Name: 차세대 시퀀싱에 대한 수집 및 타액 DNA의 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 학습하세요 타액에서 고품질 게놈 DNA를 추출하는 비용 효율적인 방법을. 세포 용해, RNA 및 단백질 제거, DNA 침전 및 재수화 단계를 포함하며, PCR과 차세대 시퀀싱에 적합한 고순도 DNA를 얻습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) R01(CWB에 대한 DC009453 지원)의 지원을 받았습니다.

참고 : 이전 타액 샘플을 제공하기 위해 모든 주제는 전국 어린이 병원에서 사람을 대상으로 치료를위한 가이드 라인을 준수 동의를 통보했다. 1 타액 수집 및 저장 <ol><li> 타액을 수집하기 전에 피사체의 입 피사체가 물로 입을 헹구어 갖는 식사를 피하거나 샘플을 수집하기 전에 30 분 동안 마시는 음식이나 이물질이 없는지 확인합니다. </li><li> 캡 또는 튜브의 내부에 손이 닿지 않도록 확인하는 DNA 안정화 버퍼 (2) 2.5 ㎖로 15 ㎖의 원심 분리기 튜브를 열고 피사체가 완충 용액에 침 2.5 ㎖의 침이있다. 참고 : 타액의 이상 2.5 ml의 수집은 DNA 안정화 버퍼에 샘플의 부족 비율에서 샘플이 저하 될 수 있습니다. 너무 작은 타액을 수집하는 프로토콜에서 예상 수확량을 감소시킬 것이다. 컬렉션 볼륨을 평가하려면, t 측에 번호 그라디언트를 사용그는 튜브. </li><li> 캡을 교체하고, 혼합물을 균질화 될 때까지 반전으로 섞는다. 격렬한 흔들림이 필요하지 않습니다. 단기 기억 또는 장기 저장을위한 4 ° C (&gt; 3 개월)에 대한 RT에서 샘플을 보관합니다. </li></ol> 2 초기 준비 및 세포 용해 <ol><li> 이전 추출을 시작으로, 37 ° C에 수조를 가열하고, 얼음 양동이를 준비합니다. 세 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브는 각 추출 된 샘플에 대해 필요합니다. 세 튜브 세포 단백질 펠렛, 최종 gDNA를 추출하고, 이소프로판올 및 에탄올 상청액을 보유하는 데 사용된다. </li><li> 15 초 후 중간 속도로 소용돌이를 저장에서 샘플 및 반전 샘플을 여러 번 검색합니다. </li><li> 깨끗한 15 ㎖의 원심 분리 관에 시료를 2.5 ㎖에 분배하고, 세포 용해 용액 5 ㎖를 추가합니다. 반전에 의해 시료 50 시간 혼합하고, 30 분 동안 RT에서 배양한다. </li></ol> 3 RNA 제거 <ol><li> 의 RNase 솔의 40 μl를 추가100 ㎎ / ㎖에서의 ution, 그리고 15 분 동안 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 3 분 동안 얼음에 37 ° C의 물을 욕조에서 샘플을 제거하고 멋진. <ol><li> 의 RNase 인큐베이션 후, 프로토콜의 DNA의 재수 단계에서 65 ° C로 수조의 온도를 증가시킨다. </li></ol></li></ol> (4) 단백질 및 지질 제거 <ol><li> , ㎖ / 20 밀리그램에 테 K 솔루션의 50 μl를 추가 반전에 의해 여러 번 혼합과 30 분의 최소 RT 부화. 참고 :이 프로토콜에 대한 가능한 일시 정지 포인트입니다. 추출이 완료 될 때까지 K 테 수용액을 첨가 한 후, 샘플을 4 ° C에서 저장 될 수있다. 최대 24 시간 동안 4 ℃에서 보관 추출 수율 또는 DNA의 품질에 상당한 영향을 미치는 것으로 도시되지 않았다. 이 단계에서 장기 저장이 평가되지 않았습니다. </li><li> 10 분 동안 얼음에 20 고속 초, 및 장소를 적극적 소용돌이 단백질 침전 솔루션의 1.7 ML을 추가합니다. </l난&gt; <li> 샘플은 3000 XG에 10 분, 4 ° C에 10 분, 원심 분리기에 얼음에 냉각 한 후에. 침전 된 단백질은 단단한 펠릿이 계속 형성해야합니다. 펠릿을 꽉 없거나 흐린 용액이 여전히 있다면, 샘플은 5 분 더 얼음 위에서 냉각 할 수 있고, 원심 분리를 반복. 샘플은 단단한 펠릿을 보장하기 위해 얼음에 보관해야합니다. </li></ol> (5) 분리 및 gDNA를 정제 <ol><li> 깨끗한 15 ㎖의 원심 분리 관에, 피펫 아이소 프로필 알코올 5 ㎖ 및 20 ㎎ / ㎖에서 순수 글리코겐 솔루션의 8 μL. </li><li> 침전 된 단백질 펠렛을 남겨두고, 아이소 프로필 알코올과 글리코겐 솔루션을 포함하는 튜브에 4.3 단계에서 gDNA를가 포함 된 상층 액을 붓는다. 상층 액을 추가 한 후, 부드럽게 3000 XG 및 4 ℃에서 30 분 동안 샘플을보기 반전 원심 분리에 의해 50 시간 혼합한다. </li><li> 깨끗한 15 ML 튜브에 천천히 뜨는을 붓고. 상청액을 제거한 후, 70 % 에탄올 1 ㎖를 추가 할수회 천천히 부드럽게 흔들 석출 펠렛 위에 에탄올을 이동하여 펠렛을 씻는다. 튜브에서 에탄올을 유지합니다. </li><li> 초기 세척 한 후, 2000 XG에 1 분, 20 ° C에 대한 샘플을 원심 분리기. 이 원심 분리 단계는 4 ° C에서 20 ° C 중 하나에서 수행 할 수 있습니다. 온도의 큰 영향이 단계에서는 도시되지 않았다. </li><li> 펠렛의 초기 세척 및 원심 분리 후, 천천히 튜브에서 에탄올 세척을 부어 버리고, 다음 단계 5.3 및 5.4를 반복하여 두 번째 세척을 수행합니다. </li><li> 두 번째 세척에서 상층 액의 제거 후, ​​15 분간 자연 건조 펠렛을 할 수 있습니다. <ol><li> 시료를 완전히 건조되지 않은 경우, 또 다른 15 분 동안 공기 건조. </li></ol></li></ol> gDNA를의 6 재수 <ol><li> 샘플이 건조되면, 건조 gDNA를 펠렛을 재수하는 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 300 μl를 추가합니다. </li><li> 중간 속도와 장소에서 5 초 동안 소용돌이 샘플1 시간 동안 65 ° C 온수 목욕입니다. </li><li> 수조에서 샘플을 제거하고 RT에서 O / N을 품어. 참고 : 모든 제품 및 시약 재료 표에 나와있는 사용뿐만 아니라, 표 4. </li></ol>

