Name: 갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 배우세요 인듐-주석 산화물 슬라이드에서 부착 세포의 전기천공을 이용한 갭 접합부 기능 분석법. 이 기법은 세포 간 신호 전달 및 단백질 상호작용 연구에 활용됩니다.

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전문적인 비디오 촬영 지원을 해준 Lowell Cochran에게 감사드립니다. 캐나다 보건 연구소(CIHR), 캐나다 유방암 재단(CBCF, 온타리오 지부), 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC), 캐나다 유방암 연구 연합, 온타리오 우수 센터, 유방암 액션 킹스턴 및 클레어 넬슨 유증 기금의 LR에 대한 보조금을 통한 재정 지원에 감사드립니다. SG는 NSERC 장학금을 받았습니다. MG는 미 육군 유방암 프로그램(US Army Breast Cancer Program), 온타리오주 연구혁신부(Ministry of Research and Innovation) 및 퀸즈 대학교 자문 연구 위원회(Advisory Research Committee of Queen's University)의 박사 후 연구원의 지원을 받았습니다.

1 일렉트로 챔버에서 셀 도금 <ol><li> 층류 흐름 후드에서 평소와 같이 멸균 기술을 이용하여 세포를 Trypsinize. 참고 : 그들은 유리에 세포의 확산 방해 할 수 있으므로, 원심 분리하여있는 adherens와 갭 접합 따라서 형성을 트립신의 모든 흔적을 제거하는 것이 매우 중요합니다. </li><li> 피펫 1 (37)의 출력 C 시츄 electroporator에서 (도 1), 및 장소, CO 2 인큐베이터 구비 일렉트로 멸균 챔버에 세포 현탁액의 ML. NOTE : 세포 부착은 피브로넥틴, 콜라겐, 폴리 라이신 또는 세포 및 조직 접착제 (원료 표 참조)에 도금에 의해 개선 될 수있다. </li><li> 세포가 합류 층을 형성 할 때 그들은 GJIC 시험에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2 일렉트로 절차 GJIC 검사 용 전기 천공은 층류 흐름 후드 외부에서 수행 될 수있다이 걸리기 때문에 단 몇 분. 긴 배양 시간은 특정 실험에 요구된다면, 그것은 층류 흐름 후드에서 전적으로 수행 될 수있다. 모든 경우에서, 세포는 성장 챔버는 멸균해야한다. <ol><li> 5 ㎎ / ㎖ 루시퍼 노란색 솔루션을 준비 : 2 ㎖의 칼슘이없는 성장 매체 (electroporator 제공) 10 mg을 LY 분말을 녹여. 4 O C.에서 용액 저장을 필터 멸균 긴 배양 시간을 필요로 실험 </li><li> 성장 매체를 기음과 단층을 긁거나 세포를 건조하지 않도록주의, 칼슘이없는 배지로 세포를 씻어. 세포가 건조하면 그들은 일반적으로 어두운 핵을 가지고 일렉트로없이 LY를 선택합니다. 효과는 더욱 공기 드래프트 (도 4F)에 노출되는 슬라이드의 중간에 더 현저하다. </li><li> 에펜 도르프 피펫으로, 챔버 (B)의 에지에서, 셀 (챔버 전체를 400 μL)에 염료 용액을 피펫주의 eing입니다 것은 셀 층을 만지지 않도록. </li><li> electroporator와 함께 제공되는 홀더에 실을 배치하고 적절한 강도 (토론 참조)의 펄스를 적용합니다. </li><li> 조심스럽게 LY 솔루션의 일부를 대기음. 덜 중요한 실험 번 재사용 될 수있다. </li><li> 10 % 투석 혈청을 포함하는 칼슘이없는 DMEM를 추가합니다. </li><li> 갭 정션을 통한 염료 전달​​을 허용하도록 배양기에서 3-5 분 동안 세포를 배양한다. 참고 :이 시점에서 투석 혈청의 포함은 기공 폐쇄를하는 데 도움이됩니다. </li><li> 라이브 세포 관찰을위한 칼슘이없는 DMEM으로 통합되지 않은 염료를 세척 할 것. 대안 적으로, 세포를 웰에 4 % 포름 알데히드의 첨가를 통해,이 단계에서 고정 될 수 있고, 그 다음 PBS (인산염 완충 식염수)로 세척 하였다. 모든 경우에 세척 모든 배경을 제거해야합니다. 주 : 예비 실험이 전압이 너무 낮은 경우, 최적의 조건을 결정하는 데있어서, 그것은 세포 incubato 회복하도록 할 수있다몇 분을위한 연구 및 슬라이드의 비용을 절약하기 위해 같은 슬라이드를 두 번 electroporate. </li></ol> 3 현미경 검사 <ol><li> 사용되는 염료에 대한 적절한 필터를 구비 한 반전 된 현미경을 사용하여, 형광 조명 하에서 세포를 관찰한다. 노란색 루시퍼를 들어, 여자는 423nm, 방출 555nm, 니콘 IX70 현미경에 대한 WBV 필터입니다. </li><li> 위상차 하에서 세포 형태를 조사하기 위해, 액체와 함께 상부에 충전 한 후, 잘 플라스틱 위에 유리 커버 슬립을 배치하여 메 니스 커스의 효과를 제거한다. 좋은 사진 촬영을 위해, 웰 슬라이드에서 분리 될 수 있으며, 커버 슬립은 프레임에 배치. 생균 대를 성장 배지로 채워 져야하는 동안 고정 된 세포의 경우, 웰, 현미경 관찰 용 글리세롤로 채워질 수있다. 참고 : 세포가 염료 (위의 단계 2.7)의 전송 다음 포름 알데히드로 고정하는 경우 세탁 촬영이 용이하다. 세포가있는 경우 더t는 형광 고정 세포 형광 몇 시간 동안 유지가 도입하면서 LY의 세포 유형, 전압 및 양에 따라 약 60 분 이내에 세포로부터 제거하고, 고정. 그러나, 형광 페이드 또는 고정 된 세포에서, O / N 배양 후 소산. 이러한 이유로, 사진은 일렉트로 (그림 2) 직후에주의해야합니다. </li></ol> 세포 간 통신의 4 정량 <ol><li> 형광 및 위상 대비 (그림 3)에서 20 배 목적으로 세포를 사진. </li><li> 비 electroporation하여 영역 (그림 2, 화살표, 일렉트로 에지)과 경계에 electroporation하여 세포를 확인하고 별표 표시합니다. </li><li> 염료가 갭 접합을 통해 전송 한 비 electroporation하여 측면에 형광 세포를 확인하고 점으로 표시 (그림 3a 및 3b). </li><li> 의 총 수를 나눈다에지 (도 3a 및 3b)을 따라 electroporation하여 세포의 수에 의해 비 전기 천공 영역에 세포를 형광. NOTE 적어도 200 연속 electroporation하여 경계 셀로부터의 전송을 각각의 실험에 대해 계산된다. 얻어진 숫자는 GJIC 값이다. </li></ol>

