세균에 대한 두 개의 구성 요소 규제 시스템을 유전자 표적을 확인하는 DNA 친화력 - 정제 칩 (DAP-칩) 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 인 비트로(in vitro) 마이크로어레이 기반 분석법을 사용하여 박테리아 이성분 반응 조절자의 게놈 결합 부위를 결정하는 것입니다. 이는 태그가 붙은 반응 조절자 단백질을 클로닝 및 정제하고, 인 비트로 인산화를 통해 이를 활성화하며, 전기영동 이동성 변화 분석(EMSA)을 통해 하나의 표적 유전자를 결정하여 이후의 마이크로어레이 단계에서 양성 대조군으로 사용하는 방식으로 수행됩니다. 두 번째 단계로, 정제된 반응 조절자 단백질을 게놈 DNA와 혼합하며, 이를 통해 친화성 정제법을 사용하여 단백질이 결합된 DNA를 입력 DNA로부터 분리할 수 있습니다.

다음으로, 단백질 결합 DNA와 입력 DNA를 증폭한 후, 단백질 결합 분획에서 양성 대조군 표적 유전자의 농축 여부를 QPCR로 검증하고, 형광 표지를 한 뒤 함께 모아 타일링 마이크로어레이에 하이브리드화합니다. 반응 조절자의 게놈 결합 부위를 결정하기 위해, 결과에서는 연구 대상 반응 조절 la에 의해 조절될 가능성이 가장 높은 유전자들을 보여주며, 이 결과는 전기영동 이동성 변화 분석(electrophoretic mobility shift assays)을 통해 추가로 검증될 수 있습니다. in vivo 칩-칩(chip-chip)과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 이성분계(two component systems)의 활성화 신호와 조건을 알지 못하는 경우에도 사용할 수 있다는 점입니다.

대부분의 반응 조절 인자들이 알려지지 않은 표적 유전자를 가지고 있기 때문에, 본 방법은 박테리아 신호 전달 분야에서 매우 중요하며 복잡한 조절 네트워크를 밝히는 데 도움이 됩니다. 본 실험 과정은 저희 연구실의 연구 보조원인 Amy Chen이 시연하겠습니다. 본 절차를 시작하기 전에.

클로닝된 DVU 3 0 2 3 유전자 혼합물로부터 발현된 rr, 구체적으로 DVU 3 0 2 3 단백질을 정제하십시오. 완충 용액 내에서 0.5 picomoles의 DVU 3 0 2 3 단백질과 이전에 준비된 100 fent moles의 인산화된 DNA 기질을 혼합하여 최종 부피를 20 microliters로 맞춥니다. 단백질을 넣지 않은 대조군 반응액을 설정한 후, 모든 반응액을 벤치 위 실온에서 20분 동안 배양하십시오.

배양 후, 결합 반응액에 5 x 로딩 버퍼 5 µL를 추가합니다. 이전에 준비한 mini 6% poly acrylamide 0.5 XTBE 젤에 각 반응액 18 µL를 로딩하고 100 V에서 2시간 동안 전기영동합니다. 전기영동이 완료되면, 젤 크기에 맞게 자른 전하를 띤 나일론 막을 0.5 XTBE에 최소 10분 동안 담급니다. 그런 다음 카세트에서 젤을 제거합니다.

겔의 돌출된 부분을 잘라내고, 0.5 XTBE에 적신 두 장의 두꺼운 여과지 사이에 겔과 멤브레인을 샌드위치처럼 끼웁니다. 이를 세미드라이 블로팅 장치에 넣고 20V에서 30분 동안 가동합니다. 그 후, 화학발광 검출 키트를 사용하여 블롯을 현상한 다음, 멤브레인을 상용 UV light crosslinker 장비에 넣고 시간을 3분으로 설정하며, CCD 카메라가 연결된 컴퓨터를 사용하여 이미지를 획득합니다.

rr 존재 하에서 DNA 기질의 이동도 변화를 확인하며, 이는 RR이 테스트 중인 DNA에 결합했음을 나타냅니다. 다음으로, 완충 용액 내에서 2~3 µg의 공유 게놈 DNA를 0.5 pmol의 DVU 3 0 2 3와 혼합하십시오. 반응물을 25 °C에서 30분 동안 배양한 후, 이 중 10 µL를 1.5 mL 튜브로 옮기고 이를 input DNA로 표시하십시오.

