Name: 인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 학습하세요 인간 다능성 줄기세포에서 A9 중뇌 도파민 신경세포로 효율적으로 분화시키는 최적화된 프로토콜을. 이 방법은 파킨슨병 질병 모델링과 세포 치료제 개발에 활용됩니다.

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저자는 이 프로토콜의 개발과 이 원고를 준비하는 동안 도움을 준 Renee Reijo Pera 실험실의 구성원들에게 감사드립니다. 이 연구는 CIRM(California Institute for Regenerative Medicine) 공유 실험실(CL-00518)의 지원을 받습니다.

문화 미디어의 1 준비 <ol><li> 다음을 조합하여 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 배지를 준비 : 445 ml의 DMEM, 50 ml의 소 태아 혈청 (FBS) 및 5 ㎖의 100X 페니실린 / 암피실린 원액. 이하 십사일 4 ° C에서 필터 살균 매체를 보관하십시오. </li><li> 준비 혈청 함유 다음 조합함으로써 hPSC 배지를 : 385 ml의 DMEM / F12, 100 ㎖ 녹아웃 혈청 여분 (KSR), 5 ㎖ 100X 비 필수 아미노산 원액, 5 ㎖ 100X 페니실린 / 암피실린 원액, 5 ㎖ 100X를 원액 메르 캅토 에탄올, 10 NG / ㎖의 bFGF. 더 이상 10 일 동안 4 ° C에서 필터 살균 매체를 보관하십시오. </li><li> 다음을 조합하여 mTeSR1의 무 혈청 배지를 제조 : 400 ml의 mTeSR1 기본 배지 100 ㎖의 5 배 보충, 및 5 ㎖ 100X 페니실린 / 암피실린 원액. 더 이상 10 일 동안 4 ° C에서 매체를 보관하십시오. </li><li> 10 배 콜라겐 IV 주식 솔루션을 준비 : 0.5 g 콜라게나 제 IV 전원을 달아50 ml의 DMEM / F12 및 필터 소독 그것을 녹인다. 분취 량을 확인하고 달 동안 C ° -20을 재고. </li><li> 0.1 % 젤라틴 용액을 준비 : 전원 (소 피부, B 형에서) 0.5 g 젤라틴을 달아 탈 물로 녹인다. 주 실온에서 오토 클레이브 멸균 솔루션을 유지합니다. </li><li> 다음을 조합하여 KSR 분화 배지를 제조 410 ㎖의 DMEM, 75 ml의 KSR을, 5 ㎖의 원액을 메르 캅토 에탄올 100X 비 필수 아미노산 원액, 5 ㎖ 100X 페니실린 / 암피실린 스톡 용액 5 ㎖를 100 배. 더 이상 10 일 동안 4 ° C에서 필터 살균 매체를 보관하십시오. 참고 : KSR은 분화 효율에 영향을 미칠 수있는 많은으로 많이 다릅니다. 그것은 차별화를위한 최선의 일을 찾기 위해 KSR의 여러 배치를 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> 다음을 결합하여 N2 차별화 매체를 준비합니다 : 98 ㎖의 DMEM, 1 ml의 100 배 N2 보충 및 1 ml의 100 배 페니실린 / 암피실린 원액을. 4에서 필터 살균 매체 유지없이 10 일 이상 C를 °. </li><li> 10 ㎖ 50X B27 보충제, 5 ㎖의 원액을 glutamax 100X, 100X 및 5 ㎖ 페니실린 / 암피실린 스톡 용액, 480 ml의 neurobasal 매체 : 다음을 조합하여 B27 분화 배지를 준비한다. 