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교신저자는 Cell Projects Inc.에 라이선스가 부여된 Queen's University가 보유한 특허의 발명가입니다. 회사나 대학은 논문의 내용에 영향을 미치지 않았습니다.

프로토콜의 중요한 단계 electroporation하여 재료 전기 천공 할 물질의 순도는 매우 중요하다. 세포가 매우 평탄한 경우 추적 염료의 다음 높은 농도 (20 mg을 LY 대 / ㎖까지)와 같은 경우에 사용되어야하며, 순도가 더욱 중요 더 구형 1 세포에서보다. LY 외에 다른 염료 또는 nonpermeant 분자의 많은 종류가 상이한 connexins 이루어진 25 채널 프로브로 사용할 알렉사 염료의 시리즈로서 사용되어왔다. 핵 염료 전송 더 어렵다 (그림 4D)의 정량을 만드는 매우 강한 형광 있도록 그러나, 에티 디움 브로마이드 또는 프로피 디움 요오드 등의 염료는 DNA에 인터된다. 추적 염료 칼슘 유입 접합부 통신을 중단뿐만 아니라, CEL을 줄일 수 있으므로, 제조 및 세척 칼슘없는 성장 배지에서 수행되어야리터 생존. 모든 솔루션은 이전의 기공 폐쇄과...