0.6 mL 마이크로 원심분리 튜브에 30 µL의 nickel NTA aros 수지를 넣습니다. 샘플을 100 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 수지가 튜브 바닥에 모이도록 합니다. 그 다음 상층액을 제거합니다.

세척 버퍼 100 µL를 넣고 튜브를 튕겨 내용물을 섞습니다. 원심분리 후, 100 Gs로 2분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 남은 90 µL의 결합 반응액을 니켈 NTA 레진 세척액에 추가합니다.

그 다음 샘플을 회전 쉐이커에서 30분 동안 배양합니다. 완료되면, 샘플을 100 Gs에서 2분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 세척 단계를 3회 더 반복합니다.

다음으로 35 µL의 elution buffer를 레진에 추가하고 볼텍싱하여 섞습니다. 샘플을 벤치 위 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 단백질 결합 DNA 분획으로 표시합니다.

그 다음, 입력 DNA 및 단백질 결합 DNA 분획의 정제 후, 입력 DNA에 35 µL의 용출 버퍼를 첨가합니다. 각각 10 µL씩 별도의 PCR 튜브에 넣습니다. 그 후 각 샘플에 10x 단편화 버퍼 1 µL, 라이브러리 제작 버퍼 2 µL 및 라이브러리 안정화 용액 1 µL를 첨가하고, 볼텍싱하여 샘플을 잘 섞어줍니다.

샘플을 써멀 사이클러(thermal cycler)에서 95 °C로 2분 동안 가열하십시오. 완료 후, 샘플을 얼음 위에 놓아 냉각시킵니다. 다음으로, 라이브러리 제작 효소 1 µL를 샘플에 첨가하고 피펫팅하여 혼합하십시오.

시료를 써멀 사이클러에서 배양합니다. 배양 후, 각 튜브에 47.5 µL의 물, 7.5 µL의 10x 증폭 마스터 믹스, 그리고 5 µL의 중합효소를 첨가합니다. 시료가 혼합되면 써멀 사이클러에서 가열합니다.

이전에 설계한 각 프라이머 세트에 대해 1x 마스터 믹스를 준비하여 각 DNA 템플릿당 3회 반복 QPCR 반응을 설정합니다. 그 다음 96-well PCR 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 18 µL를 분주합니다. 증폭 및 정제된 입력 DNA와 단백질 결합 DNA 샘플을 증류수로 5 ng/µL가 되도록 희석하고, 각 샘플 2 µL를 웰에 첨가합니다. 이어서 UltraClear QPCR 실링 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.

플레이트를 원심분리기에서 200 GS로 1분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 실시간 QPCR 기기에 넣고 사이클을 돌려, 입력 DNA는 s si three로, 농축 DNA는 sci five로 라벨링하기 위해 다음 조건을 사용합니다. 1 µg의 DNA를 40 µL의 S3 SCI-FI 라벨링된 9-mer와 혼합하고, 물을 사용하여 최종 부피를 80 µL로 맞춥니다. 열 순환기(thermal cycler)를 사용하여 암소 상태에서 98 °C로 10분 동안 샘플을 변성시킵니다.

완료 후, 샘플을 얼음 위에서 2분 동안 빠르게 냉각하고, 각 반응액에 2 µL의 3' 5' exo polymerase, 5 mM의 deoxy nucleotide triphosphates, 그리고 8 µL의 물을 첨가합니다. 혼합 후, 서멀 사이클러(thermal cycler)를 사용하여 37 °C에서 2시간 동안 암소 보관하며 배양합니다. 이때, EDTA를 50 mM까지 첨가하여 반응을 중단시키고, sodium chloride 용액을 0.5 M까지 첨가합니다.

