Name: Trypanosomes에서 RNA 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 RNA 촉매 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 Trypanosoma brucei에서 RNA 편집을 검출하는 FRET 기반 형광 분석법을 통해 고처리량 화합물 스크리닝을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 에디토솜 억제제를 신속하게 식별하여 기생충 RNA 편집 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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Najmeh Nikpour와 Fiona Alum이 이 원고를 제안하고 편집했습니다. McGill University의 생화학과는 화학 생물학의 CIHR 교육 이니셔티브를 통해 HM 및 VM을 지원했습니다. 이 작업은 캐나다 보건 연구소(CIHR) 보조금 119464(R. S.에게)의 지원을 받았습니다.

아래 프로토콜은 형광 계 RNA 편집 분석을 수행하기위한 절차를 설명한다. 분석은 단일 PCR 튜브, 실험의 범위에 따라 96 - 웰 또는 384 - 웰 플레이트에서 수행 될 수있다. 이어서 형광 신호는 적합한 실시간 PCR 검출 시스템에서 판독 될 수있다. 여기서 분석은 384 - 웰 플레이트의 맥락에서 설명된다. 1. 배양 T. brucei 세포 <ol><li> T.위한 성장 배지를 준비 brucei 형태의 세포를 procyclic. 매체의 1 L의 경우 : <ol><li> 800 ㎖의 miliQ 물에 25.4 g SDM-79 분말을 용해. </li><li> 10 M NaOH로 7.3 2 탄산 수소 나트륨의 g의 산도를 추가합니다. </li><li> 900 ㎖, 소독 필터의 최종 볼륨에 nanopure 물을 추가합니다. </li><li> 10 %의 최종 농도에 태아 혈청 (FBS), 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션 헤민 (2.5 ㎎ / ㎖)를 추가 (V / V), 100 U / ㎖ 및 7.5 ㎎ / L이었다. </li></ol></li><li> T. &lt;300 ㎖를 성장EM&gt; 1.5 × 10 7 세포 / ml의 밀도로 70 rpm으로 흔들어 28 ° C에서 brucei의 1.7A 야생형 (procyclic 양식) 세포. 참고 :이과 활성 editosome 3 ㎖를 생산해야 ~ 600 편집 반응에 대한 충분한 총 단백질, 0.5 MG. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확 </li><li> 냉장 PBSG 버퍼 50 ㎖ (10 mM의 나 2 HPO 4, 10 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 145 mM의 NaCl을, 6 mM의 포도당)와 펠렛을 씻어 10 분에서 10,000 XG에서 원심 분리하여 다시 세포를 스핀 다운 4 ° C. </li></ol> 원유 미토콘드리아의 2. 격리 참고 : 모든 단계를 editosome 활동을 유지하기 위해 얼음 또는 4 ° C에서 수행해야합니다. <ol><li> DTE 완충액 30 ㎖ (1 mM 트리스 - 염산 pH를 8.0 및 1 mM의 EDTA)에서 수확 한 세포를 재현 탁. 