갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation)

전기천공법(Electroporation)은 세포막의 일시적인 기공을 열기 위해 살아있는 세포에 전류를 가하는 기술입니다. 이러한 기공을 통해 일반적으로 세포막을 통과하지 않는 염료 및 기타 분자가 세포로 들어갈 수 있으며 세포는 손상되지 않고 기공이 빠르게 닫힙니다. 우리는 접착 세포가 전기 전도성 및 투명 물질로 부분적으로 코팅된 슬라이드에서 성장할 때 전기천공될 수 있는 방법을 설명할 것입니다.

이 물질은 인듐 주석 산화물이며 전류를 전도하면서 염료가 세포에 들어갈 수 있도록 기공을 엽니다. 그런 다음 세포에 간극연접이 있는지 여부, 그리고 얼마나 많은 간극연접이 이웃 세포의 내부를 연결하고 작은 분자의 통과를 허용하는 작은 채널인지 조사할 수 있습니다. 간극연접 통신(gap junctional communication)은 세포에서 종양성 변형(neoplastic transformation)과 전이(metastasis)를 포함한 다양한 중요한 기능을 한다는 것은 오래 전부터 인식되어 왔습니다.

Insitu를 사용하여 부착 세포 전기천공법을 수행하는 방법에 대한 이 세포 프로젝트 프레젠테이션에 오신 것을 환영합니다. 이 이미지는 우리가 할 수 있는 것을 보여주는데, 노란색으로 대체되는 형광 염료가 투명한 전도성 유리에서 자라는 세포에 주입되었습니다. 이 선까지는 위상차 아래에서 선을 더 쉽게 볼 수 있습니다.

여기 있다. 염료가 왼쪽의 세포에서 간극연접을 통해 확산된 것을 볼 수 있으며, 이 세포는 전기천공법에 의해 염료가 적재되어 오른쪽 세포로 유입됩니다. 이 Gradient of fluorescence cells의 결과는 트립입니다.

Inized는 그 후에 분리기에 있는 관으로 옮겨졌습니다. 세포가 챔버에서 성장함에 따라 잘 퍼지는 것이 매우 중요합니다. 이러한 이유로 세포를 원심 분리하여 트립신의 흔적을 제거하는 것이 가장 좋습니다.

미량의 트립신이 있는 배지는 세포에서 흡입되고 약 1ml의 성장 배지에 재현탁된 다음 챔버에서 도금됩니다. 피펫에는 세포 현탁액이 들어 있으며, 챔버에서 뚜껑을 제거하고 세포를 챔버에 적방울로 피펫팅하여 휴대가 더 쉬워집니다. 챔버는 6cm 페트리 접시에 배치됩니다.

챔버는 세포가 성장할 수 있도록 인큐베이터로 돌아갑니다. 도금된 셀은 잘 퍼지고 서로 닿아 갭 접합을 형성하기 위해 성장합니다. 셀이 전기 퍼레이드를 할 준비가 되면 인튜 펄스 발생기를 원하는 조건으로 설정합니다.

간단한 설정 과정에 대한 설명은 설명서를 참조하십시오. 볼륨이tag장치의 e가 설정되면 키패드의 빨간색 표시등이 켜집니다. 칼슘이 없는 DMEM의 데운 두 병을 수조에서 꺼내 하나는 칼슘이 없지만 투석 혈청이 있는 DMEM이고 다른 하나는 DMEM입니다.

칼슘이 없으면 피펫이 피펫터에 노란색을 더 느슨하게 적재할 수 있도록 준비하십시오. 한숨을 쉬는 대신 인큐베이터에서 세포를 꺼냅니다. 처음에는 세척 비커에서 매체를 뒤집어 제거합니다.

그런 다음 칼슘이 없는 DMEM으로 한 번 조직 세척에 두드려 세포가 건조할 수 있으므로 DMEM을 완전히 제거하려고 하지 마십시오. 세포를 방해하지 않도록 조심스럽게 배리어에 Lucifer yellow를 첨가하되 세포가 건조되지 않도록 충분히 빨리 첨가하십시오. 챔버의 각 절반에 200마이크로리터를 사용합니다.

인시투 챔버에 뚜껑을 덮고 슬라이더에 넣습니다. 슬라이더를 밀어 챔버의 끝 탭이 슬라이더의 슬롯에 맞는지 확인합니다. 챔버 홀더에 챔버를 삽입합니다.

펄스 발생기 키패드의 펄스 버튼을 누릅니다. 펄스 발생기와 챔버 홀더의 LED는 전기천공 과정에서 빨간색으로 깜박인 다음 녹색으로 깜박여 init 주기가 완료되었음을 나타냅니다. 슬라이더를 챔버 홀더 아래로 다시 당겨 챔버를 제거합니다.

대부분의 Lucifer yellow를 흡인하여 다시 사용하되 세포를 건조시키지 않도록 주의하십시오. 칼슘 없이 DMEM을 첨가하십시오. 투석 된 혈청을 사용하면 혈청은 다공성이 챔버를 닫는 데 도움이되며 인큐베이터로 다시 들어가 갭 접합을 통해 루시퍼 옐로우가 발생합니다.

