재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 배아 섬유아세포를 재프로그래밍하는 배양물로부터 희귀한 재프로그래밍 중간체를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 재프로그래밍 가능한 마우스 균주의 E 13.5 배아에서 마우스 배아 섬유아세포를 유도함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 저계대 마우스 배아 섬유아세포를 유도 만능 줄기 또는 독시사이클린이 보충된 IPS 세포 배지에 파종하여 재프로그래밍 과정을 시작합니다.

다음으로, 재프로그래밍(reprogramming) 중 선택된 시점에 세포를 수확하고 특정 세포 표면 마커에 대한 항체로 라벨링합니다. 궁극적으로, 희귀한 재프로그래밍 중간체는 추가 실험 분석을 위해 사실로 분리할 수 있습니다. 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 개체군의 대부분을 구성하는 재프로그래밍 과정에 불응하는 세포가 없는 경우 희귀한 재프로그래밍 중간체에 대해 기계론적 연구를 수행할 수 있다는 것입니다.마우스 배아를 생성하기 위해, 섬유아세포 또는 mes는 배아 일 13.5 자궁 뿔을 10ml의 무균 PBS를 포함하는 10cm 조직 배양 접시에 이식하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 멸균된 수술용 가위를 사용하여 뿔을 각각 하나의 배아가 들어 있는 개별 조각으로 자릅니다. 다음으로, 조직 배양 후드의 해부 현미경으로 멸균된 집게를 사용하여 각 배아를 둘러싼 자궁 외피와 여분의 배아막을 조심스럽게 제거하고 탈각된 배아를 10ml의 신선한 PBS가 담긴 개별 10cm 접시에 옮깁니다. 그런 다음 각 배아의 머리, 팔다리, 꼬리 및 내부 장기를 집게로 제거하여 진행합니다.

필요에 따라 유전형 분석을 위해 개별 1.5ml 튜브에 머리를 동결합니다. 각 몸통을 10cm 크기의 새로운 판으로 옮기고 두 개의 수술용 칼날을 사용하여 각 배아를 2분 동안 다집니다. 조직 조각을 200마이크로리터의 트립신 EDTA에 넣고 실온에서 3-5분 동안 소화한 다음 추가로 2분 동안 다지십시오.

그런 다음 2ml의 필로폰 배지로 tryin을 비활성화하고 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 세포 슬러리를 15ml 튜브로 옮깁니다. 또한 부드러운 피펫팅으로 조직을 기계적으로 해리한 다음 세포 용액을 젤라틴으로 코팅된 10cm 접시에 옮깁니다. 배양에 10밀리리터의 필로폰 매체를 추가로 첨가하십시오.

24시간에서 48시간 후, MEF를 다시 프로그래밍하기 위해 플레이트를 MEF로 조밀하게 덮어야 합니다.먼저 섭씨 37도의 수조에서 저계 냉동 필로폰 배양을 해동한 다음 내용물을 10ml의 예열 메스암페타 배지가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 세포를 스핀다운한 후 펠렛을 12ml의 신선한 메스암페타민 배지에 재현탁시키고 세포 현탁액을 젤라틴으로 코팅된 T 75 배양 용기로 옮깁니다. 24-48시간의 회복 기간 후, PBS로 MEF를 세척한 다음 섭씨 37도에서 3-5분 동안 3ml의 트립신 EDTA로 세포를 분리합니다.

그런 다음 5ml의 필로폰 배지로 효소 분해를 중지하고 10ml 피펫으로 부드럽게 혼합하여 세포를 추가로 해리합니다. 다음으로, 처음 6일 동안 독시사이클린(doxycycline)이 밀리리터당 2마이크로그램을 함유한 12밀리리터의 IPSC 배지에 있는 제곱센티미터당 세 번째 셀로 코팅된 T 75 플라스크를 6.7배로 코팅한 새로운 젤라틴에 세포를 파종하여 메츠를 다시 프로그래밍합니다. 격일로 배지를 새로운 독시사이클린이 보충된 IPSE 배지로 교체하고, 각 수확된 중간 현탁액에 대해 방금 설명한 바와 같이 트립신 EDTA 분리에 의해 필요한 시점에 재프로그래밍 중간체를 수확합니다.

PBS에서 세포를 씻습니다. 그런 다음 소생합니다. 항체 라벨링을 위해 펠릿을 팩스 매체에 현탁하여 완전히 재프로그래밍된 IPSC 배양을 확립합니다.