위로 쓰다듬​​어 아래로 얼음에 10 배 이상으로 세포막을 방해하는 40 ㎖ 멸균 다운스 호모 게 나이저 (사전 냉장)를 사용합니다. </리&gt; <li> 우선적으로 미토콘드리아를 가지고, 4 ° C에서 10 분 동안 15,800 XG에 0.25 M. 원심 분리기의 최종 농도에 균질로, 즉시 4.3 ml의 60 % 자당 (즉, 1.75 M W / V)를 추가합니다. </li><li> STM 버퍼 (20 MM 트리스 - 염산 산도 8.0, 250 MM의 자당과 2 mM의 MgCl2를) 4.6 ㎖에 미토콘드리아 펠렛을 Resuspend. I 각각 0.3 ㎜, 9 U / ㎖의 최종 농도 0.1 M 염화칼슘의 13.8 μL 및 RNA 분해 효소가없는 DNA 분해 효소의 4 μl를 추가합니다. 얼음에 1 시간 동안 혼합물을 품어. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 15,800 XG에서 DNA 분해 효소 I. 원심 분리기를 불 활성화 STE 버퍼의 4.6 ML (20 MM 트리스 - 염산 산도 8.0, 250 MM의 자당과 2 mM의 EDTA)를 추가 </li><li> 400 용해 버퍼의 μL (10 MM 트리스 - 염산의 pH 7.2, 10 mM의 MgCl2를, 100 ㎜의 KCl, 1 ㎍ / ㎖의 펩 스타틴, 1 mM의 DTT 및 1X 완전한 EDTA없는 단백질 분해 효소 억제제) 및로 전송에서 펠렛을 재현 탁 의 미세 관. </li><li> 1 %의 최종 농도를 10 % 트리톤 X-100을 추가차 튜브 회전에서 4 ° C에서 15 분 동안 해물을 품어. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에 두 번 원심 분리하여 미토콘드리아 해물을 취소; 취소 뜨는 때마다 유지. </li></ol> 3. Editosome 정화 <ol><li> 부어 10 ㎖의 10 % -30 % (40 mM의 HEPES 산도 7.9, 20 밀리미터 밀리그램 (OAC) 2, 100 mM의 KCl을 2 배 HHE 그라데이션 버퍼를 사용하여 초 원심 분리기 튜브 (V / V) 선형 글리세롤 그라데이션 (표 1), 및 2 mM의 EDTA) 및 설명서를 다음으로 그라데이션 메이커. </li><li> 조심스럽게 글리세롤 그라데이션의 상단에서 솔루션 500 μl를 제거하고 부드럽게 지워 미토콘드리아 용해 액 500 μl를로드합니다. 초 원심 분리기를 사용하여 4 ° C에서 6 시간 동안 178,000 XG에 스핀. </li><li> 4 ° C에서 그라데이션의 위에서 아래로 순차적으로 500 μL의 분수를 수집 그런 다음 사용 때까지 -80 ° C에서 액체 질소와 저장소를 사용하여 분수를 동결 스냅. </li></ol><ol><li> 3 분 90 ° C에서 가열하여 1:1의 몰비 T7 프로모터 올리고 뉴클레오타이드 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;)와 T7 프로모터 서열 (표 2)에 상보 시퀀스를 포함하고, 실온에서 냉각 각각의 DNA 템플릿을 어닐링 적어도 10 분. </li><li> 사용 설명서에 따라 시험 관내 전사 키트를 사용하여 RNA를 고쳐 쓰다. </li><li> 7 M 요소 염료 (7 M 요소, 0.05 % 크실렌 Cynol, 0.05 % 브로 모 페놀 블루)의 동일한 볼륨을 추가하여 전사 반응을 중지합니다. 9 %는 폴리 아크릴 아마이드 겔 (9 % 아크릴 아미드, 7 M 요소, 1X TBE)을 변성 살균 필터를 실행합니다. </li><li> 찾을 수있는 단파 UV 램프와 소비세 각각의 RNA와 자외선 (UV) 그림자를 사용합니다. 