셀 전류의 애플리케이션 프로세스라고 일렉트로, 세포막에 구멍을 형성시킨다. 기공이 막을 통한 분자의 nonpermeant 다양한 통로를 허용한다. 전기장이 형성된 기공은 매우 작고 휴대 생리학 방해를 최소화하여, 급속 리 클로즈되도록 정확하게 제어 할 수있다. 흥미롭게도, 부착 세포는 현탁액에 전기 천공 할 분리되지 않고, 그들이 성장 표면에 도전성 투명 인듐 - 주석 산화물 (ITO)로 코팅하고, 반응계에서 electroporation하여 유리 슬라이드 상에 성장 될 수있다. 세포는이 표면 상에 잘 성장할 수 있으며, 이들이 결합하고 확장 한, 상세한 현미경 관찰이 가능하다. 이 기술을 사용하여, 소형 분자 nonpermeant 즉시 도입하고 미리보기의 활성화에 대한 연구를 위해 적합하게이 기술을 세포의 본질적으로 100 %로 할 수있다(1 검토) 수용체의 리간드 자극 다음과 같은 경로의의 onents. 일렉트로는 DNA의 도입 (또한 electrotransfection)에 주로 사용되어왔다. 그러나 현장에서 일렉트로는 전사 인자 바인딩, 또는 siRNA를 3,5 억제하는 등의 안티센스 RNA, 이중 가닥 DNA 미끼 올리고 뉴클레오티드 등의 펩티드 2-4, 올리고 뉴클레오티드 분자의 큰 다양성의 도입을 위해 도움이 될 수 있습니다, 6, 방사성 뉴클레오티드 7-10, 단백질 11 (12) 또는 전구 약물 13. 일렉트로 후, 세포는 생화학 적 분석을 위해 용해 또는 고정 및 항체로 염색 할 수 있습니다. 셀이 전도성 코팅의 가장자리에 걸쳐 증가함에 따라 세포의 성장이,이 표면의 높이 차이에 의해 방해되지 않도록 도전성 ITO 코팅은 800-1,000Å 매우 얇다. 이 장점이 아닌 electrop을 제공합니다orated 세포는 제어 역할을하는, electroporation하여 사람과 나란히 성장시킬 수있다. 비디오에서 설명한 것과 동일한 접근은 갭 접합부, 세포 간 통신 (GJIC)의 검사를 위해 사용될 수있다. 갭 접합 인접 셀 (14)의 내부를 연결하는 채널이다. 이러한에서 Src와 같은 종양 유전자가 GJIC (15, 16)를 억제하면서 갭 접합부는, 세포 간 통신은, 종양 형성 및 전이에 중요한 역할을한다. 루시퍼 옐로우 (LY) 같은 미세 주입을 통해 배양 된 세포에 도입하거나 긁어로드 (17)와 인접 셀에 염료의 확산이 현미경 형광 조명 아래에서 관찰 등의 GJIC에게 형광 염료를 검사합니다. 그러나 이러한 기술은 변함없이 세포 손상을 야기한다. 이제 셀 (18)에 부분적으로 ITO로 코팅 된 유리 슬라이드 상에 성장되는 기법을 설명한다. 전기 펄스 LY (또는 다른 염료)의 존재 캘리포니아 도포인접 비 electroporation하여 세포에 염료 이행는 형광 현미경을 통해 관찰 조명하면서, 상기 슬라이드의 도전 부에 성장 세포로의 침투를 사용. 단일 층으로부터 분리하는 경향이있다 감수성 세포 교란을 방지하기 위해, 전극을 필요로하지 않은 설계되었다 조립체는 전류 (19)를 적용하는 셀의 상단에 배치된다. 혈청 자극 (12) 다음의 G1 단계의 길이에 대한 효과의 부재에 의해 표시된 바와 같이이 방법은 FOS의 수준 증가, 세포 대사에 어떤 검출 가능한 방해하지 않고, 다수의 셀에서 GJIC을 정량 할 수있는 능력을 구비 protooncogene 단백질 (Raptis, 미 출판) 또는 셀룰러 스트레스, P38 돼지 또는 JNK / SAPK 키나제 1과 관련이 키나아제. 종양 유전자 발현 변화와 GJ의 레벨 사이의 링크의 시험이 가능하게 접근IC (18)뿐만 아니라, 폐 종양 표본 20-23 갓 배양 된 세포를 포함하여 다양한 종류의 세포에서 GJIC시에서 Src와 STAT3의 효과. 또한, 기판에 대한 세포 부착은 그 단계에서 환원 19,24되지만, 성공적 adipocytic 분화시 갭 정션 폐쇄 시연에 이용 된 상부 전극을 결여 한 바와 셋업과 동일계에서 일렉트로.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td> <td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 칼슘</td><td>하이클론 없음 (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>기증자 송아지 혈청&nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation apparatus</td><td>Cell Projects Ltd 영국: http://www.cellprojects.com/</td> <td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-04-CC</td><td>4-wells</td></tr><tr><td></td><td>Chambers Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-08-CC</td><td>8-wells</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-25-LY</td><td>고순도</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>세포 및 조직 접착제</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation)

