3D 그래 핀 전극 유전 영동 장치의 개발

본 프로토콜에서는 3D 적층 그래핀 종이 및 전극 마이크로 소자의 제작 절차와, 소자 내에서 유전영동(DI electrophoresis) 또는 유전영동(DEP)을 통해 폴리스티렌 비드나 생체 세포를 제어하는 실험 방법을 설명합니다. 지금부터 유전영동은 DEP로 지칭하겠습니다. 소자 제작은 먼저 50 micron 그래핀 종이를 층별로 쌓고 그 사이에 100 micron 감압 폴리머 테이프를 N-1개 층으로 교대로 적층하여, 절반은 신호 전극, 나머지 절반은 접지 전극이 되도록 구성함으로써 이루어집니다.

층들을 함께 압착하고 다듬은 다음, 구조물을 관통하여 마이크로 웰을 드릴로 뚫습니다. 마지막으로, 은 에폭시를 사용하여 장치의 양 끝단에 두 개의 구리 리드선을 부착합니다. 두 번째 단계는 원하는 전도도를 가진 DEP 배지를 준비하는 것입니다.

그런 다음 폴리스티렌 비드를 특정 부피 비율로 이 배지 용액에 현탁시킵니다. 세 번째이자 마지막 단계는 준비된 비드 현탁액을 장치에 로딩하고, 이를 현미경 스테이지에 장착한 뒤, 장치를 함수 발생기에 연결하여 최종적으로 DEP를 시작하는 것입니다. 마지막으로 현미경을 사용하여 DEP 반응을 기록하고 추가 분석을 통해 세포 또는 입자의 특성을 연구합니다.

그래핀은 강도뿐만 아니라 열적, 전기적 특성으로 인해 활용되는 다재다능한 물질입니다. 본 프로토콜에서는 저렴한 그래핀 종이를 3차원 유전영동 마이크로 장치의 전도성 전극 층으로 사용하여, 혈액형 판정이나 질병 세포의 의료 진단과 같은 응용 분야를 위해 입자와 세포를 구별하는 방법을 활용합니다. 이러한 그래핀 종이 전극 마이크로 장치의 장점으로는 제작의 용이성, 더 높은 시료 처리량 및 기하학적 다재다능함 등이 있습니다.

3D 비균일 전기장은 분극성 입자와 세포의 고유한 화학적 및 형태적 특성에 따라 이들을 구별할 수 있는 독특한 DP 힘을 이용해 대용량 시료를 조작할 수 있습니다. 그래핀 종이와 테이프를 사용하여 적층형 장치를 조립하십시오. 여기서는 상용 제조사의 75 µm 두께 소수성 그래핀 종이와 100 µm 두께의 감압 양면테이프를 사용합니다.

먼저 수술용 메스와 직선 자를 사용하여 그래핀 종이를 6.7 centimeters by 1.5 centimeter 크기의 직사각형으로 자르고, 가위를 사용하여 양면 감압 테이프를 1.3 centimeters by 약 five centimeter 크기의 스트립 5개로 자릅니다. 깨끗한 유리 슬라이드 위에 그래핀 종이의 첫 번째 층을 놓습니다. 인접한 두 그래핀 종이 층 사이에 절연이 유지될 수 있도록 약 two millimeter의 여백을 남긴 채, 그래핀 종이의 한쪽 끝을 테이프 스트립 하나로 천천히 덮습니다.

두 번째 그래핀 페이퍼 층을 테이프 위에 올립니다. 첫 번째 그래핀 페이퍼 층과 겹치지 않게 어긋나게 배치합니다. 층 사이의 밀착력을 높이기 위해 상단을 적당한 압력으로 누릅니다.

