Trypanosomes에서 RNA 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 RNA 촉매

이 절차의 전반적인 목표는 오메 억제제의 신속한 식별을 위해 Trias Broce에서 추출한 기능적 옴을 사용하여 RNA 편집을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 tbr에서 미토콘드리아와 타겟 에디토 영역을 분리하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 합성 RNA 편집 리포터 기질을 준비하는 것입니다.

다음 화합물은 RNA 편집 리포터와 함께 정제된 edito 영역에 결합됩니다. edito zones 기능을 차단하는 화합물이 있는 경우 RNA 리포터는 편집을 거치지 않고 비활성 상태로 유지됩니다. 마지막 단계는 F 스레드 기질을 추가하고 RNA 편집 리포터가 이 기질을 선택적이고 특이적으로 절단할 수 있는 능력을 모니터링하는 것입니다.

억제성 화합물의 경우 RNA 편집이 차단되고 형광 신호가 감소하거나 감지되지 않습니다. 궁극적으로, Real-Time PCR 기계는 시간의 함수로 프렛 기질에서 방출되는 형광을 모니터링하는 데 사용됩니다. 기존의 in vitro editing assay에 비해 이 기술의 주요 장점은 RNA 편집에 대한 화합물의 고처리량 스크리닝에 사용할 수 있는 간단하고 빠른 혼합 및 측정 형광 기반 reporter assay라는 것입니다.

시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 tusi pro acyclic form cells에 대한 성장 배지를 준비합니다. 다음으로 TBRC 1.7 300밀리리터를 성장시킵니다. 야생형 프로 비환식 형태는 섭씨 28도에서 세포를 형성하면서 48시간 동안 70RPM으로 흔듭니다.

일단 세포가 밀리리터 당 7번째 세포에 1.5 곱하기 10의 조밀도를 도달하면, 6, 000 GS에 4 섭씨 온도에 10 분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 다음 50 밀리리터의 냉각 인산염, 완충액 염분, 포도당 또는 PBSG 완충액으로 펠릿을 세척하고 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 000 GS로 셀을 회전시킵니다. 먼저 수확된 세포를 30ml의 DTE 완충액에 현탁시키고 40ml의 사전 냉각 멸균 다운 균질기를 얼음 위에서 10회 사용하여 세포막을 파괴합니다.

다음으로, 즉시 4.3 밀리리터의 60 % 자당을 균질화 및 원심 분리기로 전환한다. 15, 800 GS에서 섭씨 4도에서 10 분 동안 용액. 미토콘드리아를 낮추려면 미토콘드리아 펠릿을 4.6ml의 STM 완충액에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 13.8 마이크로 리터의 0.1 몰 염화칼슘과 4 마이크로 리터의 RNA free DNA를 넣고 얼음에서 1 시간 동안 혼합물을 배양합니다. 다음으로, 4.6 밀리리터의 STE 완충액을 첨가하여 DNA를 비활성화하고 혼합물을 섭씨 4도에서 10분 동안 15, 800 Gs로 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 400마이크로리터의 용해 완충액에 다시 현탁시키고 혼합물을 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다.

10%Triton X 100을 최종 농도 1%로 튜브에 첨가하고 섭씨 4도의 튜브 로테이터에서 15분 동안 용해물을 배양합니다. 다음 17, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 Gs에 해결책을 2 시간 원심 분리해서 미토콘드리아 lysate를 언제나 맑게 하고 맑게 한 snat를 언제나 유지하십시오. 두 개의 XHHE 그래디언트 버퍼를 사용하여 초원심분리 튜브에 10ml, 10%-30% 선형 글리세롤 그라디언트를 붓고 설명서의 지침에 따라 그래디언트 마커를

다음으로, 글리세롤 구배의 상단에서 500마이크로리터의 용액을 조심스럽게 제거하고 세척된 미토콘드리아 용해물 500마이크로리터를 초원심분리 튜브에 부드럽게 로드합니다. 섭씨 4도에서 6시간 동안 178, 000GS에서 튜브를 돌립니다. 섭씨 4도에서 구배의 상단에서 하단까지 순차적으로 500마이크로리터 분수를 수집합니다.