미세 원심 분리 튜브에 절개 된 젤 조각을 놓고 겔 용출 버퍼 400 μL (20 MM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 250 ㎜의 NaOAc, 1 ㎜ EDTA 0.25 % SDS)를 추가합니다. 튜브 회전기에 RT에서 밤새 용리. </li><li> 프리 시즌차가운 100 % 에탄올 1 ㎖를 추가하고 30 분 또는 -20 ° C 하룻밤 -80 ° C에서 하나를 배양하여 용출 RNA를 pitate. </li><li> RNA를 펠렛 4 ° C에서 30 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 75 %의 에탄올 1 ㎖로 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 </li><li> 표 2에 나타낸 바와 같이, 원하는 농도를 달성하기의 RNase없는 물에 적절히 RNA 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 5. 형광 기반의 RNA 편집 분석 <ol><li> 하나의 반응,, 미세 원심 분리 튜브에 preA6Rbz 1 pmol의 (1 μL) 2.5 pmol의 gA6Rbz (1 μL) (1:2.5 몰비)를 결합하여 3 분 동안 70 º C에서 배양 해에 대한 RT에 앉아 보자 적어도 10 분. </li><li> 한편 (25 mM의 HEPES pH가 7.9, 10 mM의 밀리그램 (OAC) 2, 50 mM의 KCl을 10 mM의 EDTA), 1 mM의 1X HHE 버퍼를 포함하는 편집 반응, preA6Rbz 및 gA6Rbz 않고, 표 3을 이용하여 마스터 믹스를 준비ATP, 5 MM의 염화칼슘, Torula 효모 RNA, 0.1 % 트리톤 X-100, 및 정제 editosome 16 NG / μL. </li><li> 마스터 믹스를 완료하기 위해 단련 preA6Rbz 및 gA6Rbz를 추가합니다. </li><li> RNase가없는 물 2 μL (무 화합물과 우물) 또는 200 μM의 화합물의 2 μL 하나를 포함하는 우물에 마스터 믹스 (표 3)의 18 μl를 분배하고 그림 5에 따라 플레이트 제어 샘플이 (가) 있습니다. </li><li> 접시 실러와 플레이트를 밀봉하고 공기 방울을 제거하기 위해, 아래 판을 회전. 4 시간 동안 28 ℃에서 배양한다. </li><li> 물론 각 gA6Rbz 경쟁의 25 pmol의 (2 μL)를 추가합니다. 아래 판을 회전 및 실시간 PCR 기계에 배치, 신선한 봉인을 놓습니다. 다음과 같은 실험을 프로그램 : 1 단계 : 5 분 동안 85 ° C; 2 단계 : 10 분 동안 24 ° C; 3 단계 : 중지합니다. </li><li> 23 μL의 최종 볼륨에 각 웰에 FRET 기판의 15 pmol의 (1 μL)를 추가합니다. 신선한 실러와 플레이트를 밀봉.신속하게 판을 회전 및 실시간 PCR 시스템에 다시 배치합니다. </li><li> 다음 단계로 새로운 실험을 프로그램 : 1 단계 : 1 분 37 ° C; 2 단계 : 읽기; 3 단계 : 1, 40 번 단계로 이동합니다; 4 단계 : 중지합니다. </li><li> 독서를 필요로 FAM 필터를 선택하는 모든 우물을 선택하여 설치 판을. 23 μL 및 실행을 시작으로 입력 볼륨. </li><li> 분석 용 막대 그래프에 슬로프를 플로팅하여 운동 측정을 얻기 위해 각 웰 / 샘플에서 얻은 값의 기울기를 계산한다. NOTE : 운동 판독은 시료와 배경 사이의 신호 대 잡음비를 향상시킨다; 배경 샘플은 제로에 가까운 경사를하는 것처럼. 엔드 포인트 독서는 높은 배경 잡음이 있습니다. </li></ol>