그 다음 10분 동안 암소에서 배양한 후, 0.9 부피의 isopropanol이 들어있는 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 샘플을 12,000 GS에서 10분 동안 원심분리합니다. S3 및 sci-fi 표지 DNA를 각각 6 micrograms씩 1.5 milliliter 튜브에 모으고, 원심분리기 뚜껑이 투명한 경우 이를 덮어 암소에서 낮은 열로 원심분리기 내에서 진공 건조합니다.

펠렛이 건조되면 5 µL의 물에 현탁합니다. 그 다음 15초 동안 볼텍싱한 샘플에 미리 준비한 1x 하이브리다이제이션 용액 마스터 믹스 13 µL를 첨가하고, 드라이 배스(dry bath)에서 95 °C로 5분 동안 인큐베이션합니다. 샘플을 드라이 배스에서 꺼내 로딩 준비가 될 때까지 42 °C의 하이브리다이제이션 시스템에 둡니다.

다음으로, 이전에 준비한 믹서 슬라이드 어셈블리를 하이브리드화 시스템 내에 배치합니다. 충전 포트에 16 µL의 시료를 주입합니다. 그런 다음 포트를 접착 필름으로 밀봉하고 시스템의 혼합 기능을 켭니다. 이후 42 °C에서 16~20시간 동안 하이브리드화합니다.

믹서를 슬라이드하고, 이를 분해 도구에 끼운 뒤 따뜻한 버퍼가 담긴 디쉬 안에 넣습니다. 믹서를 떼어내면서 분해 도구를 격렬하게 흔듭니다. 슬라이드를 50 milliliters의 세척 버퍼 1이 담긴 용기에 넣고 2분 동안 격렬하게 흔듭니다.

그 후 50 milliliters의 세척 버퍼 2와 50 milliliters의 세척 버퍼 3로 이전 단계를 반복합니다 RRR DVU 3 0 2 3 shifted. DVU 3 0 2 5 QPCR의 상류 영역 분석 결과, DVU 3 0 2 5 상류 영역이 입력 DNA에 비해 단백질 결합 분획에서 농축되어 있음을 확인하였으며, 이는 결합 조건이 DVU 3 0 2 3에 적절했음을 나타냅니다. DVU 0 0 1 3은 음성 대조군으로 사용되었습니다. DAP chipp 분석 후 얻은 상위 4개 피크를 DV 3 0 2 3의 가장 가능성 높은 표적으로 선정하였습니다.

양성 표적 DVU 3 0 2 5는 가장 높은 점수로 얻은 첫 번째 피크였습니다. 두 개의 유전자 표적은 ly로 인코딩된 다른 두 개의 젖산 투과효소(lactate permease)입니다. 네 번째 유전자 표적은 상위 지역이 아니라, 두 개의 수렴 전사 유전자 사이의 유전자 간 지역에 위치하며, DAP 칩 meme를 통해 얻은 표적의 상위 지역을 사용하여 결합 부위 모티프를 예측하였습니다.

모티프 내의 보존된 염기들을 치환하여 결합 이동이 사라지는 것을 확인함으로써 해당 모티프를 추가로 검증하였습니다. 검증된 모티프를 사용하여 DVU 3 0 2 3 오솔로그 유전자좌를 가진 다른 황산염 환원 세균의 게놈을 스캔하였으며, 자가 rs에 대해 예측된 모티프 서열을 이용해 오픈 리딩 프레임의 상위 영역에서 모티프가 발견된 경우를 잠재적 표적 유전자로 선정하였습니다. 그 결과 Divo Garris Hilton Burrow의 것과 매우 유사한 합의 결합 부위 모티프가 생성되었습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 조절 단백질의 유전자 표적을 결정하기 위해 Daptive 방법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 단백질을 정제할 수 있고 게놈 서열을 알고 있다면 어떤 조절 단백질의 결합 크기도 분석하는 데 활용될 수 있습니다.