Name: 세균에 대한 두 개의 구성 요소 규제 시스템을 유전자 표적을 확인하는 DNA 친화력 - 정제 칩 (DAP-칩) 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 배우세요 DAP-칩 방법을 이용하여 세균의 두 구성 요소 반응 조절자의 게놈 결합 부위를 결정하는 기술입니다. 이 방법은 클로닉, 정제, 인산화를 포함하며 유전자 조절 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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우리는 비디오 촬영을 위해 준비하는 그녀의 도움과 기술을 보여 에이미 첸 감사합니다. 수수께끼에 의해 수행이 작품 : 유전자 및 분자 조립 (http://enigma.lbl.gov)와 생태계 및 네트워크 통합은, 로렌스 버클리 국립 연구소의 과학적인 초점 영역 프로그램은 과학, 생물의 사무실의 사무실에 의해 지원되었다 계약 번호 DE-AC02-05CH11231에서 미국 에너지 국의 환경 연구.

<ol><li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li>
<li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li>
<li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li>
<li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li>
<li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RegPrecise+web+services+interface%3A+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li>
<li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+sigma%28N%29-dependent+promoters+in+bacterial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li>
<li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99(2011).</li>
<li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WebLogo%3A+a+sequence+logo+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li>
<li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li>
<li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li>
<li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li>
<li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li>
<li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li>
<li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li>
<li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIP-chip%3A+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li>
<li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Immunoprecipitation+%28DIP%29+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon%3A+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li>
<li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li>
<li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-chip+versus+ChIP-seq%3A+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134(2011).</li>
<li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li>
</ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

여기에 설명 된 칩 DAP 방법은 성공적 일이 대표적인 결과로 게재되어있는 Desulfovibrio 불가리스 Hildenborough 7 몇개의 RR 대한 유전자 표적을 결정하는 데 사용되었다. RR의 DVU3023 들어, 후보 유전자 표적을 선택하는 것은 수월했다. DVU3025은 RR 유전자의 바로 하류에 위치하고 있으며, RR 및 대상 유전자는 여러 Desulfovibrio 종에서 보존하고, 또한 DVU3025는 예측 sigma54 의존 발기인 있습니다. EMSA는 급속 후보 표적 유전자에 대한 결합에 대해 RR를 테스트하기위한 간단한 방법을 제공하고, 또한 정제 된 단백질 샘플의 활성의 평가뿐만 아니라, 최적의 단백질-DNA 결합 조건을 결정한다. DNA 결합 활성은 인산화 DNA 바인딩에 필요한 있는지 아세틸 포스페이트의 존재 및 부재하에 시험 될 수있다. 모두의 RR은 작은 분자 기증자에 의해 인산화되는 것은 아닙...

