차세대 시퀀싱에 대한 수집 및 타액 DNA의 추출

이 절차의 전반적인 목표는 전체 타액에서 고품질 게놈 DNA를 추출하는 것입니다. 이것은 먼저 세포를 용해시켜 DNA를 방출함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 RNA와 단백질 불순물을 제거하는 것입니다.

세 번째 단계는 게놈 DNA를 침전시키고 남아 있는 오염 물질이나 불순물을 제거하는 것입니다. 마지막 단계는 PCR 및 염기서열분석과 같은 다운스트림 애플리케이션을 위해 게놈 DNA를 재수화하는 것입니다. 궁극적으로 분광, 측광 및 증폭은 집단 게놈 DNA가 고품질임을 보여줄 수 있습니다.

수집 키트에 비해 이 기술의 주요 장점은 수율 손실 없이 비용이 크게 절감된다는 것입니다. 타액을 채취하기 30분 전, 피험자는 물로 입을 헹구고 검체를 채취할 때까지 음식이나 음료를 삼가야 한다. 샘플을 채취하기 위해, 피험자가 2.5 밀리리터의 DNA 안정화 완충액이 들어있는 15 밀리리터 튜브에 정확히 2.5 밀리리터의 타액을 뱉게 한다.

튜브 내부나 캡 내부를 만지지 마십시오. 이 과정에서 튜브를 덮고 흔들리지 않는 반전으로 혼합물을 균질화합니다. 그런 다음 샘플을 단기 동안 실온에서 보관하거나 최대 3개월 동안 섭씨 4도에서 보관합니다.

준비에는 수조를 섭씨 37도까지 가열하고 3개의 15밀리리터 튜브를 준비하는 것이 포함됩니다. 샘플을 몇 번 뒤집는 것으로 시작한 다음 15초 동안 중간 속도로 소용돌이칩니다. 2.5ml의 샘플을 튜브 중 하나로 옮깁니다.

부분 표본에 5ml의 세포 용해 용액을 추가하고 튜브를 50회 뒤집어 용해 용액을 샘플에 혼합합니다. 샘플이 혼합되면 30분 동안 배양합니다. 30분 후 실온에서 밀리리터당 100밀리그램의 RNA A 40마이크로리터를 용해된 세포 용액에 추가합니다.

그런 다음 튜브를 빠르게 다섯 번 뒤집습니다. RNA 반응을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 얼음에서 튜브를 3분 동안 식힙니다.

이 시점에서 수조 온도를 섭씨 65도로 높입니다. 다음으로 얼음에서 튜브를 제거합니다. 50 마이크로리터의 proteinase K를 첨가하고 혼합하여 반응을 실온에서 30분 동안 배양하거나 섭씨 4도에서 16-24시간 동안 배양합니다.

나중에 1.7 밀리리터의 단백질 침전 용액을 넣고 튜브를 고속으로 20 초 동안 와류로 만듭니다. 그런 다음 샘플을 얼음에서 10분 동안 식힙니다. 냉각되면 3000Gs 및 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.

펠릿이 단단하지 않으면 샘플을 5분 더 식힌 다음 다시 5분 동안 원심분리합니다. 단단한 입천장을 얻을 때까지 이 과정을 반복합니다. 항상 샘플을 차갑게 유지하십시오.

5밀리리터의 이소프로판올과 8마이크로리터의 글리코겐 용액이 들어 있는 깨끗한 15밀리리터 튜브를 밀리리터당 20밀리그램으로 준비하여 DNA 분리를 시작합니다. 그런 다음 스핀 다운 샘플의 앙와위 제를이 튜브에 붓습니다. 펠릿을 버리고 샘플을 반전으로 50회 혼합합니다.

다음으로, 3000Gs에서 30분 동안 섭씨 4도에서 샘플을 스핀다운합니다. supinate를 다른 깨끗한 15 밀리리터 튜브에 펠릿에 붓습니다. 70% 에탄올 1ml를 넣고 30초 동안 손으로 옆으로 흔듭니다.

그런 다음 에탄올 용액을 2000Gs와 섭씨 4도 또는 20도에서 1분 동안 원심분리합니다. 센넷을 버리고 천천히 붓고 펠릿에 에탄올을 더 넣으십시오. 두 개를 손으로 흔들고 스핀을 반복합니다.

그런 다음 천천히 에탄올을 다시 붓습니다. 세탁하는 동안 펠릿이 헐거워질 수 있습니다. 분리되면 에탄올 용액에 남아 있고 튜브의 측면이나 뚜껑에 달라붙지 않는지 확인하십시오.

이 세척 중에 튜브를 뒤집지 마십시오. 에탄올 세척 후 튜브를 15-30분 동안 자연 건조하도록 설정합니다. 그런 다음 먼저 300마이크로리터의 트리스 EDTA를 추가하여 게놈 DNA 펠릿을 재수화합니다.

다음 5 초 동안 중간 속도로 표본을 와동시키고 목욕에서 가열되기 후에 시간 동안 65 섭씨 온도 목욕으로 표본을 옮기고십시오, 표본이 실내 온도에 밤새 잠복하게 하십시오 다음날 DNA는 타액의 사용 젤 전기 이동법, DNA 적출 표본 쇼를 위해 준비되어 있을 것입니다. DNA가 저하되었음을 나타내는 번짐이 없는 고분자량 밴드. RNA 제거 단계는 필수적이며 매우 효과적입니다.

RNA가 소화된 후 260나노미터 대 280나노미터의 비율은 평균 1.74입니다. 중요한 것은 DNA가 고처리량 염기서열분석에 적합하다는 것입니다. DNA의 2.6메가베이스를 표적으로 하는 24개의 샘플에 타겟 농축 키트를 적용했으며, 레인당 12개의 바코드 샘플을 염기서열분석했습니다.

24개의 샘플 모두 고품질 NGS 데이터를 가지고 있으며 드문 단일 뉴클레오티드 다형성을 확인할 수 있었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전체 타액에서 고품질 게놈 DNA를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.