그런 다음 액체 질소를 사용하여 분획을 스냅하고 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. T 7 상보적 서열을 1 대 1 몰 비율로 포함하는 각각의 DNA 주형을 항일합니다. 다음으로, in vitro transcription kit를 사용하여 RNA를 전사하고 사용 설명서를 따릅니다.

동일한 부피의 7개의 몰 요소 염료를 첨가하여 전사 반응을 중지합니다. 필터 멸균 9% 변성 폴리 아크릴아미드 겔에서 실행합니다. 그런 다음 단파 UV 램프를 사용하여 각각의 RNA를 찾아 절제합니다.

절제된 겔 조각을 마이크로 fuge 튜브에 넣고 400마이크로리터의 겔 용출 완충액을 추가하고 튜브 회전기에서 실온에서 밤새 RNA를 용리합니다. 다음으로, 100% 에탄올 1ml를 넣고 섭씨 영하 20도에서 30분 동안 배양하여 용출된 RNA를 침전시킵니다. 16, 000 GS에 4 섭씨 온도에 30 분 동안 RNA를 아래로 펠릿 하기 위하여 혼합물을 분리기로 만드십시오.

그런 다음 펠릿을 1ml의 75% 에탄올로 세척하고 섭씨 4도에서 20분 동안 16GS에서 튜브를 원심분리합니다. 다음으로, RNA 펠릿을 RNA 자유 물에 현탁시켜 나열된 비율을 사용하여 원하는 농도를 달성합니다. 마이크로 fuge 튜브에 1마이크로리터의 pre A 6 RBZ와 1마이크로리터의 GA 6 RBZ를 결합하여 분석을 시작합니다.

용액을 섭씨 70도에서 3분 동안 배양하고 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 마스터 믹스를 준비하고 anil pre A six RBZ 및 GA six RBZ를 믹스에 추가합니다. 마지막으로 18마이크로리터의 마스터 믹스를 웰에 분배합니다.

그런 다음 플레이트 씰러로 플레이트를 밀봉하고 스핀다운하여 기포를 제거합니다. 그런 다음 GA six RBZ 경쟁사의 2 마이크로 리터에서 배양 한 후 섭씨 28도에서 4 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 각각에 대해 플레이트에 새 씰을 잘 놓고 스핀다운하고 다음 프로그램으로 Real-Time PCR을 수행합니다.

프로그램이 완료되면 각 웰에 1마이크로리터의 프렛 기판을 23마이크로리터의 최종 부피에 추가하고 새 밀봉으로 플레이트를 밀봉합니다. 플레이트를 빠르게 회전시켜 Real-Time PCR 기계에 다시 넣습니다. 다음으로, 다음 단계를 사용하여 새 실험을 프로그래밍합니다.

그런 다음 판독이 필요한 모든 웰을 선택하여 플레이트를 설정하고 FAM 필터를 선택합니다. 입력 볼륨을 23마이크로리터로 설정하고 실행을 시작합니다. 마지막으로, 각 샘플에서 얻은 값의 기울기를 계산하여 분석을 위해 막대 그래프에 기울기를 표시하여 운동 측정값을 얻습니다.

이 분석의 품질을 결정하기 위해 서로 다른 기질의 신호 대 잡음비를 계산했습니다. Tamara Quinter 및 Iowa Black dark Quinter를 사용한 프렛 기판은 모두 고처리량 스크린에 사용할 수 있는 실행 가능한 옵션입니다. 글리세롤 구배 분획은 형광 기반 분석을 사용하여 시험관 내 편집 활성에 대해 테스트되었으며, 더 많은 편집 영역이 필요할 때 가장 활동적인 분획을 결합할 수 있습니다.

상이한 대조군 샘플들을 사용하여 분석 반응의 변수들을 분석하였는데, 어떠한 RNA 편집 성분도 누락되어 있지 않다. 기질 절단은 억제제의 부재 또는 모든 편집 성분 및 비활성 화합물의 존재 하에서 편집 반응의 모든 성분의 존재 하에서 관찰된다. 대조적으로, 억제성 화합물은 RNA 편집을 차단할 수 있으며 이 절차를 시도하는 동안 양성 대조군으로 사용됩니다.

RNA가 없는 환경을 유지하고 프렛 기질과 빛에 민감한 화합물을 가능한 한 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다.