생존하고 번성하는 박테리아의 능력들은 인식하고 그들의 환경에서 섭동에 응답 할 수있다 얼마나 잘 매우 의존적이며, 이것은 차례로 자신의 신호 전달 체계에 의존한다. 경보 시스템 박테리아 인코딩의 수는 &quot;미생물 IQ&quot;라고되어 그 환경의 변화와 여러 신호를 감지 할 수있는 능력과 미세 조정의 응답 1 두의 표시가 될 수 있습니다. 두 성분의 신호 전달 시스템 (TCS)은 세균에 의해 사용되는 가장 널리 시그널링 시스템이며, 그들은 외부 신호를 감지하여 음향 응답 레귤레이터 (RR) 2 인산화를 통해 송신 히스티딘 키나아제 (HK)으로 구성된다. 의 RR은 출력 영역의 다양하므로 서로 다른 음향 모드를 가질 수 있지만, 가장 일반적인 반응은 도메인 1 DNA 결합을 통해 전사 조절이다. 감지 신호 및 VAS의 대응 기능TCSS의 t의 대부분은 알 수없는 남아 있습니다. 이러한 칩 - 칩과 같은 생체 내 방법으로 일상적 전사는 3 요소 게놈 결합 부위의 측정에 사용되지만, 활성화 조건 또는 신호가 알려져있는 경우, 그들은 단지 세균이 성분계 RR들에 대해 사용될 수있다. 종종 TCS를 활성화 환경 단서는 자신의 유전자를 대상으로보다 결정하기 어렵습니다. 시험 관내 마이크로 어레이는 기재 기반 분석을 효과적으로 빠르게 유전자 표적을 결정하고 TCSS의 기능을 예측하기 위해 사용될 수있다. 상기 분석 된 RR가 인산화 따라서 아세틸 포스페이트 4와 같은 작은 분자를 사용 도너 시험 관내에서 활성화 될 수 있다는 사실을 이용한다. 이 방법에서는, DNA 친화력 - 정제 - 칩 (그림 1)에 대한 DAP 칩 이름, 관심의 RR 유전자는 E.에서 그의 태그로 복제됩니다 대장균 및 이후 정제 태그 단백질은 양방향으로 허용된다차 게놈 DNA를 전단한다. 단백질 - 결합 DNA가 다음 친화력 정화에 충실 풍부한 입력 DNA가 증폭, 형광 함께 풀링 및 사용자 관심의 유기체 (그림 1)에 만든 기와 배열에 하이브리드 레이블. 마이크로 어레이 실험 유물로 될 수 있으며, 따라서 추가 단계 분석을 최적화하기 위해 사용된다. 하나의 단계는 (그림 2에서 워크 플로우를 참조) 전기 이동성 이동 분석 (EMSA)를 사용하여 연구에서 RR에 대한 하나의 목표를 ​​결정하려고하는 것입니다. 그런 다음, 게놈 DNA와 DAP 단계에 바인딩 다음, 단백질 - 결합 및 입력 DNA 따라서 최적의 바인딩 상태를 확인한, 긍정적 인 목표는 입력 부분에 상대적으로 단백질 - 결합 부분에 농축되어 있는지 qPCR에 의해 검사된다 RR (그림 2). 어레이 혼성화 후, 데이터는 게놈 궤적을 나타내는 높은 강도 신호의 피크를 찾기 위해 분석된다 여기서 단백질 H광고는 바인딩. 함수 얻어진 유전자 표적에 근거 RR 대해 예측 될 수있다. 대상 게놈 유전자 좌는 다음 실험적 EMSAs (그림 2)를 사용하여 유효성을 검사 결합 부위의 모티브를 예측하는 데 사용됩니다. RR의 기능 예측 및 유전자 목표는 밀접하게 유사한 결합 모티프에 대한 사람들의 게놈 (그림 2)를 스캔하여 orthologous의 RR을 인코딩 종 관련 확장 할 수있다. DAP 칩 방법은 이전에 아무도 없었다 TCS에 대한 풍부한 정보를 제공 할 수 있습니다. 상기 방법은 또한 단백질이 정제 될 수 있으며 DNA 결합 상태가 결정될 수 있으면 어떠한 전사 조절을 위해 사용하고, 게놈 서열과 관심있는 유기체에 해당 될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. DNA 친화력 - 정제 - 칩 (DAP-칩) 전략 7. 그 유기체에서 RR 유전자는 E.에 카르복시 말단 그의 태그로 복제됩니다 대장균 발현 균주. 정제 그의 태그가 단백질 아세틸 포스페이트 인산화에 의해 활성화하고, 쉬어 된 게놈 DNA와 혼합된다. 나머지는 니켈-NTA 수지를 사용하여 친 화성 정제를 실시하면서 결합 반응의 분취 량은, 입력 DNA로 저장된다. 입력 및 RR 바인딩 된 DNA는 증폭 된 전체 게놈 있으며, 각각를 Cy3 및 Cy5에,로 표지. 표지 된 DNA를 함께 풀링하고 유전자 표적을 결정하기 위해 분석된다 타일링 어레이에 혼성화된다. 그림 수정 및 크리에이티브 커먼즈 라이센스를 7에서 사용하는 재판. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> 워크 플로의 그림 2. 요약. 모든 정제 태그 PROTEI 위해N, EMSA를 이용하여 대상을 결정함으로써 시작한다. (WGA) 농축 및 입력 DNA 증폭 게놈 DNA 다음 DNA 친화력 - 정화 (DAP) 및 전체 게놈을 결합하는 단백질을 허용합니다. 표적 유전자가 알려진 경우, 알려진 타겟 단백질 - 결합 분획에 농축되도록 qPCR에를 사용한다. 어떤 대상을 판별 할 수 있다면, DNA 라벨 및 배열 하이브리드로 직접 진행합니다. qPCR에 의한 농축이 관찰 할 수없는 경우, 결합 단백질 - gDNA를 다른 단백질의 양을 사용하여 DAP-WGA의 단계를 반복합니다. 피크를 찾아 유전자를 대상에 매핑하는 배열 분석을 사용합니다. 결합 부위 모티프를 예측하는 표적 유전자의 상류 영역을 사용한다. 실험적으로 EMSAs를 사용하여 주제를 유효성을 검사합니다. 연구에서 RR의 orthologs를 인코딩 관련 종의 게놈을 스캔 모티브를 사용하고,뿐만 아니라 그 종을 대상으로 유전자를 예측하고있다. 얻어진 유전자 타겟에 기초하여, RR과 orthologs의 생리적 기능은 예측 될 수있다. 그림 수정하고 창조적 인 C를 사용하여 다시 인쇄ommons 7에서 라이센스.

