의 표본은 투과전자현미경 시편 그리드 위에 회수한 복제본으로부터 소화됩니다. 최종적으로 동결 파쇄 동결 식각(freeze fracture freeze etch)법을 사용하여 투과전자현미경으로 관찰함으로써 세포막, 분자 배열 및 나노 물질의 3차원 구조적 세부 사항을 보여줍니다. 초박절편 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 관심 대상물을 전자현미경 해상도의 3차원으로 관찰할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 세포막의 치수 및 구조적 특성과 분자 및 나노 물질 배열의 구성과 같이 세포 및 분자 생물학 및 나노 기술 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저는 유사한 연구가 진핵 미생물을 대상으로 수행되어 중요한 발견이 있었음에도 불구하고, 인간 건강과 관련된 주제에는 관심이 제한적이었다는 점을 인식했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 동결 파쇄 동결 에칭을 위한 생물학적 시료 준비부터 이 절차를 시작하십시오.

미세 핀셋 또는 소구경 주사바늘을 사용하여 처리할 시료에 적합한 크기와 모양의 금 또는 구리 시료 스터브를 선택합니다. 시료의 작은 조각들을 금속 시료 스터브 상단에 배치합니다. 단일 복제본의 경우, 거름종이로 스터브 가장자리의 액체를 흡수시켜 시료의 액체 함량을 끈적거리는 접착제와 유사한 상태가 될 때까지 줄입니다.

이중 복제물을 제작하기 위해 가는 게이지의 주사바늘을 사용하여 스텁 위에 조직을 둥글게 쌓아 올립니다. 다른 스텁을 뒤집어 기존 스텁의 정확히 위쪽에 배치한 다음, 시료 표면 위에 가볍게 놓습니다. 이를 통해 샌드위치 구조를 형성합니다.

두 개의 스터브 사이에서 시료를 눌러 짜내지 마십시오. 다음으로, 두 개의 절연 듀오 용기를 액체 질소로 채웁니다. 첫 번째 용기에는 작은 웰이 포함된 금속 포스트가 들어가며, 이는 시판 실린더로부터 소량의 프로판 가스를 액화시키는 데 사용됩니다.

두 번째 용기는 액체 질소 하에서 냉동 표본을 잠시 유지하기 위한 분할 저장 보관 용기입니다. 프로판은 해당 용도로 인증된 화학 흄 후드 내에서만 사용하십시오. 프로판은 폭발성 물질이므로 외부 점화원을 피하고, 저온 보호복을 착용하며, 적절한 환기를 유지하는 데 주의하십시오.

접촉 시 동상을 유발할 수 있으며 질식제입니다. 프로판 내에 위치한 실린더 노즐을 사용하여 실린더 밸브를 완전히 열고 가스가 첫 번째 용기의 웰로 흘러 들어가 가능한 한 빨리 액화되도록 합니다. 정밀 핀셋으로 시료 마운트를 집어 첫 번째 용기의 액화 가스에 수 초 동안 담급니다.

그런 다음 액체 질소가 담긴 두 번째 보관 용기로 빠르게 옮깁니다. 시료가 동결되면, 동결 파쇄 장치(freeze fracture plant)로 옮길 준비가 될 때까지 액체 질소 하에 보관하십시오. 액체 질소 상태에서 금 시료 스터브를 북 형태의 이중 복제 시료 홀더 또는 클램프 장치에 장착하고, 시료 챔버에 배치할 준비가 될 때까지 해당 상태를 유지하십시오.

챔버가 고진공 상태에 도달하고 스테이지가 액체 질소 온도까지 냉각되면, 펌프를 끄고 챔버를 벤팅한 후 장착된 시편 스텁을 시편 테이블 위에 최대한 빠르게 배치하십시오. 그 다음 펌프를 켜서 고진공 상태를 다시 설정하고, 전자 스테이지 및 암 온도 제어 장치를 사용하여 시편 테이블 온도를 -100 °C로 조정하십시오. 또한 마이크로톰 암에 액체 질소를 직접 공급하여 액체 질소 온도까지 냉각시키십시오.

고진공 상태에 도달하면, 스테이지 온도를 -100 °C로 설정하고 마이크로톰 암(arm)을 액체 질소 온도로 유지한 상태에서 원격으로 이중 복제 시편 홀더를 열어 시편 마운트에 고정된 시편을 파단시킵니다. 선택적인 추가 단계로, 파단 후 하부 구조를 드러내기 위해 시편을 식각(etching)할 수 있습니다. 식각을 수행하려면 마이크로톰 암의 클램프에 고정된 면도날을 사용하여 시편 표면을 얇게 깎아냅니다. 냉각된 마이크로톰 암을 파단된 표면 위에 1분에서 수 분 동안 위치시켜 수분을 승화시킴으로써, 실제 세포 표면, 세포외 기질 및/또는 분자 어셈블리를 드러나게 합니다.

