Name: Jsubtomo을 사용하여 전자 Cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 당 단백질 스파이크의 평균화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 배우세요 Jsubtomo를 사용하여 전자 크라이오단층촬영 데이터에서 바이러스 봉투 당단백질 스파이크 구조를 평균화하는 방법을. 이 기술은 막 단백질을 자연 환경에서 연구하여 바이러스 병원성과 약물 설계에 대한 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 핀란드 아카데미 (130750 및 218080 to J.T.H.), 웰컴 트러스트 (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), 그리고 MRC (MR/J007897/1 to J.T.H 와 T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).

<ol><li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li>
<li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li>
<li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles%3A+structural+implications+for+coat+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li>
<li>Grünewald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li>
<li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li>
<li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li>
<li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li>
<li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).</li>
<li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li>
<li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li>
<li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li>
<li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles%3A+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li>
<li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li>
<li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li>
<li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li>
<li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li>
<li>Pietilä, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li>
<li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li>
<li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li>
<li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).</li>
<li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li>
<li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li>
<li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bsoft%3A+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li>
<li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li>
<li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

<html> 비리 막에 바이러스 성 스파이크 당 단백질 구조의 기술은 바이러스 복제를 이해하고 치료 및 감염을 예방하는 치료제의 개발에 필수적이다. 단일 입자의 평균 결합 전자 현미경 크라이 스파이크 당 단백질을 포함 엔벨로프 바이러스 입자의 구조를 해결하기 위해 대부분의 이용 방법으로서 떠오르고있다. 그러나,이 방법은 대칭 바이러스를 icosahedrally로 제한됩니다. 여기 Jsubtomo에서 전자 크라이 단층 촬영 subtomogram 평균의 응용 프로그램을 통해, 우리는 다형성에 다른 현재의 구조 생물학 방법 의무가없는 바이러스 당 단백질 스파이크를 포위 결정하기위한 일반적인 프로토콜을 설명했다. 우리의 대표적인 결과이 방법의 해상도가 도메인 아키텍처, 올리고머, 그대로 비리에 당 단백질 스파이크의 고차 조직에 대한 통찰력을 공개하기에 충분 함을 입증. jove_content &quot;&gt;이 프로토콜 내에서 가장 중요한 단계는이 단계의 또 다른.을 성공적으로 실행하는 당 단백질 스파이크 있도록 충분히 큰 너무 밀접하게 서로에 대해 포장하지 않은 것으로 가정 한 통계적으로 독립적이 신뢰할 수있는 초기 모델을 건설하고 개별 스파이크 수 시인 수동 단층 촬영 고른, 2 개의 독립적 인 모델은 평균화 될.이 가능하지 않은 경우, 프로토콜이 변경이 시도 될 수있다. 첫째, 두 개의 독립적 인 랜덤 모델은 먼저 subtomograms 두 임의의 서브 세트를 정의에 의해 구성 될 수있다 이러한 서브 세트 (30) 내에 subtomograms 평균. 둘째, 절연 스파이크의 구조를 X-선 결정학에 의해, 예를 들면, 다른 방법에 의해 도출 된 경우, 이는 초기 모델로서 사용될 수있다. 그러나, 치료가 저 -주의해야 정제의 다음 라운드에서 것이 모델의 결과로서, 저해상도 컷오프 (50-70 A)을 이용하여이 모델에 필터를 통과만이 해상도를 넘어 통계적으로 독립. 이주의해야 할 점으로 인해 이전의 접근 방식을 권장합니다. 이 프로토콜에서 얻을 수있는 해상도는 네 가지 주요 요인에 따라 달라집니다 내가. 데이터 수집 전략 및 입력 데이터의 품질, II. subtomograms 수, III. 배향 subtomograms의 정확성, 및 IV. 구조의 이질성. 제 1 및 제 2 한계가 크게 높은 신호대 직접 전자 CTF 결합 검출기 단층 수정 및 자동 데이터 수집을 사용함으로써 극복 될 수 있지만, 얼라인먼트 정밀도를 더욱 관심 자체의 구조의 크기 및 형상에 의해 영향을 받는다. 눈에 띄는 특징을 결여 작은 스파이크에이 프로토콜을 적용하면, 배향의 정확도 때문에 해상도를 개선하기 위해 31 스파이크의 Fab 단편에 결합하는 것이 유리할 수있다. 마지막으로, 구조는 평균화 할 경우 전시 배좌 여러 서브 단층AM 분류 방법은 별도로 상이한 입체 형태를 평균화하기 위하여 사용될 수있다. 이를 위해 Jsubtomo 강력한 subtomogram 분류 구를 제공하고, 디나모 패키지에 통합하고있다. 상기 프로토콜은 절연 바이러스 당 단백질의 X-선 결정학에 상보. 결정 구조는 비리 막에 대하여 당 단백질의 정확한 배향을 얻기 위해 서브 - 단층 평균에 장착 할 수있다. 이 방법의 적용은 의심 할 여지없이 싸여 바이러스 구조와 pathobiology에 대해 설명해 주실 것입니다.