<table><tbody><tr><td>HisTrapFF 컬럼(Ni-Sepharose 컬럼)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (FPLC instrument)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 탈염 컬럼</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel extraction kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>비오틴 표지 올리고뉴클레오티드</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6% 폴리아크릴아미드-0.5x TBE 프리캐스트 미니 DNA 지연 젤</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>EC63652BOX</td><td>또는 자신의 젤을 부을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>나일론 멤브레인</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-dry 전기영동 전사 세포</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>매우 두꺼운 블롯 페이퍼, 8 x 13.5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker 모델 XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>핵산 화학발광 검출 키트(피어스)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 아가로스 수지</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DEA, USA</td> DNA Perfecta Sybr Green SuperMix<td>의</td><td></td>정량화를 위해</tr><tr><td>, ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td>과 함께 <td>모든 Sybr Green PCR 믹스를 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>qPCR용 PlateMax 울트라 클리어 열 밀봉 필름</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>96-well clear low profile PCR microplate</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>4376600</td><td>모든 real time PCR 시스템을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28104</td><td>모든 PCR 클린업 키트를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Cy3/Cy5 표지 노나머</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3'-5' exo-</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>하이브리드화 시스템</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td>이 회사는 더 이상 어레이 또는 관련 품목을 만들지 않으므로 Agilent 또는 Affymetrix와 같은 대체 소스를 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>맞춤형 인쇄 마이크로어레이 및 믹서</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>하이브리드화 키트(2x 하이브리드화 버퍼, 하이브리드화 구성 요소 A, 정렬 올리고)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>세척 버퍼 키트(10x 워시 버퍼 I, II, III, 1M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, 매디슨, 위스콘신, 미국</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A 마이크로어레이 스캐너</td><td>분자 장치, Sunnyvale CA, 미국</td><td>이 모델은 우수한 것들</td><td></td>로 대체되었습니다</tr><tr><td>GenePix Pro microarray software</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, ChIP 칩 분석 소프트웨어</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