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Trypanosomes의 RNA 편집 복잡한에 대한 억제제를 식별하는 새로운 높은 처리량 검사 방법은 trypanosomatids으로 인한 질병에 대응하기 위해 약물 발견을위한 새로운 도구를 제공하고, 제시했다. FRET 기반 리보 자임 분석은 광범위하게 다양한 용도 20-22에 사용되었다; 그러나, 우리는 RNA 편집 활동 (19)의 생체 모니터링을위한 FRET 기반 리보 자임의 분석의 능력을 활용했다. 이 분석은 잠재적으로 포유 동물 (23)의 핵 RNA를 인코딩의 뉴클레오티드 치환 편집과 같은 진핵 생물의 RNA 편집의 다른 유형에 적응 될 수있다. 이 분석의 참신 자체 FRET 기반 리보 자임의 분석을 확립 아니라, editosome에 대한 화학 물질의 높은 처리량 검사에 대한 의무가 RNA 편집 분석에이 기술을 통합하는 방법을 개발. 리보 자임 분석 기반의 방법은 다른 화면과 엉덩이에 비해 몇...

RNA 편집, mRNA의 전사 후 개질 공정은, 제 1 trypanosomatids에서 발견되었다. 그 이후로, 실질적인 작업은 Trypanosoma brucei 2,3에서 RNA 편집의 뒤에 기계를 연구 실시하고있다. 일련의 효소 반응에서 editosome 약 20 단백질의 코어 복합체는, 에너지 발생 산화 적 인산화 시스템의 여러 구성 요소를위한 성숙한 미토콘드리아의 mRNA를 생성한다. 촉매 이벤트의 순서는 가이드 RNA를 (gRNAs)에 의해 결정으로, endonucleolytic 분열, 우리 딜 (U) 추가 또는 삭제, 결찰입니다 4. 코어 editosome 복잡한 단백질 외에도 소품 요인도 5-7을 확인되었다. 이 단백질은 주로 독립적 인 단지로 분류 볼 수 있습니다. 그러나, 코어 editosome 복잡 단백질 어셈블리의 순서와 소품과 코어 복합체의 상호 작용 패턴착물은 아직 결정되지하다. trypanosomatids에서 RNA 편집 과정을 대상으로하는 화학 dissectors를 제공 할 수 있다는 editosome 복합체의 조립 및 기능을 공부에 도움. 또한, 여러 editosome 단백질의 기능 연구는 약 8 ~ 12을 대상으로 자신의 잠재력을 나타내는 다른 생활 단계에 걸쳐 요점을 보여 주었다. 따라서 editosome의 발견 억제제도 trypanosomatids 대하여 리드 화합물로서 작용할 수있다. trypanosomatid으로 인한 질병에 대한 현재 사용 가능한 약물, 독성이 비효율적이고 비용이 13, 14로이시의 적절하다. 효율적이고 편리한 시험 관내 분석은 RNA 편집을 차단 특정 억제제 화학 우주를 탐구 할 필요가있다. 세 가지 분석법이 개발 editosome 활동을 모니터링하는 데 사용되었다 : 시험 관내 RNA 편집 세이 15 (a) 전체 라운드, (b) 시험 관내 RNA 편집 분석 16,17에 미리 절단ND (C) 망치 리보 자임 (HHR) 분석 18 기반. 처음 두 개의 분석 실험은 방사능의 도움으로 편집 된 제품 (ATPase의 6의 mRNA)의 직접 시각화에 의존하고 있습니다. HHR 기반 분석은 편집시 리보 자임로 동작하는 모델로 ATPase의 6의 mRNA의 수정 된 버전을 사용합니다. 기능 리보 자임은 특히 기자로서, 방사성 동위 원소 표지 된 RNA 기판을 절단한다. 최근 Moshiri는 외. 개발 &#39;혼합 측정&#39;방사성 표지 된 RNA 기판은 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 기판 (19)으로 교체되는 경우 RNA 편집을 모니터하기 위해 시험 관내 리포터 분석에서 HHR 기반한다. 이 분석의 원리 장점이 있습니다 : (A)는 활성 리보 자임 및 기판 절단의 생산이 낮은 볼륨 (즉, 20 μL)에서 동일한 관에서 동시에 발생하는, 신속하고 편리한 믹스와 분석의 측정 유형입니다, (B )는 방사성 표지 된 물질의 사용을 피하고, (c) 감도 즉이다형광 마이크로 타이 터 플레이트 포맷으로 계측하고, (d) 노이즈 비율이 높은 신호에 의해 fforded. 이 분석을 이용하여, 정제 된 editosome 대하여 공지 RNA 편집 리가 아제 억제제의 효과 (19)를 확인 하였다. 이 실험은 주로 T.에서 전체 editosomes에 대해, RNA 편집 억제제의 신속한 식별을 위해 분석을 확인 brucei. 도 1의 상세한 단계별 개략적 인 형광 계 관내 RNA 편집 분석에서. 이 프로토콜은 두 시험 관내에서 RNA 편집을 모니터링하거나 쉽게 다양한 스케일의 화합물 라이브러리를 스크리닝 적응 될 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>SDM-79 Medium</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td>55에서 열 비활성화 &#176; C 1시간 Hemin</td></tr><tr><td>, 최소 80%</td><td>Sigma</td><td>H5533-10G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용해</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1 재조합, Rnase Free&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMax Express 대형&nbsp; 규모 RNA&nbsp; 생산 시스템</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes Dounce 조직 분쇄기&nbsp; &nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>K885300-0040&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>그라디언트 마스터, ver 5.25&nbsp;</td><td>Biocomp</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>울트라 클리어 튜브, 13.2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100XP&nbsp; 초원심분리기&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti ROTOR</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>MicroSeal 'B' Seal, Seals</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Biorad</td><td>185-5484</td><td></td></tr><tr><td>Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)</td><td>Bio Basic</td><td>A0006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Urea, 분자생물학 등급, 1 kg</td><td>라이프 테크놀러지</td><td>AM9902</td><td></td></tr></tbody></table>