전자 크라이 단층 복잡한 생물학적 시료의 3 차원 (3D)의 재구성 연산을 허용하는 전자 크라이 현미경 이미징 기술이다. 적절한 표본은 전체 원핵 세포 5 및 전체 진핵 세포 6 심지어 얇은 지역에 정제 된 거대 분자 복합체 일, 필라멘트 2, 코팅 된 소포 3, 다형성 막 바이러스 4 이르기까지 다양합니다. 틸트 계, 3 차원 단층 볼륨, 또는 단층 촬영 데이터의 컬렉션 후, Bsoft 7 및 8 IMOD 포함한 여러 확립 소프트웨어 패키지를 이용하여 계산 될 수있다. 전자 크라이 단층 제한 대응 단층 볼륨의 생물학적 해석에 의한 생체 시료의 연구에 내재 두 측면. 인해 상당한 방사선 손상을 도입하기 전에 생체 재료에 적용 할 수있는 제한된 전자 도즈, 시그나하려면 우선단층 촬영 데이터에 L 잡음비은 일반적으로 아주 낮다. 둘째, 데이터를 수집하는 동안 샘플로 경사 형상의 결과로서, 객체의 몇몇보기는 단층 부피 소위 &#39;누락 쐐기&#39;이슈 선도 유지 부재. 단층 볼륨이 성공적 일 수 9-12의 평균 수와 같은 거대 분자 복합체로서 동일한 구조를 반복 포함한다면, 이러한 제한을 모두 극복 할 수있다. 단층 복원에서 구조를 평균에 앞서, 관심 객체 발견하고 같은 방향으로 정렬되어야합니다. 이러한 구조를 찾는 것은 종종 주형으로 13 일치 함 접근법을 사용하여 단층 부피 주형 구조의 상호 - 상관에 의해 달성 될 수있다. 이 매칭 처리에 사용되는 템플릿은 극저온 전자 현미경 또는 3D 재구성 결합 전자 크라이 단층로부터 유도 될 수 있거나 밀도에서 시뮬레이션지도가 될 수있다원자 구조. 몇몇 연산 패키지 (11)는 이들 작업을 수행하기 위해 개발되었다. 이러한 HIV-1과 같은 막 바이러스의 당 단백질 스파이크의 평균, 그 구조 14-16 공부에 특히 성공적으로 접근하고있다. 구조에 대한 이해는 바이러스 호스트 상호 작용의 두 분자 기초를 공개하고 바이러스 백신 디자인 개발을 안내하기위한 필수입니다. 고분자 결정학 개별 바이러스 당 단백질과 그 복합체의 구조 분석 (4보다 일반적으로 더 나은) 고해상도에 대한 선택의 기술은 있지만,이 방법에 의한 X-선 구조 비리에 천연 멤브레인 환경에서 분리 된 단백질 아르 . 따라서, 그러한 비리 온의 맥락에서 바이러스 당 단백질의 고차 구조 등의 중요한 사항, 부족한 남아있다. 한편, 전자 현미경 및 크라이 단일 입자 재건전체 싸여 바이러스의 면체 대칭 (17, 18)와 비리로 제한됩니다. 서브 볼륨 조정과 함께 전자 cryotomography 따라서 현장에서 불규칙한 모양, 다형성 바이러스의 당 단백질 스파이크의 연구를 허용하는 상호 보완적인 기술로 떠오르고있다. 우리는 Jsubtomo 단층 서브 볼륨의 감지, 정렬 및 평균화 (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo)라는 소프트웨어를 개발했다. Jsubtomo은 세포 및 바이러스 성 구조 19-26의 번호의 구조 결정에 이용되었다. 여기서는 판정 바이러스 표면 스파이크 구조 있도록 상세한 프로토콜을 설명합니다. 소음의 상관 관계에 의해 과도하게 세분화 평균 구조를 회피하기 위해, &#39;황금 표준&#39;정제 방식은 10,27을 채용하고 있습니다. 마지막으로, 시각화 및 전형 결과의 해석을위한 전략을 논의한다.