세균에 대한 두 개의 구성 요소 규제 시스템을 유전자 표적을 확인하는 dna 친화력 - 정제 칩 (dap-칩) 방법

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

이러한 칩 칩으로 생체 방법에서 전사 인자 글로벌 유전자 목표를 결정하는 데 사용 잘 확립 기술은 다음과 같습니다. 그러나, 그들은에 uncharacterized 활성화 조건 세균성 두 구성 요소 규제 시스템을 탐험에 사용이 제한됩니다. 독특한 신호들의 존재하에 활성화 된 때, 그러한 시스템에만 전사를 조절한다. 이들 신호는 종종 알 수 있기 때문에,이 비디오 문서에 설명 된 시험 관내 마이크로 어레이 기반의 방법은 유전자 표적 및 응답 레귤레이터 결합 부위를 결정하기 위하여 사용될 수있다. 이것은 DNA-친 화성 정제 칩 방법은 시퀀스 된 게놈 어떤 유기체 어떠한 레귤레이터 정제에 사용될 수있다. 프로토콜은 정제 태그 단백질은 사용자 정의 타일 배열에 DNA와 하이브리드의 형광 표지 다음에 단백질 바인딩 DNA를 깎인 게놈 DNA에 결합하고 친화력 정화 할 수 있도록 포함한다. 이 사양에 대한 분석을 최적화하기 위해 사용될 수있다 같이 전일C 규제도 설명되어 있습니다. 어레이 데이터 분석에 의해 생성 된 피크 후 실험적으로 검증되는 결합 부위 모티프를 예측하는 데 사용된다. 모티프 예측 더욱 밀접한 관련 종 orthologous 반응 조절제의 유전자 표적을 결정하기 위하여 사용될 수있다. 우리는 유전자의 목표를 ​​결정하고 사이트의 모티브를 결합함으로써 환경 박테리아 Desulfovibrio 심상 성 Hildenborough에서 sigma54 의존 응답 레귤레이터 DVU3023의 기능을 예측하여이 방법의 적용 가능성을 보여줍니다.

상기 방법은 Desulfovibrio 불가리스 Hildenborough 7 박테리아를 감소 모델 황산에서의 RR 해외 유전자 표적을 결정하기 위해 적용 하였다. 이 유기체가 그것을 감지에 응답 가능한 신호의 다양한 나타내는 70의 RR로 표현 TCSS의 다수가 있습니다. 생체 이러한 경보 시스템의 기능을 분석하고 자신의 신호 때문에 수행하기 어렵고 따라서 자신의 활성화 조건입니다 알 수 있습니다. 여기서 DAP - 칩 방법은 유전자 표적을 결정하고, 따라서 대표적인 RR의 DVU3023 가능한 기능을 예측하는 데 사용되었다. DVU3023는 동족 HK (그림 3A)이 오페론으로 인코딩 된 시그마 54-따라 RR입니다. C-말단 그의 태그가 유전자에 복제 및 E.에서 정제 대장균. 초기 목표 결정의 경우, 정제 RR은 10 유전자 오페론 (DVU3025-3035)으...

이 비디오 문서는 두 개의 구성 요소 시스템 응답 레귤레이터 유전자 표적 및 결합 부위를 결정하기 위해 시험 관내 마이크로 어레이 기반의 방법을 설명한다.