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

이 기술에서는 투명한 전기 전도성 물질인 ITO(Indium-Tin Oxide)로 부분적으로 코팅된 유리 슬라이드에서 세포를 배양합니다. 펩타이드 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 다양한 분자는 기본적으로 비외상 방식으로 세포의 100%에 도입될 수 있습니다. 여기에서는 세포 간 간연접 통신을 연구하는 데 어떻게 사용할 수 있는지 설명합니다. 루시퍼 옐로우는 세포가 자라고 있는 전도성 표면에 가해진 전기 펄스로 인해 세포막을 통해 기공이 형성될 때 세포로 침투합니다. 이것은 electroporation입니다. 전기천공된 영역에 바로 인접한 비전도성 유리 표면에서 자라는 세포는 전기천공에 의해 루시퍼 옐로우를 흡수하지 않지만, 전기천공된 세포에 연결하는 간극연접을 통해 전달될 때 형광 염료를 획득합니다. 세포에서 세포로 염료가 이동하는 결과는 형광 조명에서 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 간극연접 통신(gap junctional communication)을 정밀하게 정량화할 수 있습니다. 또한, 펩타이드 또는 기타 비투과성 분자의 도입에 사용할 수 있으며, 인접하고 전기가 공급되지 않은 세포에서 신호를 억제하기 위해 간극연접을 통해 작은 전기천공된 펩타이드를 전달하는 것은 신호 억제의 강력한 입증입니다.

그림 2는 고정 및 세탁 다음과 같은 형광 (패널 A와 B)에서 LY와 전기 천공 및 촬영 쥐 간 상피 T51B 셀 (22), 또는 위상차 (C) 조명을 보여줍니다. 패널에 electroporation하여 영역의 가장자리가 빨간색으로 표시됩니다. 적색 라인의 오른쪽에 형광 구배 갭 정션을 통한 전송을 나타낸다. 염료가 전송 한 셀이 도트로 표시된 상태에서, 전기 천공 영역의 에지에서 셀 스타 식별되고 표시되었다 :도 3a 및도 3b에서, 갭 접합부 통신의 정량이 도시되어있다. 비 염료 electroporation하여 경계 셀 당에 전사 셀의 평균 개수를 나타낸다. 이 예에서, 즉 57 점과 10 개, GJIC = 5.7이 있습니다. C 및 D, 전사 - (3)의 신호 변환기와 액티베이터 (STAT3)에서 T51B 셀 t에서 하향 조절되었다트랜스퍼 (22)의 ab...

이 프레젠테이션은 세포간 접합 통신 연구에 부착 배양된 세포의 전기천공법이 사용되는 방법을 보여주며, 세포는 전도성 및 투명 인듐-주석 산화물로 코팅된 슬라이드에서 성장합니다.