나머지 층에 대해서도 위의 두 단계를 반복하며, 최상층과 최하층이 모두 그래핀 종이가 되도록 합니다. 가위로 장치 가장자리의 과도한 테이프를 제거하되, 그래핀 종이 층 사이의 밀폐 절연을 보장하기 위해 약 1mm 정도의 여백을 남깁니다. 멀티미터를 사용하여 장치 반대편의 전기 리드에 양극 및 음극 프로브를 배치하고 신속하게 절연 테스트를 수행합니다.

수백 kΩ 정도의 높은 저항값은 층 간 절연 상태가 양호함을 나타냅니다. 이제 적층 구조에 마이크로 웰(micro well)을 드릴링할 준비가 되었습니다. 마이크로 밀(micro and mill)을 사용하여 적층 구조에 마이크로 웰을 드릴링합니다.

본 단계에서는 직경 700 µm, 플루트 길이 약 2.1 mm의 마이크로 엔드밀을 사용합니다. 마이크로 엔드밀의 선택은 마이크로 웰의 직경과 장치의 두께에 따라 결정됩니다. 클램프를 사용하여 적층 구조물을 마이크로 드릴링 스테이지 위에 고정하고, 컴퓨터 제어 장치를 통해 엔드밀의 끝단이 구조물 상단에 가깝게 위치하도록 조절한 뒤 장치 위에 가압 공기를 분사합니다. 엔드밀을 회전시키기 시작한 다음, 적층 구조물의 중심부로 엔드밀을 천천히 내려 관통시킵니다.

새로 뚫은 구멍에서 잔여물을 완전히 제거하기 위해 적층 구조 깊이보다 약간 더 깊은 지점에서 멈추십시오. 엔드밀을 마이크로 웰 내부에서 위아래로 여러 번 움직여 내벽을 매끄럽게 다듬으십시오.

마이크로 웰의 내벽 표면은 가능한 한 수직이고 깨끗해야 합니다. 최적의 전기장 구배와 마이크로 웰을 통한 빛의 투과를 위해, 표준 32 gauge 구리선을 3cm 길이의 조각 두 개로 자르고 2cm 지점에서 직각으로 두 번 접습니다. 은 전도성 에폭시의 파트 A 약 0.75 mm와 파트 B 약 0.75 mm를 수동으로 혼합합니다.

작은 용기에서, 세 층의 그래핀 종이 층 팁 부분과 층 사이에 실버 에폭시를 조심스럽게 도포하여 층 간의 접촉이 잘 이루어지도록 와이어를 연결합니다. 다음으로, 1 cm 길이의 와이어를 임의의 두 층 사이에 배치하고, 층을 살짝 눌러 과도한 에폭시를 제거하고 전기적 접촉이 잘 되도록 합니다. 라미네이트 구조의 반대편에도 동일하게 반복합니다.

장치 전체를 랙에 놓은 뒤 오븐에서 70 °C, 1기압 조건으로 하룻밤 동안 건조합니다. 오븐에서 장치를 꺼내 전극 리드 사이의 전기 절연 상태를 확인합니다. 여기서는 미리 제조된 290 mOsm/L mannitol 용액과 PBS를 다양한 비율로 혼합하여 다양한 전도도를 가진 용액 매질을 만듭니다.

이들은 세포 배양 버퍼를 대략적으로 모방하기 위해 선택된 단순한 용액들입니다. 이 두 용액의 부피 비율과 결과 용액의 전도도 사이에는 선형 상관관계가 존재합니다. 피펫팅을 통해 polystar 비즈 또는 생물학적 세포를 1:100의 부피 비율로 전도도 조제 배지와 혼합합니다. 10 µL의 polystar 비즈와 1 mL의 배지 용액을 샘플 바이알에 넣습니다.

Vortexing을 통해 샘플을 충분히 혼합합니다. 수정된 종이 클램프 또는 그에 상응하는 도구를 사용하여 적절한 압력으로 장치를 유리 슬라이드 위에 고정합니다. 이때 지지대가 마이크로 웰에 충분히 밀착되어 적층 구조가 유리 슬라이드에 밀봉됨으로써 샘플 누출이 방지되어야 합니다.