타이밍은 실험마다 일관되어야 합니다. 표준은 3분입니다. 매체를 폐기물 비커에 붓습니다.

페이스트 또는 피펫으로 4% 포름알데히드 고정 용액을 넣고 실온에서 최소 2분 동안 기다립니다. 포름알데히드를 붓고 두어 번 헹굽니다. PBS를 사용하면 세포가 유리에 고정되므로 세척 중에 세포가 분리될 위험이 거의 없습니다.

위상차 하에서 셀을 볼 수 있으려면 챔버 상단에 커버 슬립을 배치하는 것이 중요합니다. PBS로 챔버를 채우고 자랑스러운 반월판을 형성합니다. 기포를 피하고 커버 슬립을 놓으십시오.

PBS가 넘쳐도 걱정하지 마십시오 여분의 PBS를 조직에 흡수하기만 하면 됩니다. 도립 형광 현미경이 필요하며, 위상차가 있는 현미경과 Lucifer yellow용 필터 블록이 있는 것이 좋습니다. 위상 대비에서 전기공공 영역의 가장자리를 찾습니다.

형광 세포 아래에 두 개의 줄이 표시됩니다. 슬라이드의 절반에서 강렬하게 형광을 발합니다. 빛나는 셀에 가장 가까운 선은 전기천공된 영역의 가장자리입니다.

그 이상의 모든 형광은 간극연접을 통한 루서 옐로우의 전달로 인한 것입니다. 예를 들어, 이 상피 세포 이미지는 이미지의 왼쪽에 전기화된 세포를 보여주며, 루시퍼 옐로우를 인접한 전기화되지 않은 세포로 전달하여 전도성 코팅의 가장자리에서 오른쪽으로 빛나는 세포의 구배를 생성합니다. 이 이미지는 위상 대비를 받는 동일한 세포 프레임을 보여줍니다.

X 선을 매우 명확하게 볼 수 있습니다. 얼마나 많은 간극 접합 전달이 발생했는지에 대한 정량적 측정은 전기천공된 세포의 형광 및 위상차 이미지로 작업하여 수동으로 수행할 수 있습니다. 전도성 영역의 가장자리를 따라 있는 별은 기증자 세포로 간주됩니다.

그들은 전기천공되어 노란색으로 느슨해졌습니다. 그들은 노란색에 대한 luc를 오른쪽에 있는 이웃 세포에 전달하고, 이 세포는 그것을 전달합니다. 더 나아가 그 양이 줄어들고 있다.

이 경우 별 41 대 8에 대한 점의 비율은 이 경우 간극연접 전달이 얼마나 광범위한지 비교하기 위한 숫자를 생성할 수 있습니다.5.1은 간극연접 지수입니다. 세포를 수동으로 표시하고 계수하는 대신 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 전기천공된 세포 경계의 비선출 측면을 따라 발광의 상대적인 양을 측정하는 것입니다.

이러한 셀에는 간극연접이 없습니다. 다음은 전기 천공 영역의 오른쪽 가장자리입니다. 참고로, 형광의 구배(gradient of fluorescence)는 없으며, 이는 위상차 하에서 간극연접(gap junctions)이 없음을 나타냅니다.

모든 세포를 명확하게 볼 수 있습니다. X 선도 명확하게 보입니다. 이 예에서는 다음과 같습니다.

챔버 내의 모든 세포를 표피 성장 인자 EGF로 자극하고, 10분 후에 phospho arc를 고정하고 프로브했습니다. 오른쪽의 염색된 세포는 전기천공이 되지 않았고 이 라인까지의 왼쪽에 있는 세포는 전기천공이 이루어졌습니다. 전기천공되지 않은 세포는 phospho irk 항체와 면역페록시다아제에 의해 갈색으로 염색됩니다.

전기천공된 포스포 펩타이드가 그랩 2의 SSH 2 영역을 차단하고 EGF의 irk 인산화를 억제했기 때문에 전기천공된 세포는 염색을 나타내지 않습니다. 세포가 전기가 아닌 선의 오른쪽에 있는 3-4개의 세포 길이 영역은 아직 염색을 나타내지 않습니다. 이들은 갭 연접을 통해 전기로 천공된 이웃으로부터 차단 펩타이드를 획득한 세포입니다.

이것은 신호의 금지가 펩티드 때문이어야 하고 전기천공법의 인공물일 수 없다는 것을 가능한 가장 강력한 논증입니다. 이러한 셀은 전기천공되지 않기 때문에 위상차 아래에 표시된 것과 동일한 프레임입니다. 전기천공법 후 형태학에 변화가 없다는 점에 유의하십시오.

일부 환자의 경우 간극 연접 커뮤니케이션은 다양한 배양 세포에서 정확하게 정량적일 수 있습니다. 특정 신호 전달 경로를 차단하기 위한 펩타이드의 도입은 정제된 단백질로 확인된 단백질의 살아있는 세포, 단백질 상호 작용의 관련성을 평가하는 강력한 접근 방식입니다. 이것은 펩티드 돔 약물 개발의 첫 번째 중요한 단계가 될 수 있습니다.