trypanosomes에서 rna 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 rna 촉매

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

실질적인 진전은 trypanosomes에있는 미토콘드리아 RNA 편집의 메커니즘을 결정을했다. 마찬가지로, 상당한 진전은 RNA 편집을 촉매 editosome 착체의 구성 요소를 식별하는 제되었다. 그러나, 그 단백질이 함께 작동하는 방법을 아직 분명하지 않다. editosome 대하여 높은 처리량 스크린에서 얻어진 화합물은 편집주기에서 하나 이상의 단계를 차단하거나 영향을 미칠 수있다. 따라서, 새로운 화합물의 확인은 editosome 기능과 어셈블리를 해부에 대한 가치있는 분자 프로브를 생성합니다. 이전 연구에서, 시험 관내 편집 분석법은 무선 - 표지 된 RNA를 사용하여 수행 하였다. 이러한 분석은 시간에 비효율적이고 높은 처리량의 목적에 적합하지, 소모적이다. 여기서, 균일 한 형광 기반의 &quot;혼합 측정&quot;RNA 편집을 모니터링하는 망치 리보 자임 체외 기자의 분석을 제시한다. 만의 RNA 편집의 결과로해머 헤드 리보 자임 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 올리고 리보 뉴클레오타이드 기판 분열을 거친다. 이것은 차례로하여 신호를 생성하는 형광 소광로부터의 분리를 초래한다. editosome 기능이 저해되는 경우 반대로, 형광 신호가 급냉 될 것이다. 이 체외 RNA 편집 또는 editosome 기능을 억제 할 수있는 화학 물질의 높은 처리량 검사에 모니터에 일반적으로 적용되어야 매우 민감하고 간단한 분석이다.

대형 화면을 설정하기 위해 필요한 필수 단계를 설명하기 위해 2-5 분석의 질과 관련된 대표적인 제어 실험이다 피규어. 이러한 검사의 며칠 동안 일관된 분석 또는 다른 화면의 비교를위한 필수 제어 실험이다. 형광 신호 대 잡음비를 평가할 대규모 설정에서 형광 표지 된 올리고 리보 뉴클레오타이드 기판의 안정성과 품질을 보장​​하기 위해, 분석 배경 및 최대 신호 사이의 차이로 정의 Z&#39;-인자는 활성 리보 자임 분자 (A6Rbz)을 사용하여 계산 하였다. . &#39;(; 터 FAM), 3 플루&#39;N, N &#39;- 테트라 메틸 Z&#39;인자 분석은&gt; 0.5는 높은 처리량 화면에 적합하다고 간주되는 그림 2는 무서워 5 레이블이 기판을 사용하는 대표적인 데이터를 보여줍니다...

트리파노소마티드 병원체에서 RNA 편집의 고유한 과정을 표적으로 하는 화학 물질의 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있는 고감도 리보자임 기반 분석이 이 논문에 설명되어 있습니다. 억제제는 RNA 편집 과정에 대한 가설 기반 분석을 위한 도구로 사용될 수 있으며 궁극적으로 치료제로 사용될 수 있습니다.