<ol><li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li>
<li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Research+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li>
<li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).</li>
<li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li>
<li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+blood%2C+saliva%2C+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort%3A+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li>
<li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc%CE%B3+receptor+iia+%28cd32%29+and+fc%CE%B3+receptor+iiib+%28cd16%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li>
<li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates%2C+from+salivary+analyses%2C+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li>
<li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale%2C+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).</li>
<li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+genotype-phenotype+model+determinism%3A+Application+to+bivariate+reading%2Flanguage+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

본 절차는 상당히 DNA의 품질을 손상시키지 않고, 표준 방법에 비해 고 분자량 DNA의 수율이 향상되었다 최적화 DNA 추출 프로토콜이다. 수율을 최대한에 가장 큰 효과 중요한 단계 널리 11을 배포하지 않은 일을 제외하고, 여기에서 검토 게시 된 프로토콜에 비해 에탄올 침전 동안 이상 원심 분리 단계를 포함하는 단계 5.2였다. 이 이상 원심 분리와 관련된 DNA 품질의 변경은 전체 타액 컬렉션에서 사용할 수있는 DNA의 대부분은 분자량 저하와 높은이 불가능하다는 것을 나타냄 검출되지 않았다. 항목 타액 컬렉션은 수집 단계에서 최소화되어야 외래 오염물에 대한 잠재, 및 하부 감염의 징후 일 수있다 시료 과도한 단백질의 존재로 샘플 품질에 한계가있다. 단백질이나 이물질 오염 물질의 다량의 수하여 정량화가 부정확하고 최종 추출 된 DNA에 남아있다. 재수 화 (단계 6)이 의심 된 후 잔여 단백질이나 오염이있는 경우, 샘플은 샘플 입력 볼륨을 반영하기 위해...