더 이상 10 일 동안 4 ° C에서 필터 살균 매체를 보관하십시오. </li></ol> MEF 피더 세포에 인간 배아 줄기 및 hiPSCs의 2 문화 H9의 인간 배아 줄기는 WiCell 연구소에서 얻은하고 hiPSCs는 야마나카의 레트로 바이러스 매개 형질 도입을 통해 Reijo 페라 실험실에서 설립되었다 요인 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 C-MYC 18. <ol><li> 적어도 일일 세포 통로 전에, 6 - 웰 플레이트의 1도에 1 ㎖의 0.1 % 젤라틴을 추가하여 일부 젤라틴 판을 준비하고 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품어. </li><li> 배양 플레이트에서 흡 젤라틴 및 시드 조사 후에는 1.6 x 10 5의 세포 밀도로 플레이트 상 MEF 세포를 불 활성화/ 웰 MEF 배지에서 세포를 세는 혈구를 사용. 주 : 선택적으로 빠르면 3 일 정도 세포 통로 전에 MEF 피더를 준비합니다. </li><li> 통로 세포 MEF 피더 도금 후 일일 : hPSCs에서 흡인 매체 잘 / 1 ML에서 세포에 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV를 추가하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 세포를 배양한다. </li><li> 이 부화하는 동안, PBS로 한번 MEF 피더 세척 한 다음도 1.5 ㎖ /에서 따뜻한 (37 ° C) 혈청 함유 hPSC 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 미분화 식민지의 대부분이 판에서 분리 수 있도록 차별화 된 식민지가 연결된 상태를 유지하면서 1 시간 후, 배양 접시에 몇 번을 누릅니다. 조심스럽게 떠 식민지를 수집하고, 15 ML 튜브로 전송합니다. </li><li> 부드럽게 따뜻한 (37 ° C) DMEM / F12 한 번 접시를 씻어 같은 15 ML 튜브로 DMEM / F12을 전송합니다. </li><li> 3 분 동안 179 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 펠렛을 방해하지 않도록주의 튜브에서 대기음 매체. 전쟁 추가m hPSC 배지, 작은 클러스터로 휴식과 잘 섞는다까지 여러 번 아래로 세포를 피펫. </li><li> 일에 새로운 MEF 피더에 세포를 전송 : 3-1 : 6 비율. </li><li> 모든 5~6일 매일 통로 세포 매체를 변경합니다. </li></ol> 차별화를위한 세포의 3 준비 <ol><li> 세포의 준비를하기 전에 적어도 하루에 일부 마트 리겔 플레이트 (6 웰 플레이트의 일반적으로 세 우물)을 준비합니다. 1시 40분 찬 (4 ° C) DMEM / F12와 마트 리젤을 희석하고 6 웰 플레이트 잘 당 1 ㎖의 마트 리젤을 추가합니다. 4 ° C에서의 하룻밤 마트 리겔 판을 품어. 참고 : 하나는 파라 필름과 매트 리겔 판을 밀봉 한 것과 일주일 동안 4 ° C에서 그들을 재고 할 수 있습니다. </li><li> 사일 통과 한 후 세포를 (2 단계 참조)를 사용합니다. 판의 모든 차별화 된 식민지를 제거합니다. 배양 접시에서 대기음 매체는 5 분 동안 37 ° C에서 세포를 잘 한 ML accutase 당 추가하고, 부화. </li><li> 배양 동안 일부 젤을 준비6 - 웰 플레이트에 1 ㎖ 젤라틴 1 내지도 추가하여 플레이트 ATIN. 이 판과 배양기에서 일일 전에 준비 마트 리겔 플레이트를 놓습니다. </li><li> 세포가 될 때 반 부동 5 분 배양 후 또는 피펫 세포 위아래로 여러 번 단일 세포로 만들 수 있습니다. </li><li> 3 분 동안 258 XG에 한 15 ml의 튜브에 세포와 원심 분리기를 수집합니다. </li><li> 재현 탁 된 hPSC 배지를 함유하는 혈청의 적절한 양의 세포, 및 2 μM의 최종 농도 Thiazovivin 추가. </li><li> 1에서 젤라틴 코팅 플레이트 상에 세포를 전송 : 30 분 동안 37 ° C에서 1 비율 및 배양 세포는 MEF 피더를 제거합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송, hPSC 매체를 포함하는 적절한 혈청을 추가하고 혈구와 세포를 계산합니다. </li><li> 