Trypanosomes에서 RNA 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 RNA 촉매

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

본 절차의 전반적인 목표는 Trias Broce에서 추출한 기능적 omes를 사용하여 RNA 편집을 분석함으로써 omes 억제제를 신속하게 식별하는 것입니다. 이는 먼저 tbr에서 미토콘드리아와 표적 edito zones를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 합성 RNA 편집 리포터 기질을 준비하는 것입니다.다음으로, 정제된 edito zone에 RNA 편집 리포터와 함께 화합물을 결합시킵니다. edito zone의 기능을 차단하는 화합물이 존재하면, RNA 리포터는 편집 과정을 거치지 않아 비활성 상태로 유지됩니다. 마지막 단계로 F thread 기질을 첨가하고, RNA 편집 리포터가 이 기질을 선택적이고 특이적으로 절단할 수 있는지 모니터링합니다.억제 화합물의 경우, RNA 편집이 차단되어 형광 신호가 감소하거나 검출되지 않습니다. 최종적으로, 실시간 PCR 기기를 사용하여 시간에 따른 FRET 기질의 형광 방출을 모니터링합니다. 기존의 in vitro 편집 분석법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, RNA 편집에 대한 화학 화합물의 고속 대량 스크리닝에 사용할 수 있는 단순하고 신속한 혼합 및 측정 방식의 형광 기반 리포터 분석법이라는 점입니다.먼저, 동봉된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 tusi pro acyclic form 세포를 위한 성장 배지를 준비하십시오. 다음으로, 300 milliliters의 TBRC 1.7 야생형 pro acyclic form 세포를 28 degrees Celsius에서 70 RPMs로 48시간 동안 흔들어 배양하십시오.세포 밀도가 1.5 × 10⁷ cells/mL에 도달하면, 4°C에서 6,000 ×g로 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 그다음, 50 mL의 냉각된 phosphate buffer saline glucose 또는 PBSG 완충액으로 펠렛을 세척하고 4°C에서 10,000 ×g로 10분 동안 세포를 원심분리하여 침전시킵니다. 먼저, 회수된 세포를 30 mL의 DTE 완충액에 현탁시킨 후, 40 mL의 미리 냉각된 멸균 Dounce homogenizer를 사용하여 얼음 위에서 10회 세포막을 파쇄합니다.다음으로, 균질액에 60% sucrose 4.3 milliliters를 즉시 첨가하고 원심분리합니다. 해당 용액을 4 °C에서 15,800 Gs로 10분 동안 원심분리하십시오. 미토콘드리아를 침전시킨 후, 미토콘드리아 펠렛을 4.6 milliliters의

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단백질 응집체의 프리온과 같은 증식은 최근 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 부상했습니다. 이 프로토콜의 목표는 선충 C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 확산을 모니터링하고 프리온과 유사한 현상을 조사하는 방법을 설명하는 것입니다.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Ribonucleotides는 가장 풍부한 비정규 뉴클레오티드 핵 핵 DNA 복제 중 게놈으로 통합 중 이다. 제대로 제거, DNA 손상과 mutagenesis ribonucleotides 발생할 수 있습니다. 여기, 우리가 DNA와 그 변이 원 성 영향으로 ribonucleotide 설립의 풍부를 평가 하는 데 사용 되는 두 가지 실험 방법을 제시.

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 메틸트랜스퍼라제 활성의 직접 분석을 위한 항체-무체질 시험관내 분석이 기재되어 있다.

RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

NMR 기반 활성 세포는 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다.

화합물 억제, IC50 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 반응

이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

게놈 규모에서 RNA 편집 이벤트의 신속한 탐지와 신뢰할 수 있는 정량화는 여전히 어려운 과제이며 현재 직접 RNA 시퀀싱 방법에 의존하고 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 RNA 편집을 감지하는 간단하고 빠르며 휴대용 방법으로 미세 온도 구배 겔 전기 영동 (μTGGE)을 사용합니다.

RNA 편집의 신속한 검출을 위한 비시퀀싱 접근법

배우세요 Trypanosoma brucei에서 RNA 편집을 검출하는 FRET 기반 형광 분석법을 통해 고처리량 화합물 스크리닝을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 에디토솜 억제제를 신속하게 식별하여 기생충 RNA 편집 메커니즘 연구에 활용됩니다.

Trypanosomes에서 RNA 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 RNA 촉매

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