인간 유전 연구 고품질 DNA를 얻는 것은 질병 유전자 발견 프로세스에 필수적이다. 혈액, 타액 수집보다 더 비싼 또한 침략적인 절차를 요구하고 있지만, 기능 연구에 대한 무한 DNA의 소스 또는 iPSCs로 불후의 세포 라인을 만드는 선호하고, 세포주를 사용할 수없는 경우 때때로 혈액 DNA가 사용됩니다. 그러나, 혈액을 획득하는 훈련 된 phlebotomist을 필요로 피가 침 하나보다 짧은 반감기를 가지고있다. 그것을 수집함으로써 잘 병원 실험실 (2)의 집수 영역을 넘어 전위 피사체 풀을 증가 phlebotomist 필요없이 이메일을 통해 전송 될 수 있기 때문에 타액으로부터 DNA는 얻을 저렴하고 용이하다. 과목 대신 혈액 3, 4의 타액 샘플을 채취 할 수있는 옵션이있을 때 연구 등록이 개선 될 수있다. 수량과 타액에서 DNA의 질에 대한 우려는 우리가 널리 제한되어 있습니다타액 2, 3, 4, 5의 상당한 양을 구하는 않았다 이전 협측 면봉 방법을 통해 DNA 테스트에 대한 밀리리터 당 4.3 × 105 세포의 평균으로, 전체 타액의 적합성을 나타내는 수많은 연구 최근의 연구에도 불구하고, 즉, 6. 겸손한 문학 마이크로 어레이 기반 방식 팔을 포함하여 유전자형 응용 프로그램에 대한 전체 타액 유래 DNA의 적합성을 보여주는 존재하지만 9, 10, 더 연구가 시도되지 않은 차세대 시퀀싱 (NGS). 이 모든 타액 DNA 추출 프로토콜을 최적화하는 목적은 쉽게 일반적인 시약 및 소모품으로 실험실에서 구현 비용 효과적인 방식으로 응용 프로그램에 대한 유전학 수량 및 품질을 최대화하는 것이다. 타액에서 DNA 추출은 여러 절차가 필요합니다 : 1) 수집 및 저장, 2) 세포 용해, 3)의 RNase 처리, 4) 단백질 침전, 5) 에탄올 침전, 6) DNA의 수분 보충을. 기재된 DNA 안정화 버퍼 용액이전에이 적절하게 변경없이 작동합니다. 의 RNase 처리 및 DNA의 수분 보충 단계를 최적화하기위한 어떠한 시도도하지 않았다. 나머지 각 단계의 수율에 영향을 미칠 수있는 여러 변수가 확인되었다. 각 변수를 개별적으로 조작하고, 수율 및 품질의 향상이 통계적으로 평가 하였다. 수율 및 / 또는 DNA의 품질을 향상시키기 위해 도시 된 변수의 최적 값은 최종 프로토콜에 포함되었다.

<table><tbody><tr><td>15ml 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>세포 용해 용액</td><td>Qiagen</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>단백질 침전 용액</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>EZ-BioResearch</td><td>S1003</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher</td><td>BP2473-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>AC194090010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M) 용액</td><td>Fisher</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데실 황산염</td><td>Fisher</td><td>BP166-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>아날로그 볼텍스 믹서</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr></tbody></table>

차세대 시퀀싱에 대한 수집 및 타액 dna의 추출

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

인간 유전학 연구에서 선호되는 DNA 공급원은 혈액 또는 혈액에서 유래한 세포주이며, 이러한 공급원은 고품질의 DNA를 대량으로 생산하기 때문입니다. 그러나 타액에서 DNA를 추출하면 정맥 의사의 비용 없이 다양한 DNA 분석에 적합하고 우편을 통해서도 얻을 수 있는 분해/단편화가 거의 또는 전혀 없는 고품질 DNA를 얻을 수 있습니다. 그러나 현재 차세대 염기서열분석을 위한 타액 DNA 수집/추출 프로토콜은 문헌에 제시되어 있지 않습니다. 이 프로토콜은 타액 채취/저장 및 DNA 추출의 매개변수를 마이크로어레이 유전형 분석 및 차세대 염기서열분석을 포함한 최고 수준의 DNA 분석을 위한 충분한 품질과 양으로 최적화합니다.