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>University of Oxford</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>해당 없음</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

jsubtomo을 사용하여 전자 cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 ​​당 단백질 스파이크의 평균화

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

싸여 바이러스는 숙주 세포에 진입을 중재하기 위해 표면에 막 당 단백질을 사용합니다. 이러한 당 단백질 &#39;스파이크&#39;의 입체 구조 해석은 종종 바이러스 성 병인을 이해하고 약물 디자인 기술적 도전하지만 중요하다. 여기서, 프로토콜은 전자 크라이 단층 촬영 데이터의 계산 평균을 통해 바이러스 스파이크 구조 결정을 위해 제공됩니다. 전자 극저온 단층 촬영은 거의 네이티브, 냉동 수화 상태에서 막 바이러스와 같은 다형성 생물 표본의 3 차원 단층 촬영 볼륨 복원 또는 단층 촬영을 유도하는 데 사용되는 전자 현미경의 기술입니다. 이러한 단층 촬영 낮은 해상도에서이기는하지만, 세 가지 차원에 대한 관심의 구조를 알 수있다. 서브 볼륨, 또는 하위 단층 촬영 전산 평균, 이러한 바이러스 당 단백질 스파이크 같은 구조적 모티프를 반복의 높은 해상도 세부 사항을 얻을 필요가있다. 알리에 대한 자세한 계산 방법gning 및 Jsubtomo 소프트웨어 패키지를 이용하여 서브 - 단층 촬영을 평균하는 개략되어있다. 이 접근법은 비리 막에 고차 스파이크 투 스파이크 상호 작용의 연구 (A)의 20 ~ 40 범위의 해상도와 연구 바이러스 성 스파이크 당 단백질의 구조의 시각화를 가능하게한다. 일반적인 결과는 Bunyamwera 바이러스, 가족 Bunyaviridae에서 포락선 바이러스되게됩니다. 이 가족은 인간과 동물의 건강에 위협이 병원균의 구조적 다양한 그룹입니다.