3 분 동안 258 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리기 중에 2 μM의 농도를 만들기 위해 mTeSR1 매체 처분시 Thiazovivin 추가. </li><li> 원심 분리기, 후매체를 spirate 및 / ㎖ 매체 1.8 × 10 5 세포가되도록 Thiazovivin와 적절한 mTeSR1 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> , 인큐베이터에서 마트 리젤 판을 꺼내 마트 리젤을 대기음 6 웰 플레이트의 일에 잘 혼합 세포 2 ㎖를 추가합니다. NOTE : 세포 밀도가 3.6 × 104 세포 / 표면적이 cm이어야한다. </li><li> 인큐베이터에 번호판을 반환하고, 세포를 24 시간 동안 부착 할 수 있습니다. </li><li> 24 시간 세포를 도금 후, 오래된 매체를 대기음 잘 당 2 ㎖의에게 새로운 mTeSR1 매체를 추가하고 분화를 시작하기 전에 세포가 다른 24 시간 동안 성장 할 수 있습니다. </li></ol> 세포 분화 <ol><li> 마트 리겔 플레이트에 세포를 replating 후 분화 48 시간을 시작합니다. </li><li> 플레이트에서 기음 문화 매체는 PBS로 한 번 세포를 씻어 잘 당 다음과 같은 분화 배지 2 ㎖를 추가 : 10 μM SB431542 및 100 nm의 LDN-193 보충 KSR 차별화 매체189 마크 분화 D0로이 일. </li><li> D20에 D0에서 매일 매체를 변경합니다. 참고 : 한 번에 이일보다 더 사용하기 위해 미디어를 준비 할 수 있습니다. </li><li> 10 μM SB431542, 100 nm의 LDN-193189, 0.25 μM SAG, 2 μM의 purmorphamine, 50 NG / ㎖ FGF8b 보충 KSR 차별화 매체 : D1과 D2에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다. </li><li> 10 μM SB431542, 100 nm의 LDN-193189, 0.25 μM SAG, 2 μM의 purmorphamine, 50 NG / ㎖ FGF8b, 3 μM의 CHIR99021 보충 KSR 차별화 매체 : D3와 D4에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다. </li><li> 100 nm의 LDN-193189, 0.25 μM SAG, 2 μM의 purmorphamine, 50 NG / ㎖ FGF8b, 3 μM C​​HIR99021 보충 75 % KSR 차별화 매체 플러스 25 % N2 차별화 매체 : D5 및 D6에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다. </li><li> 100 nm의 LDN-193189와 3 μM C​​HIR99021 보충 50 % KSR 차별화 매체 플러스 50 % N2 차별화 매체 : D7과 D8에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다.</li><li> 100 nm의 LDN-193189와 3 μM의 CHIR99021 보충 25 % KSR 차별화 매체 플러스 75 % N2 차별화 매체 : 다음 D9에 대한 중간 및 D10을 사용합니다. </li><li> 3 μM C​​HIR99021, 10 NG / ml의 BDNF, 10 NG / ㎖ GDNF, 1 NG / ㎖ TGF3, 0.2 MM의 아스 코르 빈산 및 0.1 mM의 캠프로 보충 B27 차별화 매체 : D11과 D12에 대해 다음 매체를 사용합니다. </li><li> 10 NG / ml의 BDNF, 10 NG / ㎖ GDNF, 1 NG / ㎖ TGF3, 0.2 MM의 아스 코르 빈산 및 0.1 mM의 캠프로 보충 B27 차별화 매체 : 차별화의 나머지 부분에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다. </li><li> 분화에 대한 D16에서 일부 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 / 피브로넥틴 판을 준비합니다. 