DNA는 한 쌍의 DNA를 추출하는 일련의이 수행 된 추출을위한 최적의 매개 변수를 결정합니다. 하나의 타액 샘플을 분할하고 각 부분은 주어진 변수에 대한 두 가지 값 중 하나를 사용하여 테스트되었습니다. 각 쌍 테스트 적어도 8 회 반복 (예를 들어, 하나의 타액 샘플과 초기 50 ° C에서 배양없이 모두 추출을 테스트하기 위해 분주했다)을 시행 하였다. 총 DNA 수율, 280 분의 260 값 230분의 260 값과 분열을 평가하기 위해 전기 영동 DNA의 육안 검사 : 최적화는 네 표준 통계에 근거했다. 변수의 모든 가능한 조합을 개별적으로 각 변수의 한계 효과를 평가하기 위해 대신 사용 중단, (N = 169의 조합) 통계적인 상호 작용을 평가 하였다. 효과는 다중 방식보기 회 반복 측정 ANOVA를 사용하여 시험하였고, 예상 효과는 동등한 회귀 방정식으로부터 유도 하였다. 모든 중요한 효과는 단언로서 도시, 다음 표 1에 나타내었다수율 시대 변화 또는 DNA의 품질 (28...

타액에서 DNA를 추출하면 분해/단편화가 거의 또는 전혀 없이 쉽게 구할 수 있는 고분자량 DNA를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 타액 채취/저장 및 DNA 추출을 위한 최적화된 매개변수를 제공하여 고품질 요구 사항을 가진 다운스트림 DNA 분석을 위한 충분한 품질과 양을 제공합니다.

차세대 시퀀싱에 대한 수집 및 타액 DNA의 추출

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

본 절차의 전반적인 목적은 전saliva(전타액)로부터 고품질의 genomic DNA를 추출하는 것입니다. 이는 먼저 세포를 용해하여 DNA를 방출시킴으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 RNA 및 단백질 불순물을 제거하는 것입니다.세 번째 단계는 게놈 DNA를 침전시키고 남아 있는 오염 물질이나 불순물을 제거하는 것입니다. 마지막 단계는 PCR 및 시퀀싱과 같은 후속 응용 분석을 위해 게놈 DNA를 재수화하는 것입니다. 결과적으로 분광 광도법과 증폭 과정을 통해 수집된 게놈 DNA가 고품질임을 확인할 수 있습니다.이 기술이 수집 키트보다 갖는 주요 장점은 수율의 손실 없이 비용을 크게 줄일 수 있다는 점입니다. 타액을 수집하기 30분 전에 피험자는 물로 입안을 헹구어야 하며, 시료를 채취할 때까지 음식물이나 음료 섭취를 삼가야 합니다. 시료를 채취하려면, 2.5 mL의 DNA 안정화 완충액이 들어 있는 15 mL 튜브에 피험자가 정확히 2.5 mL의 타액을 뱉도록 합니다.튜브 내부나 캡 내부를 만지지 마십시오. 이 과정 동안 튜브의 캡을 닫고, 흔들지 말고 뒤집어서 혼합물을 균질화하십시오. 그 다음 샘플을 단기간 보관할 때는 상온에, 최대 3개월까지 보관할 때는 4 °C에 보관하십시오.준비 단계로 항온수조를 37 °C로 가열하고 15 mL 튜브 3개를 준비합니다. 먼저 시료를 몇 번 뒤집어 섞은 다음, 중간 속도로 15초 동안 볼텍싱합니다. 시료 2.5 mL를 준비한 튜브 중 하나로 옮깁니다.분취액에 5 mL의 세포 용해 용액을 넣고, 튜브를 50회 반전시켜 용해 용액이 시료에 섞이도록 합니다. 시료가 혼합되면 30분 동안 배양합니다. 상온에서 30분이 지난 후, 용해된 세포 용액에 100 mg/mL 농도의 RNA A 40 µL를 첨가합니다.그 후 튜브를 빠르게 다섯 번 뒤집어 섞어줍니다. RNA 반응액을 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 얼음에 박아 3분 동안 냉각합니다.이 시점에서 워터 배스의 온도를 65°C로 높입니다. 다음으로, 튜브를 얼음에서 꺼냅니다. 50 µL의 proteinase K를 첨가하고 혼합한 후, 반응물을 상온에서 30분 동안 또는 4°C에서 16~24시간 동안 배양합니다.그 후, 단백질 침전액 1.7 milliliters를 첨가하고 튜브를 고속으로 20초 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에서 10분 동안 냉각시킵니다. 냉각이 완료되면, 샘플을