세균에 대한 두 개의 구성 요소 규제 시스템을 유전자 표적을 확인하는 DNA 친화력 - 정제 칩 (DAP-칩) 방법

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

다음 실험의 전반적인 목표는 인 비트로(in vitro) 마이크로어레이 기반 분석법을 사용하여 박테리아 이성분 반응 조절자의 게놈 결합 부위를 결정하는 것입니다. 이는 태그가 붙은 반응 조절자 단백질을 클로닝 및 정제하고, 인 비트로 인산화를 통해 이를 활성화하며, 전기영동 이동성 변화 분석(EMSA)을 통해 하나의 표적 유전자를 결정하여 이후의 마이크로어레이 단계에서 양성 대조군으로 사용하는 방식으로 수행됩니다. 두 번째 단계로, 정제된 반응 조절자 단백질을 게놈 DNA와 혼합하며, 이를 통해 친화성 정제법을 사용하여 단백질이 결합된 DNA를 입력 DNA로부터 분리할 수 있습니다.다음으로, 단백질 결합 DNA와 입력 DNA를 증폭한 후, 단백질 결합 분획에서 양성 대조군 표적 유전자의 농축 여부를 QPCR로 검증하고, 형광 표지를 한 뒤 함께 모아 타일링 마이크로어레이에 하이브리드화합니다. 반응 조절자의 게놈 결합 부위를 결정하기 위해, 결과에서는 연구 대상 반응 조절 la에 의해 조절될 가능성이 가장 높은 유전자들을 보여주며, 이 결과는 전기영동 이동성 변화 분석(electrophoretic mobility shift assays)을 통해 추가로 검증될 수 있습니다. in vivo 칩-칩(chip-chip)과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 이성분계(two component systems)의 활성화 신호와 조건을 알지 못하는 경우에도 사용할 수 있다는 점입니다.대부분의 반응 조절 인자들이 알려지지 않은 표적 유전자를 가지고 있기 때문에, 본 방법은 박테리아 신호 전달 분야에서 매우 중요하며 복잡한 조절 네트워크를 밝히는 데 도움이 됩니다. 본 실험 과정은 저희 연구실의 연구 보조원인 Amy Chen이 시연하겠습니다. 본 절차를 시작하기 전에.클로닝된 DVU 3 0 2 3 유전자 혼합물로부터 발현된 rr, 구체적으로 DVU 3 0 2 3 단백질을 정제하십시오. 완충 용액 내에서 0.5 picomoles의 DVU 3 0 2 3 단백질과 이전에 준비된 100 fent moles의 인산화된 DNA 기질을 혼합하여 최종 부피를 20 microliters로 맞춥니다. 단백질을 넣지 않은 대조군 반응액을 설정한 후, 모든 반응액을 벤치 위 실온에서 20분 동안 배양하십시오.배양 후, 결합 반응액에 5 x 로딩 버퍼 5 µL를 추가합니다. 이전에 준비한 mini 6% poly acrylamide 0.5 XTBE 젤에 각 반응액 18 µL를 로딩하고 100 V에서 2시간 동안 전기영동합니다. 전기영동이 완료되면, 젤 크기에 맞게 자른 전하를 띤 나일론 막을 0.5 XTBE에 최소 10분 동안 담급니다. 그런 다음 카세트에서 젤을 제거합니다.겔의 돌출된 부분을 잘라내고, 0.5 XTBE에 적신 두 장의 두꺼운 여과지 사이에 겔과 멤브레인을 샌드위치처럼 끼웁니다. 이를 세미드라이 블로팅 장치에 넣고 20V에서 30분 동안 가동합니다. 그 후, 화학발광 검출 키트를 사용하여 블롯을 현상한 다음, 멤브레인을 상용 UV light crosslinker 장비에 넣고 시간을 3분으로 설정하며, CCD 카메라가 연결된 컴퓨터를 사용하여 이미지를 획득합니다.rr 존재 하에서 DNA 기질의 이동도 변화를 확인하며, 이는 RR이 테스트 중인 DNA에 결합했음을 나타냅니다. 다음으로, 완충 용액 내에서 2~3 µg의 공유 게놈 DNA를 0.5 pmol의 DVU 3 0 2 3와 혼합하십시오. 반응물을 25 °C에서 30분 동안 배양한 후, 이 중 10 µL를 1.5 mL 튜브로 옮기고 이를 input DNA로 표시하십시오.0.6 mL 마이크로 원심분리 튜브에 30 µL의 nickel NTA aros 수지를 넣습니다. 샘플을 100 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 수지가 튜브 바닥에 모이도록 합니다. 그 다음 상층액을 제거합니다.세척 버퍼 100 µL를 넣고 튜브를 튕겨 내용물을 섞습니다. 원심분리 후, 100 Gs로 2분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 남은 90 µL의 결합 반응액을 니켈 NTA 레진 세척액에 추가합니다.그 다음 샘플을 회전 쉐이커에서 30분 동안 배양합니다. 완료되면, 샘플을 100 Gs에서 2분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 세척 단계를 3회 더 반복합니다.다음으로 35 µL의 elution buffer를 레진에 추가하고 볼텍싱하여 섞습니다. 샘플을 벤치 위 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 단백질 결합 DNA 분획으로 표시합니다.그 다음, 입력 DNA 및 단백질 결합 DNA 분획의 정제 후, 입력 DNA에 35 µL의 용출 버퍼를 첨가합니다. 각각 10 µL씩 별도의 PCR 튜브에 넣습니다. 그 후 각 샘플에 10x 단편화 버퍼 1 µL, 라이브러리 제작 버퍼 2 µL 및 라이브러리 안정화 용액 1 µL를 첨가하고, 볼텍싱하여 샘플을 잘 섞어줍니다.샘플을 써멀 사이클러(thermal cycler)에서 95 °C로 2분 동안 가열하십시오. 완료 후, 샘플을 얼음 위에 놓아 냉각시킵니다. 