인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

이 절차의 전반적인 목표는 매우 효율적인 도파민 뉴런 분화를 유도하는 것입니다. 시험관 내. 이는 먼저 인간 P 만능 줄기 세포의 단일 세포 접착 배양을 준비함으로써 달성됩니다.

두 번째 단계에서는 세포 배양 배지를 뉴런 유도 배지로 전환하여 바닥판 전구체를 유도합니다. 다음으로, 도파민 뉴런은 성숙 배지에서 배양됩니다. 그리고 마지막으로, 단세포 도파민 뉴런 전구세포를 폴리 L 오르니틴 라미네이트 피브로넥틴 플레이트와 성숙 배지에서 30일 동안 배양합니다.

궁극적으로 면역형광 현미경 검사는 중요한 도파민 뉴런 마커의 발현을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 신경산 프로토콜에 대한 기존 신경 영역보다 더 큰 이점이 있습니다. 더 높은 효율성으로 더 균일한 이중 신경 모집단을 생성할 수 있습니다.

통과 후 4일 후에 세포 배양물에서 배지를 흡인합니다. 웰당 1ml의 Accutane으로 세포를 분리하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 젤라틴을 추가한 다음 갓 준비한 마트리 젤 코팅 플레이트와 함께 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.

세포가 반 부유 상태가 되면 위아래로 여러 번 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 그런 다음 세포를 15ml 튜브에 넣고 3분 동안 원심분리합니다. 258 Gs 및 실온에서, 혈청이 보충된 적절한 양의 인간 만능 줄기 세포 배양 배지에 펠릿을 다시 현탁시키고 티 비빈을 2 밀리몰의 최종 농도에 첨가한다.

다음으로, 젤라틴으로 코팅된 플레이트의 세포를 섭씨 37도에서 30분 동안 1:1 비율로 배양합니다. 필로폰 공급원을 제거하려면 세포를 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 혈청으로 보충된 인간적인 만능 줄기 세포 매체에서 그(것)들을 묽게 하고, 세포를 다시 회전시킨 후에 세고, 180에 티아스 Ivan를 가진 MT.SR 개의 1개의 매체에 있는 세포를 다시 중단하십시오, 밀리리터 농도 당 000의 세포

그런 다음 코팅된 플레이트에서 마트리겔을 흡인하고 웰당 2ml의 세포를 분배합니다.48시간. 세포를 matrigel 플레이트에 다시 도금한 후.

각 웰에서 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 20일째 차트에 요약된 바와 같이 배지를 D 0에서 D 20으로 매일 변경하는 세포에 SB 4 31, 50 42 an L DN 1 9 3 1 8 9가 보충된 2ml의 KSR 분화 배지를 추가하고, 분화 배지를 흡인하고 5분 동안 섭씨 37도에서 웰당 1밀리리터의 37°C 아큐투스로 세포를 분리합니다. 배양하는 동안 인큐베이터에서 폴리 L 오린 라미닌 피브로넥틴 플레이트를 따뜻하게 가열합니다.

그런 다음 Resus 후 분리된 세포를 단일 세포 현탁액으로 현탁시키고 신경 기저 매체에서 세포를 희석합니다. 계수 후, 세포를 스핀다운하고 펠릿을 B 27, 분화 배지에 100만 개의 세포 농도로 재현탁시킵니다. 그런 다음 폴리올 오린 라미닌 피브로넥틴 플레이트에서 피브로넥틴을 흡인합니다.

PBS로 두 번 세척하고 각각 400마이크로리터의 세포를 이동합니다. 글쎄, 마지막으로 처음 24시간 후에 배지를 변경하고 실험 종말점까지 격일로 변경하여 부착되지 않은 죽은 세포를 제거합니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이, 재도금된 단세포 인간 만능 줄기세포 배양은 분화 후 처음 48시간 동안 클러스터로 확장되어 약 70%의 합류점에 도달합니다.

분화 후, 세포는 3-4일 이내에 완전한 합류를 달성합니다. 20일째가 되면 분화된 세포가 부착되어 작은 덩어리로 자랍니다. 다음 5일 동안 훨씬 더 집중적이고 형태학적으로 손상되지 않은 축삭돌기와 신경돌기가 덩어리 내에 나타나 덩어리 사이에 몇 가지 연결을 형성합니다.

분화 후 11일 후, 인간 만능 줄기세포는 바닥판 전구체로 효율적으로 전환될 수 있습니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이 거의 모든 세포는 바닥판 전구체를 발현하고 세포 마커는 중첩되며 여우 A는 2 이상입니다. 세포의 90%는 Corin O OTX 2 및 LM X one A를 발현합니다.추가 분화 후, 바닥판 전구체 세포는 TUJ 1 및 TH를 발현하는 도파민 뉴런에 특화되어 있습니다. 이 도파민 뉴런은 GK 2를 발현하고 칼빈딘 면역 염색 실험에 대해 음성이기 때문에 9개의 정체성을 가지고 있으며, 또한 GFAP 성상세포가 없고 GABAergic 뉴런이 매우 적다는 것을 보여주며, 이는 분화가 도파민 뉴런 계통에 대해 배타적으로 특이적임을 나타냅니다.

이 절차를 테스트하는 동안 일상적인 세포 배양에서 일관성을 유지하고 배지가 올바른 성분으로 신선하게 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다.