우리는 24를 설정 이전에 게시 된 데이터를 사용하여 Bunyamwera 바이러스 (Orthobunyavirus, Bunyaviridae)의 엔벨로프 당 단백질 복합체에 대한 위에서 설명한 서브 단층 평균 워크 플로우의 응용 프로그램을 보여줍니다. 데이터 수집 및 정제 파라미터는 표 1에 나열되어 있습니다. 대표하는 하나의 단층는 그림 2와 같다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 매개 변수 (단위) </td><td> 값 </td></tr><tr><td> 데이터 수집 </td><td></td></tr><tr><td> 전압 (kV의) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 보정 배율 (X) </td><td> 111000 </td></tr><tr><td> 픽셀 크기 (A) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> 예상 용량 (전자 - / 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 언더 포커스 (μM) </td><td> 4.0-4.5 </tD&gt; </tr><tr><td> 제 CTF 제로 (A) </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> 틸트 범위 (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> 틸트 샘플링 (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 데이터 및 개선 </td><td></td></tr><tr><td> 단층 촬영 </td><td> 11 </td></tr><tr><td> 비리 </td><td> 29 </td></tr><tr><td> 비리 당 씨앗 </td><td> (106) </td></tr><tr><td> 씨앗의 총 수 </td><td> 3074 </td></tr><tr><td> 스파이크 검출 </td><td> 1346 </td></tr><tr><td> 중복을 제거한 후 스파이크 </td><td> 1401 </td></tr><tr><td> 교차 상관 관계를 기반으로 선택 후 스파이크 </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> 스파이크는 최종 평균에 포함 </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> 대칭 </td><td> C3 </td></tr><tr><td> 각도 샘플링 (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 해상도정제에 사용되는 범위 (A) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> 최종 해상도 추정 (A) (B) </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> 표 1 : Bunyamwera 데이터 수집 및 정제 통계. CTF, 콘트라스트 전달 함수. B 0.143의 임계 값이 독립적으로 정제 된 구조물 사이 푸리에 쉘 상관을 사용하여 계산. <img alt="그림이" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> 그림 2 :. Bunyamwera 비리의 단층 촬영을 통해 조각 각 비리의 주변에서 분명 여러 스파이크 측면보기는 화살촉으로 표시됩니다. 단층 촬영 (60)에 로우 패스 필터링하고 있습니다. 스케일 바 100 nm의. 첫째, 우리는 205 수동 고른 스파이크를 사용 초기 모델 (정제 <strong&gt; 그림 3). 가운데 가장 스파이크의 3 배 대칭은 대칭 (그림 3B)를 적용하지 않고 분명했다 및 개선의 다음 라운드 (그림 3C)에 부과되었다. 비리 온의 표면 상에 자동적으로 모든 스파이크를 검출하기 위해, 우리는 43 내지 20도 (도 4A)의 간격의 반경마다 비리 대 106 씨앗 생성 반복적 막 (도 4b)에 대하여 자신의 위치를 정제. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> 그림 3 : 초기 템플릿 구조의 제련. (A) 원통형 스파이크의 수동으로 정의 위치에서 건설 (C100) 템플릿을 평균. (B) &#39;평균 밀도를 정제의 5 라운드 후 모든 대칭없이 (C1) 3 배에 표시에게 스파이크를 부과대칭 기능을 제공합니다. 모델의 해상도는 48 Å이다. 스파이크 (C) 평균이 3 배 대칭 정제의 5 라운드 이후 41 Å에서 해결되었습니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> 그림 4 :.. 씨의 제련 AB) (전 씨의 집합)과 후 (B) 정제는 그림 2에서 한 비리 밀도 (B)의 씨앗을 나타내왔다 색으로 각각의 크로스를 기반으로 상관 계수 (파란색, 낮은 상관 관계, 빨강, 높은 상관 관계). (중복을 제거한 후 상위 75 %; ~ 1000 스파이크) 최상의 스파이크 당 단백질 상호 관련 패치는 최종 평균을 계산하는 데 사용 하였다. 평균은 35 Å 해상도 (그림 5)로 확인되었다. 이 글은, 중간에 삼량 스파이크 구조를 밝혀여섯 이웃 스파이크에서 약간의 기여뿐만 아니라. 알려진 위치에 구조를 배치하여 계산 된 비리의 복합 모델은 비리 표면 (그림 6A)에 스파이크의 위치를 한 것으로 밝혀졌습니다. 때때로, 스파이크의 로컬 주문 패치 (그림 6B) 분명했다. <img alt="그림 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> 그림 5 : 템플릿 매칭 후 당 단백질 스파이크 층의 패치의 정제 구조. (AB) &#39;도&#39;와 &#39;홀수&#39;, 데이터의 두 부분에서 재구성 된 두 개의 맵이 표시됩니다. 이지도는 접근 방식의 validness을 확인, 유사의 놀라운 수준을 보여줍니다. 이지도는 서로 완전히 독립적으로 재구성 된대로 스파이크 긴 축을 중심으로 방향이 다르다. 이지도의 (C) 평균에 표시됩니다35 Å의 최종 해상도. <img alt="그림 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> 그림 6 : Bunyamwera 비리에 스파이크를 배치. (A) 비리의 복합 모델입니다. 보기 벡터 (스틱) 스파이크의 방향을 나타냅니다. 색상은 각각의 스파이크와 템플릿 구조 (파란색, 낮은 상관 관계, 빨강, 높은 상관 관계) 사이의 상호 상관을 나타냅니다. 스파이크의 정렬 된 패치의 (B) 근접.