폴리-L-오르니 틴 감기 (4 ° C에서)와 원액을 15 ㎍ / ml의 PBS가, 하룻밤 37 ° C에서 접시를 6 웰 플레이트의 1도에 1 mL를 넣고 배양 희석. </li><li> , 폴리-L-오르니 틴 솔루션을 기음 판에게 멸균 수로 3 회 세척 한 후 공기가 판을 건조. </li><li> 라미닌 재고 졸을 희석1 ㎍ / ㎖의 감기 (4 ° C) PBS와의 ution는 6 - 웰 플레이트 잘 하나에 1 mL를 넣고 하룻밤 37 ° C에서 번호판을 품어. </li><li> , 라미닌 솔루션을 기음 판에게 멸균 수로 3 회 세척 한 후 공기가 판을 건조. </li><li> , 2 ㎍ / ㎖의 감기 (4 ° C) PBS와 피브로넥틴 원액을 희석 6 - 웰 플레이트의 1도에 1 mL를 넣고 하룻밤 37 ° C에서 번호판을 품어. </li><li> 파라 필름으로 밀봉 판과 최대 2 주부터 4 ° C에 배치합니다. </li><li> 분화 20 일 후, 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 / 피브로넥틴 플레이트에 세포를 replate. 기음 차별화 매체는, 6 웰 플레이트의 1도에 1 ml의 따뜻한 (37 ° C) accutase을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양한다. </li><li> 배양 동안 인큐베이터에 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 / 피브로넥틴이 판을 배치합니다. </li><li> 5 분간 배양 한 후, 또는 세포가 될 때까지 아래로 수회 부드럽게 피펫 세포 세미 부동하나의 세포로합니다. </li><li> 15 ml의 원추형 튜브에 단일 세포를 수집하고, 팽창에 따라 달라질 셀 카운팅 neurobasal 매체의 적당량을 추가 (분화 11 일 후, 세포를 15 ~ 20 배로 확대있다). 혈구를 사용하여 세포를 카운트. </li><li> 3 분 동안 258 XG에서 세포를 원심 분리기. B27 분화 배지로 기음 상청액, 세포를 재현 탁하고 세포 농도 / ㎖ 배지 1 × 10 6 세포가되도록. </li><li> 접시에서 대기음 피브로넥틴은 PBS로 두 번 세척하고, 6 - 웰 플레이트의 한 웰에 2 ㎖의 세포를 추가합니다. NOTE : replating 대한 세포 밀도가 2 × 105 세포 / 표면적이 cm이어야한다. </li><li> 모든 부착되지 않은 죽은 세포를 제거하기 위해 24 시간 후 매체 변경합니다. </li><li> 주어진 실험에 대해 원하는 시점까지 매일 매체를 변경합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

(인간 배아 줄기 및 hiPSCs 모두 포함) 인간 만능 줄기 세포는 대부분을 생성하기 위해 체외에서 분화 할 수없는 모든 경우, 이전의 연구 (19)에서 설명 된 DA 신경 세포는 우리 몸의 세포 유형. 여기서, 다른 실험실 14,15부터 배아 도파민 뉴런의 발달과 기술 (20)로부터 발행 프로토콜에 기초하여, 우리는 인간 배아 줄기 및 hiPSCs에서 DA 뉴런의 생성을위한 배양 조건을 최적화. 이 프로토콜은 재현, 효율적이고 우리는 성공적으로 H1 및 H9 hESC의 라인과 PD 환자와 영향을받지 컨트롤 모두에서 hiPSC 라인에 여기에 설명이 프로토콜을 적용했습니다. 우리의 프로토콜에서 높은 분화 효율을 얻기 위해 세 가지 주요 단계가 있습니다 : 첫째, 세포 전 감독의 분화에는 차별화 된 hPSC 식민지가 없어야합니다. 세 가지 배엽에 관해서는 자발적 분화에 주로 h에서 볼 수있다PSC 문화,...