독시사이클린이 없는 IPSC 배지에서 세포를 추가로 4-7일 동안 성장시켜 재프로그래밍된 세포를 라벨링합니다. 수확된 중간체에 적절한 관심 항체를 표시합니다. 10분 후 튜브를 부드럽게 두드려 세포를 다시 현탁시킨 다음 튜브를 얼음 위에 10분 더 놓습니다.

두 번째 배양 후 튜브당 10ml의 차가운 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 상등액을 조심스럽게 흡인하고 얼음 위에 스트립핀 P 크기 7이 보충된 적절한 양의 라벨링 매체에 펠릿을 재현탁합니다. 20분 후, 또 다른 10개의 차가운 PBS로 세포를 세척하고 프로피듐 요오드화물이 보충된 라벨링 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.

70마이크로미터 스트레이너를 통해 현탁액을 통과시켜 세포 덩어리를 걸러낸 다음 세포를 얼음 위의 적절한 팩스 튜브로 옮깁니다. 보상 제어용. Resus는 800마이크로리터의 라벨링 버퍼에 방사선 조사된 mes에 유지되는 IPS 세포의 극저온 바이알을 현탁합니다.

라벨링되지 않은 대조군 제어를 위해 200마이크로리터의 세포를 따로 둡니다. 그런 다음 단일 색상 제어를 위해 나머지 세포 현탁액을 3개의 15 millil 튜브 사이에 분할하고 유세포 분석으로 중간체를 분석하기 위해 방금 설명한 대로 샘플에 라벨을 붙입니다. 먼저 전방 측면 산점도에 게이트를 설정하여 이물질을 제외합니다.

그런 다음 전방 산란 면적 대비 전방 산란 면적을 사용하여 집계와 PI 채널 대 전방 산란을 제외합니다. PI 음성 라이브 셀을 게이트합니다. 레이블이 지정되지 않은 셀을 사용하여 Pacific blue FITC 및 PSI 7개 채널의 전압을 조정합니다.

이상적으로는 세포 집단을 각 채널의 하단에 배치합니다. 다음으로, 라벨링되지 않은 대조 세포가 있는 게이트를 설정하여 재프로그래밍 배양을 3일, 6일, 9일로 세분화합니다. SSEA 1 개의 음성 TH 1.2 양성 세포, SSEA 1 개의 음성 TH 1.2 음성 세포 및 재 프로그래밍 중간체 SSEA 1 개의 양성 TH 1.2 음성 세포의 집단.

그런 다음 9일차 SSEA 1 양수 TH 1.2 음수 분수를 SSEA 1 대 EPAM 플롯으로 더 세분화합니다. 라벨링되지 않은 대조군을 사용하여 여기에 표시된 대로 EPAM 양성 세포와 EPAM 음성 세포 주위의 게이트를 그립니다. 마지막으로, 1-2밀리리터의 IPS 세포 배지에서 세포를 수집합니다.

독시사이클린 유도 재프로그래밍에 따라 신화는 6일째 경에 뚜렷한 형태학적 변화를 겪는다. 패치와 같은 초기 식민지가 나타나기 시작하며 더 많은 문화에 따라 계속 크기가 커집니다. 좋은 재프로그래밍 실험은 초기에 5배의 10으로 파종된 T 75당 500개 이상의 콜로니를 생성하여 5번째 세포에 도달하고 확립된 IPS 배양은 특징적인 돔 모양의 콜로니를 가지며 대부분 분화된 세포가 없습니다.

재프로그래밍 중 형태학적 및 분자적 변화는 허벅지 1.2 SSEA 1 및 궁극적으로 epca의 세포 표면 발현 변화에 반영됩니다. MES는 허벅지 1.2에 대해 주로 양성이고 다른 마커에 대해서는 음성이지만, 3일째가 되면 많은 세포가 허벅지 1.2의 발현을 하향 조절하기 시작했으며 매우 적은 부분의 세포가 SSEA 1 양성이 되었습니다. 이 시점의 실제 재프로그래밍 중간체는 6일과 9일째에 일반적으로 10%를 훨씬 초과하는 SSEA 1 양성 세포의 증가된 비율이 12일째까지 검출될 수 있습니다.

SSEA one 양성 세포의 하위 집합도 양성인 것을 검출할 수 있습니다. epca의 경우. 확립된 진정한 IPS 세포 배양은 매우 긍정적일 것입니다.

SSEA one 및 EPCA의 경우 이 절차를 시도하는 동안 사전에 적절하게 유전형이 분석된 저역 통로 지도만 사용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.