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

전기천공법(Electroporation)은 살아있는 세포에 전류를 가하여 세포막에 일시적인 구멍을 형성하는 기술입니다. 이러한 구멍을 통해 평소에는 세포막을 통과하지 못하는 염료 및 기타 분자들이 세포 내부로 들어갈 수 있으며, 이후 구멍은 세포에 손상을 주지 않고 빠르게 다시 닫힙니다. 본 영상에서는 전기 전도성 투명 물질이 부분적으로 코팅된 슬라이드 위에서 성장 중인 부착 세포를 전기천공하는 방법을 설명하겠습니다.재료는 인듐 주석 산화물로, 전기 전류를 전도함으로써 염료가 세포 내로 들어올 수 있도록 기공을 엽니다. 그러면 세포에 간극 연접이 있는지 없는지, 그리고 인접한 세포들의 내부를 연결하여 작은 분자들의 통과를 가능하게 하는 작은 통로인 간극 연접이 얼마나 되는지 조사할 수 있습니다. 간극 연접 통신은 종양성 변환 및 전이를 포함하여 세포 내에서 다양하고 중요한 기능을 한다는 사실이 오래전부터 알려져 왔습니다.Insitu를 사용하여 부착 세포 전기천공술(electroporation)을 수행하는 방법에 대한 세포 프로젝트 발표에 오신 것을 환영합니다. 이 이미지는 투명 전도성 유리 위에서 배양된 세포에 형광 염료 Lucifer Yellow가 도입된 모습을 보여줍니다. 위쪽의 선까지가 위상차 현미경 하에서 더 쉽게 관찰되는 영역입니다.결과물입니다. 전기천공법으로 염색약을 주입한 왼쪽 세포들로부터 간극연접을 통해 염색약이 오른쪽 세포들로 확산된 것을 확인할 수 있습니다. 이로 인해 형광의 기울기가 나타나며, 세포들은 트립신 처리되었습니다.초기화한 후 원심분리용 튜브로 옮깁니다. 세포가 챔버 내에서 성장할 때 고르게 퍼지는 것이 매우 중요합니다. 이러한 이유로, 원심분리를 통해 트립신 잔여물을 완전히 제거하는 것이 가장 좋습니다.트립신이 포함된 배지를 흡입하여 제거하고, 세포를 약 1 mL의 성장 배지에 재현탁한 후 챔버에 분주합니다. 피펫에 세포 현탁액이 담겨 있으면, 챔버의 뚜껑을 열고 세포를 챔버 내로 한 방울씩 천천히 피펫팅하여 운반이 용이하도록 합니다. 이후 챔버를 6 cm 페트리 접시에 넣습니다.세포를 배양하기 위해 챔버를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 플레이팅된 세포들은 잘 퍼져 성장하며, 서로 접촉하여 간극 결합(gap junction)을 형성하게 됩니다. 세포가 전기적 자극을 받을 준비가 되면, in situ 펄스 발생기를 원하는 조건으로 설정하십시오.간편 설정 과정에 대한 설명은 매뉴얼을 참조하십시오. insitu의 전압이 설정되면 키패드의 빨간색 표시등이 켜집니다. 워터배스에서 가온된 칼슘 제거 DMEM 병 두 개를 꺼내십시오. 하나는 투석 혈청이 포함된 칼슘 제거 DMEM이며, 다른 하나는 일반 DMEM입니다.칼슘이 없는 상태에서, 노란색 팁을 피펫에 장착하여 준비합니다. 신호 대신, 인큐베이터에서 세포를 꺼냅니다. 먼저 세척 비커에 뒤집어 배지를 제거합니다.그 후 칼슘이 없는 DMEM으로 조직을 한 번 세척하며 닦아내되, 세포가 건조해질 수 있으므로 DMEM을 완전히 제거하려고 하지 마십시오. 세포가 흐트러지지 않도록 주의하면서, 동시에 세포가 건조해지지 않도록 신속하게 배리어(Barrier) 위에 Lucifer yellow를 첨가하십시오. 챔버의 각 절반당 200 µL를 사용하십시오.insitu 챔버의 덮개를 덮은 다음 슬라이더에 장착합니다. 슬라이더를 밀어 챔버의 끝 탭이 슬라이더의 슬롯에 정확히 맞물렸는지 확인하십시오. 챔버를 챔버 홀더에 삽입합니다.펄스 발생기 키패드의 펄스 버튼을 누릅니다. 전기천공 과정 동안 펄스 발생기와 챔버 홀더의 LED가 빨간색으로 깜빡이며, 초기 사이클이 완료되면 초록색으로 깜빡입니다. 챔버 홀더 아래로 슬라이더를 다시 당겨 챔버를 제거합니다.Lucifer yellow의 대부분을 흡입하여 재사용하되, 세포가 건조되지 않도록 주의하십시오. 칼슘이 없는 DMEM을 첨가합니다. 투석된 혈청(dialyzed serum)을 사용하면, 혈청이 기공을 닫는 데 도움을 주어 챔버가 다시 인큐베이터로 들어가 gap junction을 통한 Lucifer yellow의 이동이 일어나게 됩니다.실험 간에 타이밍이 일관되어야 합니다. 표준 시간은 3분입니다. 배지를 폐기 비커에 따라 버리십시오.페이스트나 피펫을 사용하여 4% formaldehyde 고정액을 첨가하고, 실온에서 최소 2분 동안 기다립니다. formaldehyde를 따라내고 PBS로 두어 번 헹굽니다. 