다음으로, 백금 탄소 전자총 또는 저항 가열총을 작동시켜 파단면 위에 30도에서 45도 각도로 백금 탄소 얇은 막을 증착합니다. 이 과정은 일반적으로 약 15~20초가 소요됩니다. 이어서 탄소 전자총 또는 저항 가열총을 동일한 방식으로 작동시켜, 복제본을 지지할 수 있도록 파단 시편 표면의 수직 상단 90도 방향에서 탄소 얇은 막을 증착합니다. 이 과정 또한 일반적으로 약 15~20초가 소요되며, 이로써 복제, 섀도잉 및 탄소 안정화 작업이 완료됩니다.

진공 펌프와 챔버의 전원을 끄고 장치에서 시편 마운트를 제거합니다. 정밀 핀셋을 사용하여 이중 복제 북클릿 클램프에서 각 금 시편 스텁을 제거하고, 몇 초 동안 해동시킨 후 스팟 플레이트의 수면 위로 스텁을 조심스럽게 내립니다. 정밀 와이어 루프 또는 정밀 핀셋으로 잡은 일반적인 구리 전자현미경 그리드를 사용하여 복제물을 조작하고, 50% 황산에 5% 중크롬산나트륨이 포함된 다른 스팟 플레이트로 옮겨 1시간에서 수 시간 동안 둡니다. 이 용액 처리를 통해 복제물에서 실제 생물학적 시편 물질을 제거합니다.

소화가 완료되면 레플리카를 다시 깨끗한 수면으로 옮기고 표준 구리 전자 현미경 그리드 위로 회수합니다. 레플리카 지지 그리드는 시판되는 그리드 박스에 보관하며, 이 상태로 수년간 안정적으로 유지됩니다. 조심스럽게 다루거나 동결 파쇄, 에칭 레플리카의 초미세 구조 검사를 수행할 때는 일반적으로 50에서 80 kilovolts의 가속 전압을 가진 투과 전자 현미경으로 레플리카를 관찰합니다.

표준 TEM 필름 또는 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 관련 이미지를 기록하십시오. 각 진핵세포 기저부의 세포막에 위치합니다. 섬모와 편모는 섬모의 축을 둘러싸고 있는 가닥 형태로 조직된 막 결합 입자 배열이며, 이는 섬모 목걸이(ciliary necklace)로 알려져 있습니다. 특수 막 입자 배열은 섬모 형성(Clio Genesis) 과정에 있는 상피 세포의 루멘 경계에서 나타납니다.

이러한 입자 배열은 신생 섬모 목걸이를 나타내며, 이는 형성 중이거나 성숙한 섬모의 기저부에 위치합니다. 다양한 상피 세포의 동결 파쇄 연구에 따르면, 기저-외측 경계의 정단면을 둘러싸고 있는 서로 연결된 가닥 및 홈 구조의 정교한 조직이 드러납니다. 상피 세포막을 통과하는 파쇄 시, 밀착 연접의 세포질 파쇄면은 가닥 형태로 나타나는 반면, 세포외 파쇄면은 이에 상응하는 홈 형태를 보입니다.

간극연결(Gap junctions)은 다양한 조직의 동결 파쇄 표본에서 나타나며, 세포막 파쇄면의 조밀한 입자 배열과 세포외 파쇄면의 상보적인 구멍(pit)으로 표현됩니다. 여기서는 심부 식각 및 회전 섀도잉(deep etching and rotary shadowing)을 동반한 급속 냉각의 예시가 제시되어 있습니다. 상피세포의 세포질을 통해 파쇄가 이루어졌으며, 화살표 뒤로 세포막 파쇄면이 뚜렷하게 관찰됩니다.

후속 식각 과정을 통해 드러난 실제 세포 표면입니다. 일단 숙달되면, 이 기법은 적절히 수행되었을 때 약 3시간 동안 지속되는 한 주기로 1~3개의 시편을 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 개별 단계들이 매우 상호 의존적이며 한 단계에서의 실수가 현상 후 검사 및 평가에 부적합한 결과를 초래할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술은 세포 및 분자 생물학 분야의 연구자들이 유전자 돌연변이가 세포 내 구조적 이상을 어떻게 유발하며, 이것이 어떤 방식으로 병리적 상태와 질병을 일으키는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.