컴퓨터 패키지 Jsubtomo를 사용한 전자 극저온 단층촬영(electron cryo-tomography)과 서브 단층촬영(sub-tomogram)의 평균화를 조합하여 바이러스막 당단백질 복합체의 구조를 결정하기 위한 접근 방식이 제시됩니다.

Jsubtomo을 사용하여 전자 Cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 ​​당 단백질 스파이크의 평균화

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

이 절차의 전반적인 목표는 외피 보유 바이러스의 표면에 존재하는 당단백질 복합체의 구조를 연구하는 것입니다. 이는 먼저 전자 저온 현미경 데이터로부터 이전에 계산된 토모그래피 볼륨 내에서 바이러스 입자의 위치를 찾아냄으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 수동으로 정의된 데이터 서브셋을 사용하여 당단백질 복합체의 통계적으로 독립적인 두 개의 초기 모델을 생성하는 것입니다.다음으로, 이러한 모델들을 정밀화한 후 바이러스 입자상의 모든 당단백질 복합체를 자동으로 검출하는 데 사용합니다. 마지막 단계는 전체 데이터 세트를 사용하여 당단백질 복합체의 구조를 정밀화하는 것입니다. 최종적으로, 분자 시각화 도구를 사용하여 최종 구조를 해석합니다.이러한 당단백질 스파이크의 3차원 구조 분석은 바이러스의 병원성을 이해하고 약물을 설계하는 데 매우 중요합니다. X선 결정학(x-ray crystallography)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 막 단백질의 구조를 천연 막 환경 내에서 해결할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 구조 생물학의 핵심 주제들을 다루는 데 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 많은 막 함유 바이러스의 구조가 이에 해당합니다. 이 기술은 이러한 바이러스 내의 당단백질 복합체에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 리포좀에 삽입된 막 단백질과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 실험 절차는 본 연구팀의 구성원인 Slee와 David Bittel이 시연할 것입니다.B show에서 오토그램 파일을 열어 시작합니다. 파티클 피킹 도구를 사용하여 바이러스 파티클의 중심 좌표를 지정함으로써 그램 내의 바이러스 파티클을 수동으로 선택합니다. 모든 변이체가 처리될 때까지 이 단계를 반복합니다.바이러스 좌표를 star 파일로 저장하십시오. 모든 토모그램에 대해 이 과정을 반복하십시오. 다음으로 extract 모드에서 J_sub_tomo.py를 실행하십시오. 서브 볼륨 내의 vari를 개별 볼륨 파일로 추출하려면, 저장된 star 파일을 입력 파일로 사용하여 두 개의 독립적인 초기 모델을 생성하십시오.먼저 난소 하위 볼륨 맵 파일을 엽니다. B에서 표시하십시오. 툴박스 창을 통해 사용할 수 있는 파티클 피킹 도구를 사용하여 스파이크의 중심 좌표를 정의함으로써 Varian 하위 볼륨 내의 스파이크 서브셋을 선택합니다.명확하게 구분되는 모든 스파이크가 처리될 때까지 이 단계를 반복하십시오. 스파이크 좌표를 star 파일에 저장하십시오. 약 200개의 당단백질 스파이크가 처리될 때까지 이 단계를 반복하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 변이체에 뷰를 할당한 후, J sub tomo create mask py를 사용하여 실공간 마스크를 생성하십시오. 그런 다음 J sub tomo create wedge mask py를 사용하여 역공간 마스크를 생성하십시오.역격자 공간 마스크는 단일 축 토모그래피 데이터 수집으로 인해 발생하는 missing wedge 영역의 구역들을 제외하는 데 사용됩니다. 다음으로, 저장된 선택 파일을 입력 파일로 사용하여 J.Sub tomo create averages.PY를 통해 두 개의 초기 평균 영상을 생성하십시오.