세포가 유리에 고정되어 있으므로 세척 중에 세포가 떨어져 나갈 위험은 거의 없습니다.위상차 현미경으로 세포를 관찰하려면 챔버 위에 커버 슬립을 덮는 것이 중요합니다. 챔버에 PBS를 채워 볼록한 메니스커스를 형성합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 커버 슬립을 덮습니다.PBS가 넘치더라도 걱정하지 마십시오. 넘친 PBS는 티슈로 흡수하면 됩니다. 도립 형광 현미경이 필요하며, 위상차 기능과 Lucifer yellow용 필터 블록이 있는 것이 좋습니다. 위상차 모드에서 전기천공된 영역의 경계를 찾으십시오.형광 세포 아래로 두 개의 선이 보일 것입니다. 슬라이드의 절반은 강하게 형광을 띨 것입니다. 빛나는 세포와 가장 가까운 선이 전기천공된 영역의 경계입니다.그 이상의 모든 형광은 갭 결합(gap junctions)을 통한 루시퍼 옐로우(lucifer yellow)의 이동으로 인한 것입니다. 예를 들어, 이 상피세포 이미지의 왼쪽 부분은 전기천공법이 적용된 세포들이 주변의 전기천공되지 않은 세포로 루시퍼 옐로우를 전달하여, 전도성 코팅 가장자리부터 오른쪽 방향으로 빛나는 세포들의 구배가 형성된 모습을 보여줍니다. 이 이미지는 위상차 현미경으로 관찰한 동일한 세포 영역을 보여줍니다.X 선이 매우 뚜렷하게 보임을 확인할 수 있습니다. 갭 결합 전달(gap junctional transfer)이 얼마나 일어났는지에 대한 정량적 측정은 전기천공된 세포의 형광 및 위상차 이미지를 통해 수동으로 수행할 수 있습니다. 전도성 영역의 가장자리를 따라 표시된 별표는 공여 세포로 간주됩니다.이들은 전기천공법으로 도입되어 노란색 형광 물질을 섭취하였습니다. 이들은 오른쪽에 있는 이웃 세포들에 노란색 luc를 전달하며, 이는 다시 다음 세포로 전달됩니다. 이 과정은 점차 양이 줄어들면서 더 멀리 진행됩니다.이 경우 점과 별의 비율인 41 대 8을 통해 간극 결합 전이가 얼마나 광범위하게 일어났는지를 비교하는 수치를 산출할 수 있습니다. 이때 간극 결합 지수는 5.1입니다. 세포를 수동으로 표시하고 세는 방법 대신, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 전기천공된 세포 경계의 비전기천공 측에서 발생하는 형광의 상대적 양을 측정하는 대안적인 방법을 사용할 수 있습니다.이 세포들은 간극연접(gap junction)을 가지고 있지 않습니다. 여기는 전기천공된 영역의 오른쪽 가장자리입니다. 형광의 구배(gradient)가 나타나지 않는데, 이는 위상차 현미경 관찰 시 간극연접이 없음을 나타냅니다.모든 세포가 명확하게 보입니다. 이 예시에서 X 선 또한 명확하게 보임을 확인하십시오.챔버 내의 모든 세포를 표피성장인자 EGF로 자극하였으며, 10분 후 고정하여 phospho arc를 탐지하였습니다. 오른쪽에 염색된 세포들은 전기천공법을 처리하지 않은 세포들이며, 이 선까지의 왼쪽 세포들은 전기천공법이 처리된 세포들임에 유의하십시오. 전기천공법을 처리하지 않은 세포들은 phospho irk 항체와 면역과산화효소에 의해 갈색으로 염색되어 나타납니다.전기천공된 세포들은 전기천공된 인산화 펩타이드가 Grb2의 SH2 도메인을 차단하여 EGF의 IRK 인산화를 억제했기 때문에 염색되지 않은 상태를 보입니다. 선의 오른쪽에 위치하며 아직 전기천공되지 않았음에도 불구하고 염색되지 않은 3~4개 세포 길이의 영역에 주목하십시오. 이들은 갭 결합(gap junction)을 통해 전기천공된 인접 세포로부터 차단 펩타이드를 전달받은 세포들입니다.이는 신호 억제가 반드시 펩타이드에 의한 것이며 전기천공법의 아티팩트일 수 없음을 보여주는 가장 강력한 증거입니다. 이 세포들은 전기천공법을 거치지 않았으므로, 이는 위상차 현미경으로 관찰한 것과 동일한 프레임입니다. 전기천공법 이후에도 형태학적 변화가 전혀 없음에 유의하십시오.일부 환자의 경우, 다양한 배양 세포에서 간극 결합 통신(gap junctional communication)을 정밀하게 정량화할 수 있습니다. 특정 신호 전달 경로를 차단하기 위해 펩타이드를 도입하는 것은 정제된 단백질을 통해 확인된 단백질 및 단백질 간 상호작용이 살아있는 세포 내에서 갖는 관련성을 평가하는 강력한 방법입니다. 이는 펩타이드 기반 약물 개발의 첫 번째 중요한 단계가 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