다음으로, 라이브러리 제작 효소 1 µL를 샘플에 첨가하고 피펫팅하여 혼합하십시오.시료를 써멀 사이클러에서 배양합니다. 배양 후, 각 튜브에 47.5 µL의 물, 7.5 µL의 10x 증폭 마스터 믹스, 그리고 5 µL의 중합효소를 첨가합니다. 시료가 혼합되면 써멀 사이클러에서 가열합니다.이전에 설계한 각 프라이머 세트에 대해 1x 마스터 믹스를 준비하여 각 DNA 템플릿당 3회 반복 QPCR 반응을 설정합니다. 그 다음 96-well PCR 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 18 µL를 분주합니다. 증폭 및 정제된 입력 DNA와 단백질 결합 DNA 샘플을 증류수로 5 ng/µL가 되도록 희석하고, 각 샘플 2 µL를 웰에 첨가합니다. 이어서 UltraClear QPCR 실링 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.플레이트를 원심분리기에서 200 GS로 1분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 실시간 QPCR 기기에 넣고 사이클을 돌려, 입력 DNA는 s si three로, 농축 DNA는 sci five로 라벨링하기 위해 다음 조건을 사용합니다. 1 µg의 DNA를 40 µL의 S3 SCI-FI 라벨링된 9-mer와 혼합하고, 물을 사용하여 최종 부피를 80 µL로 맞춥니다. 열 순환기(thermal cycler)를 사용하여 암소 상태에서 98 °C로 10분 동안 샘플을 변성시킵니다.완료 후, 샘플을 얼음 위에서 2분 동안 빠르게 냉각하고, 각 반응액에 2 µL의 3' 5' exo polymerase, 5 mM의 deoxy nucleotide triphosphates, 그리고 8 µL의 물을 첨가합니다. 혼합 후, 서멀 사이클러(thermal cycler)를 사용하여 37 °C에서 2시간 동안 암소 보관하며 배양합니다. 이때, EDTA를 50 mM까지 첨가하여 반응을 중단시키고, sodium chloride 용액을 0.5 M까지 첨가합니다.그 다음 10분 동안 암소에서 배양한 후, 0.9 부피의 isopropanol이 들어있는 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 샘플을 12,000 GS에서 10분 동안 원심분리합니다. S3 및 sci-fi 표지 DNA를 각각 6 micrograms씩 1.5 milliliter 튜브에 모으고, 원심분리기 뚜껑이 투명한 경우 이를 덮어 암소에서 낮은 열로 원심분리기 내에서 진공 건조합니다.펠렛이 건조되면 5 µL의 물에 현탁합니다. 그 다음 15초 동안 볼텍싱한 샘플에 미리 준비한 1x 하이브리다이제이션 용액 마스터 믹스 13 µL를 첨가하고, 드라이 배스(dry bath)에서 95 °C로 5분 동안 인큐베이션합니다. 샘플을 드라이 배스에서 꺼내 로딩 준비가 될 때까지 42 °C의 하이브리다이제이션 시스템에 둡니다.다음으로, 이전에 준비한 믹서 슬라이드 어셈블리를 하이브리드화 시스템 내에 배치합니다. 충전 포트에 16 µL의 시료를 주입합니다. 그런 다음 포트를 접착 필름으로 밀봉하고 시스템의 혼합 기능을 켭니다. 이후 42 °C에서 16~20시간 동안 하이브리드화합니다.믹서를 슬라이드하고, 이를 분해 도구에 끼운 뒤 따뜻한 버퍼가 담긴 디쉬 안에 넣습니다. 믹서를 떼어내면서 분해 도구를 격렬하게 흔듭니다. 슬라이드를 50 milliliters의 세척 버퍼 1이 담긴 용기에 넣고 2분 동안 격렬하게 흔듭니다.그 후 50 milliliters의 세척 버퍼 2와 50 milliliters의 세척 버퍼 3로 이전 단계를 반복합니다 RRR DVU 3 0 2 3 shifted. DVU 3 0 2 5 QPCR의 상류 영역 분석 결과, DVU 3 0 2 5 상류 영역이 입력 DNA에 비해 단백질 결합 분획에서 농축되어 있음을 확인하였으며, 이는 결합 조건이 DVU 3 0 2 3에 적절했음을 나타냅니다. DVU 0 0 1 3은 음성 대조군으로 사용되었습니다. DAP chipp 분석 후 얻은 상위 4개 피크를 DV 3 0 2 3의 가장 가능성 높은 표적으로 선정하였습니다.양성 표적 DVU 3 0 2 5는 가장 높은 점수로 얻은 첫 번째 피크였습니다. 두 개의 유전자 표적은 ly로 인코딩된 다른 두 개의 젖산 투과효소(lactate permease)입니다. 네 번째 유전자 표적은 상위 지역이 아니라, 두 개의 수렴 전사 유전자 사이의 유전자 간 지역에 위치하며, DAP 칩 meme를 통해 얻은 표적의 상위 지역을 사용하여 결합 부위 모티프를 예측하였습니다.모티프 내의 보존된 염기들을 치환하여 결합 이동이 사라지는 것을 확인함으로써 해당 모티프를 추가로 검증하였습니다. 검증된 모티프를 사용하여 DVU 3 0 2 3 오솔로그 유전자좌를 가진 다른 황산염 환원 세균의 게놈을 스캔하였으며, 자가 rs에 대해 예측된 모티프 서열을 이용해 오픈 리딩 프레임의 상위 영역에서 모티프가 발견된 경우를 잠재적 표적 유전자로 선정하였습니다. 그 결과 Divo Garris Hilton Burrow의 것과 매우 유사한 합의 결합 부위 모티프가 생성되었습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 조절 단백질의 유전자 표적을 결정하기 위해 Daptive 방법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 단백질을 정제할 수 있고 게놈 서열을 알고 있다면 어떤 조절 단백질의 결합 크기도 분석하는 데 활용될 수 있습니다.

