테스트 시각 기능에 대한 간단한 행동 분석

본 실험 절차의 전반적인 목적은 올챙이가 테스트 수조의 검은색으로 덮인 절반 영역에서 머무는 시간을 기록함으로써 올챙이의 시각 기능을 테스트하는 것입니다. 이를 위해 먼저 올챙이를 45~50단계까지 성장시킵니다. 두 번째 단계는 행동 분석을 위해 절반은 검은색, 절반은 흰색으로 구성된 수조와 카메라를 설치하는 것입니다.

다음으로 올챙이가 들어 있는 두 번째 수조를 외부 수조 안에 넣습니다. 각 올챙이에 대해 주변 환경의 배경이 바뀜에 따라 나타나는 시각 유도 행동을 기록합니다. 마지막 단계로 올챙이의 망막 적출술을 시행한 후 행동 분석법을 반복합니다.

최종적으로, 이 간단하고 저렴한 분석법에서 얻은 데이터는 광학적 시각(phototop vision) 테스트 하에서 올챙이가 수조의 한쪽 방향으로 수영하는 것을 더 선호한다는 것을 보여주는 데 사용됩니다. 시각 운동 반응(optic kinetic response)이나 꼬리 뒤집기 분석(tail flip assay)과 같은 다른 기술보다 이 방법을 사용할 때의 주요 장점은, 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 장비를 사용하는 저렴하고 간단한 방법이라는 점입니다. 올챙이를 준비하려면, 먼저 수정된 xenopus 배아를 확보하고, 60 mm 페트리 접시에 50 µg/mL 농도로 10배 희석한 mark's, modified ringers 또는 MMR을 넣습니다.

젠타마이신(Gentamycin) 항생제를 처리한 포배기(blastula)부터 신경판(neural plate) 단계의 배아를 준비합니다. 배아를 페트리 접시에서 18°C로 유지하며 2단계에서 15단계까지 배양합니다. 배아가 약 27~30단계의 신경배(neurula) 단계에 도달하면, 장내 세균 성장을 유도하기 위해 항생제가 포함되지 않은 0.1 XMMR 배지로 교체합니다.

올챙이가 45단계 전후의 먹이 섭취 단계에 도달하면, 0.1 XMMR이 담긴 100 millimeter 페트리 접시로 옮깁니다. 다음 날, 쐐기풀 가루 상층액을 먹이로 제공합니다. 100 millimeter 페트리 접시에서 일주일이 지나면, 0.5갤런 수조에 frog water를 채웁니다.

동물들을 수조로 옮기고 쐐기풀 분말 상층액 급여 일정을 계속 유지하되, 물 교체는 일주일에 2~3회만 수행합니다. 동물들을 0.5갤런 수조에서 사육할 때는 오전 6시에 점등되는 12시간 명기/12시간 암기 주기를 유지합니다. 테스트 전에는 피실험체가 들어 있는 0.5갤런 수조를 흰색 표면 위에 두고 테스트 시작 전까지 최소 12시간 동안 하룻밤 동안 유지합니다. 행동 분석법은 표준 형광등 조명이 설치된 조용하고 통행량이 적은 구역에서 수행해야 합니다.

내부 탱크가 될 탱크의 외부 모서리 부분에 겹쳐 놓을 0.5갤런 용량의 테스트 탱크 두 개를 준비하십시오. 샤피(Sharpie) 마커를 사용하여 바닥에서 5 cm 높이에 수위선을 표시하십시오. 또한 내부 탱크의 경우, 내부의 움푹 들어간 부분이 있는지 확인하십시오.

올챙이가 그 안에 머무는 것을 방지하기 위해 비활성 화합물로 이를 채웁니다. 이제 두 번째 외부 수조에 주목하십시오. 다음 단계를 위해 검은색 전기 테이프와 흰색 티슈 페이퍼를 준비합니다.

여기서 보여주는 것처럼 테이프를 사용하여 탱크 한쪽 외부를 덮고, 조직지를 사용하여 나머지 반대쪽 외부를 덮습니다. 탱크 준비가 완료되면 접종용 턴테이블을 설치하고 그 위에 중첩된 탱크들을 배치합니다. 카메라가 탱크 내부를 위에서 촬영할 수 있도록 삼각대와 웹캠을 배치합니다.

비디오 캡처 및 재생 소프트웨어가 설치된 컴퓨터에 웹캠을 연결하십시오. 카메라 전원을 켜고 새로운 동영상 녹화를 준비합니다. 그다음 카메라와 수조 위에 가벼운 면 천을 덮으십시오.

올챙이에 전달되는 외부 자극을 줄이기 위해, 조도계를 사용하여 천 아래의 조도가 35에서 50 candles per square meter 사이인지 확인하십시오. 내부 테스트 수조를 꺼내어 행동 분석 시험을 시작하십시오. 수조의 5 cm 표시선까지 개구리 전용수를 채우십시오.