클램프의 조임 정도는 장치를 변형시켜 웰의 기하학적 구조와 광경로를 부정적으로 변화시키지 않도록 조절해야 합니다. 다이아몬드 팁 유리 절단기를 사용하여 0.5 millimeter 두께의 커버 글라스를 마이크로 웰을 간신히 덮을 수 있는 너비로 자릅니다. 커버 글라스를 적절한 크기로 자른 후 따로 둡니다. 마이크로 시린지를 사용하여 폴리스티렌 비드 현탁액 약 1 microliter를 마이크로 웰에 천천히 주입합니다. 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해, 기포가 발생하면 주입을 반복하고 날카로운 바늘로 마이크로 웰 벽면이 손상되지 않도록 주의합니다. 마이크로 웰을 약간 넘치게 채운 뒤 즉시 준비된 유리 커버를 마이크로 웰 위로 밀어 넣어 과잉 액체를 제거함으로써 증발을 방지하고 재현 가능한 부피를 확보합니다.

각 실험마다 라미네이트 처리된 마이크로 소자 전체를 현미경 스테이지에 고정하고 함수 발생기를 연결합니다. 악어 클립을 사용하여 소자를 구리 리드선에 연결하고, 현미경 소프트웨어를 통해 초점을 조정하여 마이크로 웰이 선명하게 보이도록 합니다. 화면 중앙에 100 Hz에서 10 MHz, 그리고 15 V가 표시됩니다.

장치에 피크 톱(Peak tope) 신호를 인가하였습니다. 유리 슬라이드 표면 위 1~200 µm 높이의 마이크로웰 내에서 비드를 10배 배율로 관찰하였습니다. 버튼을 클릭하여 카메라 녹화 및 데이터 수집을 시작하십시오.

카메라 녹화를 시작한 2초 후에 함수 발생기 신호를 가동합니다. 이후 강도 분석을 위해 약 5분 동안 초당 1~5프레임의 속도로 이미지를 디지털 방식으로 저장합니다. 실험이 완료되면 장치를 제거하고 클램프를 해체합니다.

비눗물로 유리 슬라이드와 장치를 모두 세척하십시오. 그 다음 깨끗이 헹굽니다. 전기장이 없는 상태에서는 중력으로 인해 입자들이 장치 바닥으로만 침전됩니다. 약 1 kHz의 전기장 하에서, 그래핀 종이에 더 가까운 전기장 구배 방향으로의 이동은 양성 DEP 거동을 나타냅니다.

100 kilohertz 이상의 전기장 및 megahertz 범위에서 마이크로 웰 가장자리에 전극이 관찰됩니다. 비드(bead)가 전기장 구배를 따라 마이크로 웰 중심으로 이동하는 것으로 나타나는 음의 DEP가 관찰됩니다. 이 3D 그래핀 페이퍼 전극 마이크로 소자는 이론적 예측 거동 및 이전에 보고된 실험 결과 모두와 밀접하게 일치하는 실험 결과를 나타냈습니다.

소자 제작 방식은 매우 다재다능합니다. 제공된 프로토콜은 더 많은 층을 갖거나 다른 재료를 사용하는 소자에 맞게 쉽게 조정될 수 있습니다. 이 비디오에서는 배치 방식의 3D DEP 마이크로 소자 제작 과정을 자세히 설명합니다.

하지만 향후 응용 분야에서는 처리량을 높이기 위해 입자 또는 세포 현탁액을 장치의 마이크로 웰을 통해 연속적으로 흐르게 할 수 있습니다. DEP 분리의 다재다능함의 한 예로, 흡수성 그래핀 종이가 입자 또는 세포 농축기를 위한 전극과 필터로 동시에 기능하거나, 전기 운동 생화학 센서로 활용될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 시청자는 다층 그래핀 종이 전극 마이크로 장치를 제작하는 방법과 입자 또는 세포 실험을 수행하기 위해 장치를 작동시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.