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

이 비디오는 RNA 결합 단백질(RBP)과 RNA의 상호 작용을 연구하기 위한 박테리아의 생체 내 분석을 보여줍니다. 박테리아 세포는 두 개의 플라스미드 구조(RBP 결합 부위의 다운스트림에 있는 형광 리포터 유전자를 포함하는 mRNA를 인코딩하는 결합 부위 플라스미드)로 형질전환되는 반면, RBP 플라스미드는 유도체의 제어 하에 RBP 단백질을 발현합니다. RBP 생산의 유도자 매개 증가에 따라 RBP는 mRNA에 결합하여 리보솜 결합 억제를 통해 리포터의 번역 억제를 초래합니다.

표적 유전자의 번역 조절을 연구하기 위한 Reporter Gene Repression Assay

이 비디오는 항체 마이크로어레이 칩을 사용하여 환경 샘플에서 시아노박테리아 균주를 검출하는 방법을 보여줍니다. 다양한 박테리아를 운반하는 샘플은 인쇄된 항체와 상호 작용하며, 형광단으로 표지된 항시아노박테리아 균주 항체로 면역염색하면 뚜렷한 반점에서 형광을 통해 특정 시아노박테리아 균주의 존재를 확인할 수 있습니다.

항체 마이크로어레이 칩을 이용하여 시아노박테리아 균주를 검출하는 기술

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칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

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DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

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