collection-and-extraction-of-saliva-dna-for-next-generation-sequencing

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

향후 임상 응용을위한 타액 표본 추출을 고려 롤리팝 같은 ultrafiltration (LLUF) 프로브는 인간의 구강에 맞게 가공되었다. NanoLC-LTQ 질량 분석법에 의한 소화되지 않은 타액의 직접적인 분석은 큰 단백질과 높은 풍부한 단백질을 제거하고 낮은 풍부한 펩티드 더 감지하게 LLUF 프로브의 능력을 보여주었다.

롤리팝 - 같은 Ultrafiltration 프로브를 사용하여 인간의 원주민 타액 Peptidome를 샘플링 : 임상 질량 분광법을위한 펩타이드 감지를 단순화하고 향상

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

이 원고는 차세대 염기서열분석을 위해 DNA 단편을 정제하기 위한 자동화된 겔 크기 선택 접근법을 설명합니다. Ranger Technology는 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편 회수의 전체 프로세스를 완전히 자동화하여 고처리량 및 고품질 차세대 염기서열분석 라이브러리를 가능하게 합니다.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

메타유전체학(Metagenomics)을 사용하여 사일리지 소 사료의 마이크로바이옴을 조사했습니다. 분석은 샷건 염기서열분석(shotgun sequencing)으로 수행하였다. 이 접근법은 소 사료 내 미생물 군집의 구성을 특성화하는 데 사용되었습니다.

목초의 군 유전체학 분석

2 가지 plant organellar DNA 농축 방법의 비교 및 ​​최적화가 제시됩니다 : 전통적인 차동 원심 분리 및 메틸화 상태에 기초한 총 gDNA 분획. 우리는 결과로 나오는 DNA 양과 품질을 평가하고, 짧은 읽기 차세대 시퀀싱에서의 성능을 시연하며, 장시간 읽기 단일 분자 시퀀싱에서의 사용 가능성에 대해 논의합니다.

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

여기서 우리는 상피 세포 DNA에서 VNTR 궤적 D1S80을 증폭하여 DNA 지문 프로파일을 생성하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

실험실 클래스에서 D1S80 로커스를 사용하여 DNA 지문 응용 프로그램

여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 모기에서 고품질의 DNA 추출을 생성하기 위하여 자기 구슬을 사용하여 입니다. 이러한 추출은 다운스트림 차세대 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

이 프로토콜은 오줌 박테리아의 배양, 시퀀싱 및 드 노보 하이브리드 게놈 조립에 대한 포괄적 인 접근 방식을 자세히 설명합니다. 그것은 오줌 식민지, 병기 발생 및 항균 저항 보급에 기여하는 염색체 및 외염색체 유전 요소 둘 다 공부에 유용한 완전하고 원형 게놈 서열의 생성을 위한 재현 가능한 절차를 제공합니다.

짧고 긴 읽기 시퀀싱 기술을 사용하여 요로나박테리아의 완전한 게놈 생성을 위한 하이브리드 드 노보 게놈 조립

Mycobacterium tuberculosis의 다운스트림 표적 차세대 염기서열분석을 위해 마그네틱 비드 정제와 결합된 매트릭스 기반 추출 방법을 사용하여 오염이 제거된 객담에서 DNA를 추출하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

오염이 제거된 객담 샘플에 대한 표적 차세대 염기서열분석을 위한 매트릭스 기반 DNA 추출

학습하세요 타액에서 고품질 게놈 DNA를 추출하는 비용 효율적인 방법을. 세포 용해, RNA 및 단백질 제거, DNA 침전 및 재수화 단계를 포함하며, PCR과 차세대 시퀀싱에 적합한 고순도 DNA를 얻습니다.

차세대 시퀀싱에 대한 수집 및 타액 DNA의 추출

더 많은 동영상 탐색