초기 평균값의 노이즈를 줄이기 위해 ization을 사용하며, 이전 단계에서 생성된 두 모델을 J sub tomo iterate gold PY로 반복적으로 정렬하고 평균화합니다. 이 과정의 두 단계에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. kyira에서 결과로 나온 저역 통과 필터링된 맵 파일을 검토하여 구조의 대칭 정도를 평가하십시오. 예를 들어, 스파이크가 삼량체 복합체인 경우, 3회 대칭이 분명하게 나타나야 합니다.텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 구조의 정밀화를 계속합니다. 다음으로, 템플릿 매칭을 위해 Varian 표면에 고르게 배치된 시드(seed)를 생성하고, JVs py를 실행하여 시드에 초기 뷰 벡터를 할당합니다. 이전에 생성한 star 파일을 입력 파일로 사용하여 예상 스파이크 수보다 약 1.5배 더 많은 시드를 생성합니다.이 뷰 벡터(view vector)는 각 시드 포인트(seed point)에서 가장 가까운 스파이크의 방향을 근사합니다. 다음으로, 이전과 동일하게 바이러스 표면의 독립적인 평균값 두 개를 생성합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 시드의 위치를 정밀하게 조정합니다.마지막으로 jvs.py를 사용하여 정밀화된 시드 스타 파일의 com 마커 파일을 생성합니다. CMM 파일과 관련 비리온 맵 파일을 열어 시드를 검토합니다. kyira에서 수행합니다.정제된 시드(seeds)가 바이러스 막을 기준으로 올바르게 정렬되었는지 확인하십시오. 정제된 마커는 상호 상관 계수(cross correlation Coefficients)에 따라 색상을 지정할 수 있습니다. 정제된 시드 주변에서 로컬 템플릿 매칭을 사용하여 Varian 서브 볼륨 내의 모든 스파이크(spikes) 위치를 자동으로 찾으십시오. 위치가 확인된 스파이크들을 정렬하고 평균화하십시오. 이때 수동으로 선택한 스파이크 서브셋에서 생성된 평균값을 초기 템플릿으로 사용합니다. 이 과정에 대한 추가 세부 사항은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 결과를 시각화하려면 kyira에서 스파이크의 정제된 구조를 열어 확인하십시오.원자 구조 피팅을 진행하십시오. 그 다음 j Subo Create model DO py를 사용하여 비리온의 복합 모델을 생성하십시오. 마지막으로 kyira에서 시각화를 위해 복합 모델을 여십시오.초기 모델은 수동으로 선택한 205개의 스파이크를 사용하여 정밀화되었습니다. 가장 중심에 위치한 스파이크의 3회 대칭성이 대칭을 적용하지 않은 상태에서도 명확하게 나타났으며, Varian 표면의 모든 스파이크를 수동으로 검출하기 위해 이후의 정밀화 단계에 이를 적용하였습니다. 반지름 43 nanometers, 간격 20 degrees의 조건으로 각 vion에 대해 106개의 시드가 생성되었으며, 이들의 위치는 막을 기준으로 반복적으로 정밀화되었습니다.가장 상관관계가 높은 당단백질 스파이크 패치들을 사용하여 최종 평균값을 계산했습니다. 평균값은 35 Å 분해능으로 분석되었습니다. 이를 통해 중앙의 삼량체 스파이크 구조와 더불어 인접한 6개 스파이크의 일부 기여분이 확인되었습니다.구조를 알려진 위치에 배치하여 계산한 varis의 복합 모델을 통해 Varian 표면의 스파이크 배치가 드러났습니다. 때때로 국소적으로 정렬된 스파이크 패치들이 관찰되었습니다. 이 절차를 수행할 때는 최상의 데이터만을 사용하고 모든 중간 결과를 세밀하게 확인하는 것이 중요합니다.이 절차를 따르면, X선 결정학 구조를 최종 평균 구조에 맞추어 단백질-단백질 상호작용을 더욱 정확하게 관찰할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 J Omo를 사용하여 바이러스 외피 당단백질 구조를 평균화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