고효율을위한 신뢰할 수있는...

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하고 몇 가지 유용한 팁을 제공하는 방법을 여기에 대해 설명합니다. 우리는이 논문으로 인해 기능 갭 접합에 세포 결합의 정도를 평가하기 위해 모두 도움이 될 것으로 기대하고있다. 여기에 설명 된 모든 1,000 달톤 이하의 분자량을 가진 다른 형광 염료에 적응 원칙적으로 될 수있다.

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

이 프로토콜은 전기 세포 기판 임피던스 감지, 세포 부착, 증식, 운동성 및 약리 및 독성 자극에 대한 세포 반응의 정량화에 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 기록하고 분석 할 수있는 방법을 검토합니다. 내피 세포의 투과성과 세포 - 세포 및 세포 - 기질 연락처 평가의 검출이 강조된다.

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

이 프로토콜은 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 기술에 대해 설명합니다. 갭 접합부 간 통신은 조직의 항상성을 유지하고이 세포 신호의 중단은 건강에 악영향을 갖고있는 중요한 세포 과정이다.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

여기, 우리 소설 간격 접속점 세포 통신 분석 결과 갭 정션 변조 화학 약물 발견 및 독성 평가의 높은 처리량 검열에 대 한 설계에 대 한 프로토콜을 제시.

요오드 화물-노랑 형광 단백질-간격 접속점 세포 통신 분석 결과

장 상피는 영양 흡수뿐만 아니라 유해 물질에 대한 보호를 제공합니다. 정점-대부분의 상피 세포간 접합, 즉 타이트한 접합은 부세포 용질 및 이온 투과성을 조절한다. 여기에서, 점막 시트의 제조 및 어싱 챔버 기술을 사용하여 타이트한 접합부의 이온 선택성의 평가를 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

챔버 기술을 사용하여 기본 조직의 장 타이트 접합 장벽 및 이온 투과성의 기능 평가

여기서 우리는 Xenopus 난모세포에서 갭 접합 단백질을 발현하고 하이 사이드 전류 측정 모드에서 이중 난모세포 전압 클램프 기록을 위해 설계된 상용 증폭기를 사용하여 두 개의 apposed 난모세포 사이의 접합 전류를 기록하는 프로토콜을 제시합니다.

제노푸스 난모세포로부터의 갭 접합 전류 기록

다공성 기판 전기천공법(PSEP)은 높은 세포 생존율과 일관되고 높은 처리량 전달을 결합합니다. 경상피 전기 임피던스(TEEI) 측정의 도입은 PSEP의 중간 프로세스에 대한 통찰력을 제공하고 무표지 전달을 가능하게 합니다. 이 기사에서는 PSEP 전달 실험과 TEEI 측정 분석을 동시에 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

Transepithelial Electrical Impedance Monitoring을 사용한 다공성 기판 기반 전기천공법

배우세요 인듐-주석 산화물 슬라이드에서 부착 세포의 전기천공을 이용한 갭 접합부 기능 분석법. 이 기법은 세포 간 신호 전달 및 단백질 상호작용 연구에 활용됩니다.

갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation)

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