Jsubtomo을 사용하여 전자 Cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 ​​당 단백질 스파이크의 평균화

이 절차의 전반적인 목표는 외피 보유 바이러스의 표면에 존재하는 당단백질 복합체의 구조를 연구하는 것입니다. 이는 먼저 전자 저온 현미경 데이터로부터 이전에 계산된 토모그래피 볼륨 내에서 바이러스 입자의 위치를 찾아냄으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 수동으로 정의된 데이터 서브셋을 사용하여 당단백질 복합체의 통계적으로 독립적인 두 개의 초기 모델을 생성하는 것입니다.

다음으로, 이러한 모델들을 정밀화한 후 바이러스 입자상의 모든 당단백질 복합체를 자동으로 검출하는 데 사용합니다. 마지막 단계는 전체 데이터 세트를 사용하여 당단백질 복합체의 구조를 정밀화하는 것입니다. 최종적으로, 분자 시각화 도구를 사용하여 최종 구조를 해석합니다.

이러한 당단백질 스파이크의 3차원 구조 분석은 바이러스의 병원성을 이해하고 약물을 설계하는 데 매우 중요합니다. X선 결정학(x-ray crystallography)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 막 단백질의 구조를 천연 막 환경 내에서 해결할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 구조 생물학의 핵심 주제들을 다루는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 많은 막 함유 바이러스의 구조가 이에 해당합니다. 이 기술은 이러한 바이러스 내의 당단백질 복합체에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 리포좀에 삽입된 막 단백질과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 실험 절차는 본 연구팀의 구성원인 Slee와 David Bittel이 시연할 것입니다.

B show에서 오토그램 파일을 열어 시작합니다. 파티클 피킹 도구를 사용하여 바이러스 파티클의 중심 좌표를 지정함으로써 그램 내의 바이러스 파티클을 수동으로 선택합니다. 모든 변이체가 처리될 때까지 이 단계를 반복합니다.

바이러스 좌표를 star 파일로 저장하십시오. 모든 토모그램에 대해 이 과정을 반복하십시오. 다음으로 extract 모드에서 J_sub_tomo.py를 실행하십시오. 서브 볼륨 내의 vari를 개별 볼륨 파일로 추출하려면, 저장된 star 파일을 입력 파일로 사용하여 두 개의 독립적인 초기 모델을 생성하십시오.

먼저 난소 하위 볼륨 맵 파일을 엽니다. B에서 표시하십시오. 툴박스 창을 통해 사용할 수 있는 파티클 피킹 도구를 사용하여 스파이크의 중심 좌표를 정의함으로써 Varian 하위 볼륨 내의 스파이크 서브셋을 선택합니다.

명확하게 구분되는 모든 스파이크가 처리될 때까지 이 단계를 반복하십시오. 스파이크 좌표를 star 파일에 저장하십시오. 약 200개의 당단백질 스파이크가 처리될 때까지 이 단계를 반복하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 변이체에 뷰를 할당한 후, J sub tomo create mask py를 사용하여 실공간 마스크를 생성하십시오. 그런 다음 J sub tomo create wedge mask py를 사용하여 역공간 마스크를 생성하십시오.

역격자 공간 마스크는 단일 축 토모그래피 데이터 수집으로 인해 발생하는 missing wedge 영역의 구역들을 제외하는 데 사용됩니다. 다음으로, 저장된 선택 파일을 입력 파일로 사용하여 J.Sub tomo create averages.PY를 통해 두 개의 초기 평균 영상을 생성하십시오.

초기 평균값의 노이즈를 줄이기 위해 ization을 사용하며, 이전 단계에서 생성된 두 모델을 J sub tomo iterate gold PY로 반복적으로 정렬하고 평균화합니다. 이 과정의 두 단계에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. kyira에서 결과로 나온 저역 통과 필터링된 맵 파일을 검토하여 구조의 대칭 정도를 평가하십시오. 예를 들어, 스파이크가 삼량체 복합체인 경우, 3회 대칭이 분명하게 나타나야 합니다.

텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 구조의 정밀화를 계속합니다. 다음으로, 템플릿 매칭을 위해 Varian 표면에 고르게 배치된 시드(seed)를 생성하고, JVs py를 실행하여 시드에 초기 뷰 벡터를 할당합니다. 이전에 생성한 star 파일을 입력 파일로 사용하여 예상 스파이크 수보다 약 1.5배 더 많은 시드를 생성합니다.

이 뷰 벡터(view vector)는 각 시드 포인트(seed point)에서 가장 가까운 스파이크의 방향을 근사합니다. 다음으로, 이전과 동일하게 바이러스 표면의 독립적인 평균값 두 개를 생성합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 시드의 위치를 정밀하게 조정합니다.

마지막으로 jvs.py를 사용하여 정밀화된 시드 스타 파일의 com 마커 파일을 생성합니다. CMM 파일과 관련 비리온 맵 파일을 열어 시드를 검토합니다. kyira에서 수행합니다.

정제된 시드(seeds)가 바이러스 막을 기준으로 올바르게 정렬되었는지 확인하십시오. 정제된 마커는 상호 상관 계수(cross correlation Coefficients)에 따라 색상을 지정할 수 있습니다. 정제된 시드 주변에서 로컬 템플릿 매칭을 사용하여 Varian 서브 볼륨 내의 모든 스파이크(spikes) 위치를 자동으로 찾으십시오. 위치가 확인된 스파이크들을 정렬하고 평균화하십시오. 이때 수동으로 선택한 스파이크 서브셋에서 생성된 평균값을 초기 템플릿으로 사용합니다. 이 과정에 대한 추가 세부 사항은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 결과를 시각화하려면 kyira에서 스파이크의 정제된 구조를 열어 확인하십시오.

원자 구조 피팅을 진행하십시오. 그 다음 j Subo Create model DO py를 사용하여 비리온의 복합 모델을 생성하십시오. 마지막으로 kyira에서 시각화를 위해 복합 모델을 여십시오.

초기 모델은 수동으로 선택한 205개의 스파이크를 사용하여 정밀화되었습니다. 가장 중심에 위치한 스파이크의 3회 대칭성이 대칭을 적용하지 않은 상태에서도 명확하게 나타났으며, Varian 표면의 모든 스파이크를 수동으로 검출하기 위해 이후의 정밀화 단계에 이를 적용하였습니다. 반지름 43 nanometers, 간격 20 degrees의 조건으로 각 vion에 대해 106개의 시드가 생성되었으며, 이들의 위치는 막을 기준으로 반복적으로 정밀화되었습니다.

가장 상관관계가 높은 당단백질 스파이크 패치들을 사용하여 최종 평균값을 계산했습니다. 평균값은 35 Å 분해능으로 분석되었습니다. 이를 통해 중앙의 삼량체 스파이크 구조와 더불어 인접한 6개 스파이크의 일부 기여분이 확인되었습니다.

구조를 알려진 위치에 배치하여 계산한 varis의 복합 모델을 통해 Varian 표면의 스파이크 배치가 드러났습니다. 때때로 국소적으로 정렬된 스파이크 패치들이 관찰되었습니다. 이 절차를 수행할 때는 최상의 데이터만을 사용하고 모든 중간 결과를 세밀하게 확인하는 것이 중요합니다.

이 절차를 따르면, X선 결정학 구조를 최종 평균 구조에 맞추어 단백질-단백질 상호작용을 더욱 정확하게 관찰할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 J Omo를 사용하여 바이러스 외피 당단백질 구조를 평균화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.