그물을 사용하여 동물을 0.5갤런 용기에서 컴퓨터에 연결된 내부 테스트 수조로 옮깁니다. 기록 보관을 위해 녹화 소프트웨어가 실행 중이며 테스트 구역을 녹화하고 있는지 확인하십시오. 종이에 동물의 이름, 날짜 및 시간을 기입하십시오.

녹화를 위해 이것을 카메라 아래에 배치하십시오. 배치가 완료되면 타이머를 2분으로 설정하십시오. 다음으로, 검은색 면이 오른쪽에 오도록 턴테이블 위에 외부 탱크를 배치하십시오.

이제 테스트 탱크를 외부 탱크 안에 넣습니다. 기록 구역에서 가림막을 닫고 컴퓨터 화면을 통해 외부 탱크의 방향을 확인합니다. 비디오가 녹화되고 있는지 확인한 후 타이머를 시작합니다.

타이머가 울리면 드레이프를 그대로 둔 채 내부 테스트 탱크를 꺼냅니다. 다음으로 외부 탱크를 180도 회전시켜 검은색 면이 왼쪽으로 오게 합니다. 테스트 탱크를 다시 외부 탱크에 넣고 2분 타이머를 시작합니다.

다시 내부 탱크를 제거합니다. 외부 탱크를 180도 회전시키고, 2분마다 내부 탱크를 교체하는 과정을 총 10회 반복합니다. 완료되면 비디오 녹화를 중단하십시오.

올챙이를 0.5갤런 용량의 탱크로 되돌려 놓습니다. 레티놀 절제술(retinol ex sodomy)을 수행하기 위해 현미경을 준비합니다. 60mm 페트리 접시에 0.1 XMMR에 녹인 1%aros를 채우고 굳힙니다.

올챙이 크기에 맞게 아가로스(agarose)를 작은 직사각형 모양으로 잘라냅니다. 준비가 되면 실험 동물을 꺼내 0.02% Trica에 넣습니다. 3번 포셉으로 꼬리를 꼬집었을 때 반응이 없을 때까지 대기한 후 계속 진행합니다.

그 후 동물을 디쉬로 옮깁니다. 페트리 디쉬를 현미경 위에 올려놓습니다. 핀셋을 사용하여 한쪽에서 동물을 고정할 준비를 합니다.

반대편에서 25 gauge 바늘을 사용하여 눈의 등쪽 영역 뒤쪽 피부를 45도 각도로 찌른 다음, 5번 핀셋으로 구멍 안으로 조심스럽게 진입하여 옆에 있는 정맥을 피해 시신경을 절단합니다. 신경을 밖으로 젖혀 밀어내고 수술 후 핀셋을 제거합니다. 0.7 XMMR과 50 µg/mL가 포함된 100 mm 페트리 접시에 동물을 넣어 회복시킵니다.

Gentamycin으로 20분 동안 처리합니다. 그 후, 올챙이를 개구리 전용수로 채운 회복 수조로 옮깁니다. 테스트 준비를 위해 수조를 흰색 표면 위에 놓습니다.

동물을 하룻밤 동안 휴식하게 합니다. 다음 날 아침, 행동 분석법을 사용하여 시각 기능을 테스트합니다. 이 영상은 실험의 대표 데이터를 보여줍니다.

왼쪽은 수술 전의 동물들이며, 오른쪽은 양쪽 눈의 망막 축삭을 모두 절단한 후의 동일한 동물들입니다. 이는 하단 모서리의 모식도로 표시되어 있습니다. 물을 흔들어 동물들을 검은색 쪽에서 멀어지게 하거나 흰색 쪽으로 끌어당기는 물질이 전혀 첨가되지 않았음을 보여주었습니다.

수술 전 올챙이는 30초 이내에 배경색에 반응하는 반면, 맹視 올챙이는 수조 안을 목적 없이 헤엄칩니다. 이 차트는 세 가지 조건에서 단일 개체가 흰색 및 검은색 영역에서 보낸 시간의 백분율을 보여줍니다. 먼저, 어떠한 수술도 받기 전의 개체를 해당 분석법을 사용하여 관찰하였습니다.

우측 시신경을 절단한 후 이틀 연속으로, 이틀간의 테스트를 통해 행동을 관찰하였습니다. 마지막으로 양측 시신경을 모두 절단한 후, 해당 분석법으로 이틀 더 관찰을 진행하였습니다. 적어도 하나의 시신경이 온전할 때 동물은 수조의 흰색 쪽에서 더 많은 시간을 보냈습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 대부분의 개구리 실험실에 구비된 간단한 시약과 장비를 사용하여 올챙이의 시력을 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.