averaging-viral-envelope-glycoprotein-spikes-from-electron

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

프로토콜은 cryo - 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여 막 단백질의 구조를 결정하기 위해 높은 처리량 접근 방식을 설명합니다. 이것은 시편 준비의 세부 사항, 데이터 수집, 데이터 처리 및 해석을 포함하고, 접근, HIV - 1 봉투 당단백질에 대한 대표적인 대상의 생산 마칩니다. 이러한 계산 절차는 원격 작업 및 데이터 처리 및 구조 분석에 기여하는 연구자와 학생을 수있는 방식으로 설계되었습니다.

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

이 문서는 cryo - 전자 현미경을 사용하여 나선형으로 조립 분자의 3 차원 (3D) 구조를 구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 반복 나선형 실제 공간 재건 방법에 의해 밀도지도를 달성하기위한 세부적인 3D 재건 절차를 설명하기 위해 HIV - 1 capsid 어셈블리를 사용합니다.

Cryo - 전자 현미경에 의해 HIV - 1 Capsid 어셈블리의 구조와 반복 나선형 실제 공간 재건

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

여기에서는 투과 전자 현미경을 사용하여 나노 스케일에서 액체-EM 및 Cryo-EM 분석에 적합한 바이러스 어셈블리를 준비하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 향상

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

이 기사에서는 극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 이미징된 인플루엔자 바이러스의 데이터 처리 및 혈구응집소 당단백질의 후속 서브 단층 촬영 평균화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 이미지 전처리부터 최종 모델 개선까지 단계별 데이터 처리를 다룹니다.

인플루엔자 바이러스의 극저온 전자 단층 촬영에서 혈구응집소의 서브나노미터 분해능 구조 결정

Virochip 동시에 보존 순서 상동에 기초하여 모든 알려진 바이러스뿐 아니라 소설의 바이러스를 검출하기위한 판 - 바이러스 microarray입니다. 여기 알려진 알려지지 않은 두 바이러스의 존재에 대한 임상 샘플을 분석 Virochip 분석을 실행하는 방법을 보여줍니다.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

배우세요 Jsubtomo를 사용하여 전자 크라이오단층촬영 데이터에서 바이러스 봉투 당단백질 스파이크 구조를 평균화하는 방법을. 이 기술은 막 단백질을 자연 환경에서 연구하여 바이러스 병원성과 약물 설계에 대한 통찰을 제공합니다.

Jsubtomo을 사용하여 전자 Cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 ​​당 단백질 스파이크의 평균화

더 많은 동영상 탐색

Jsubtomo을 사용하여 전자 Cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 당 단백질 스파이크의 평균화