도파민 (DA) 신경 세포는 중뇌, 시상 하부, 망막, 후각 전구 등 여러 가지 뇌 영역에서 찾을 수 있습니다. 전뇌로의 선조체 추체 외로 돌출하고 모터 시스템을 형성함으로써 흑색질의 유리체 compacta (SNpc) 제어 동작 및 운동 뉴런 A9 DA. A9 DA 뉴런의 변성은 두 번째 가장 일반적인 인간의 신경 퇴행성 질환과 현재 불치 파킨슨 병 (PD)에 연결됩니다. 세포 대체 요법은 PD (1)의 치료를위한 가장 유망한 전략 중 하나이고, 따라서 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기) 및 모두 포함한 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 A9 DA 신경 세포를 유도에 많은 관심이 있었다 최근 인간의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs). 많은 연구는 다양한 방법을 사용하여 hPSCs에서 A9 DA 뉴런을 유도하기 위해 노력하고 있습니다. 신경을 통해 최초의 보고서 생성 된 모든 DA 뉴런장미 전구 단계입니다. 으로 또는 2-4주, L. STUDER 동료 성공적 신경 로제트 인간 배아 줄기를 생산하는 유도 다른 세 그룹의 외부 성장 인자없이 2 MS5 PA6 또는 3-5 기질 세포와 공동 배양. 그런 다음 기계적 박리 또는 추가 차별화를위한 소화 효소에 의해이 로제트를 강화. 다른 보고서에서 연구자들은 문화의 차별화 6-9 부동 배아 체를 통해 신경 로제트 (EB)를 생성합니다. 이후 연구진은 그들이 세포 외 매트릭스에 인간 배아 줄기 및 hiPSCs 도금 단일 층을 기반으로 차별화 방법 (10, 11)을 설립 생체 배아 DA 신경 세포의 개발을 모방 DA 뉴런에 hPSCs의 분화를 유도하는 문화에서 서로 다른 성장 인자를 추가 . 이러한 모든 연구는 DA 신경 세포의 일부 특성 티로신 수산화 효소 (TH) 발현 세포를 수득되지만, 전 분화 과정은, 시간과 노동력 소모일반적으로 비효율적 인, 그리고 더 중요한 것은, 이러한 신경 세포의 A9 ID는 LMX1a 자궁외 식 (12)를 제외한 대부분의 연구에서 입증되지 않았다. 최근, 새로운 바닥 판 (FP) 기반 프로토콜은 다음 DA 신경 세포의 잠재력 FP 전구체가 먼저 분화의 초기 단계에서 소닉 고슴도치와 정식 Wnt 신호 경로의 활성화에 의해 생성 된에 13-16, 개발되었다 이러한 FP 세포는 더 DA 뉴런에 지정되었습니다. 이 프로토콜은 더 효율적이지만, 여전히 몇 가지 문제가있다; 예를 들면, 전체의 분화 과정은 장시간 (적어도 35 일) 소요 종속 피더 셀 (15)은, 또는은 또는 EB A9 아이덴티티 14 입증되지 않았다 (16) 좌우된다. 여기서, 생체 배아 DA 신경 발달과 다른 연구자들의 발표 된 결과에서 지식에 기초하여, 우리는 EFF위한 배양 조건을 최적화 한인간 배아 줄기 및 hiPSCs 모두에서 DA 뉴런의 icient 생성. 우리는 첫번째 작은 분자 CHIR99021 작은 분자 SAG와 purmorphamine와 신호 소닉 고슴도치 정식 Wnt 신호의 활성화에 의해 FP 전구 세포를 생성합니다. 이러한 FP 세포는 FOXA2, LMX1a, 코린,의 Otx2 및 네 스틴을 표현한다. 우리는 다음 등 BDNF, GDNF를 포함 성장 인자와 DA 뉴런 이러한 FP 세포를 지정했습니다. 그들은 Calbindin 17 동안 네거티브 GIRK2 대해 긍정적으로 생성 DA 뉴런 A9 세포 유형이다. 이 프로토콜은 매우 효율적이고 재현성 피더 셀 또는 EB 독립적이다. 이 프로토콜을 사용하여, 하나 또는 체외 PD의 모델링 또는 PD에 대한 잠재적 치료제를 테스트 PD 환자의 hiPSCs에서 인간 배아 줄기 또는 세포 이식 연구에 대한 정상인의 hiPSCs 미만 사주에서 DA 신경 세포를 유도 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/암피실린</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acid</td><td>Life 기술</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>b-메르캅토에탄올</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>성장 인자 감소 matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R& D 시스템</td><td>423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cellagen Technology</td><td>C2447-2S</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D 시스템</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R& D 시스템</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta3</td><td>R& D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti human NESTIN 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td>1/1,000 희석</td></tr><tr><td>Rabbit anti human OTX2 항체</td><td>Millipore</td><td>AB9566</td><td>1/2,000 희석</td></tr><tr><td>염소 anti human FOXA2 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF2400</td><td>1/200 희석</td></tr><tr><td>토끼 인간 방지 LMX1a 항체</td><td>Millipore</td><td>AB10533</td><td>1/1,000 희석</td></tr><tr><td>토끼 인간 TH 항체</td><td>Pel Freez</td><td>P40101</td><td>1/500 희석</td></tr><tr><td>닭 인간 TH 항체</td><td>Millipore</td><td>AB9702</td><td>1/500 희석</td></tr><tr><td>마우스 인간 방지 TUJ1 항체</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1/,2000 희석</td></tr><tr><td>토끼 anti human GIRK2 항체</td><td>Abcam</td><td>ab30738</td><td>1/300 희석</td></tr><tr><td>토끼 anti human Calbindin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab25085</td><td>1/400 희석</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

substantia nigra pars compacta(A9 DA 뉴런이라고도 함)의 도파민(DA) 뉴런은 파킨슨병(PD)에서 손실되는 특정 세포 유형입니다. PD에 대한 재생 세포 대체 요법을 위해 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 A9 DA 뉴런을 유도하는 데 큰 관심이 있습니다. 신경 발달 과정에서 A9 DA 뉴런은 중추신경계의 복부 정중선에 위치한 바닥판(FP) 전구체에서 유래합니다. 여기에서는 배아 DA 뉴런 발달을 모방하는 HPSC와 A9 DA 뉴런의 단계적 분화를 위한 배양 조건을 최적화했습니다. 본 임상시험의 프로토콜에서는 먼저 소분자 방법을 사용하여 hPSC에서 FP 전구체 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 설명한 다음, FP 세포를 몇 달 동안 체외에서 유지할 수 있는 A9 DA 뉴런으로 변환합니다. 이 효율적이고 반복 가능하며 제어 가능한 프로토콜은 정상인과 PD 환자의 인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 잘 작동하며, A9 DA 뉴런을 유도하여 체외 질환 모델링 및 약물 스크리닝 및 PD에 대한 생체 내 세포 이식 요법을 수행할 수 있습니다.

분화 프로토콜의 개요는도 1에 도시된다. 여기에 제시된 분화 프로토콜의 효율은 출발 세포의 상태에 의존한다. 따라서, 첫 번째는 분화 단일 세포로 hPSCs 해리 전에 분화 콜로니를 제거하며, 둘째, 하나는 모든 경우에, MEF 피더 세포 젤라틴 - 코팅 된 플레이트상에서 세포를 배양하여, 대부분 고갈 것을 확인하는 것이 중요 30 분, 그리고 세 번째, 마트 리겔 플레이트 상에 적절한 밀도로 한 판 hPSC 단일 세포. 도 2에 도시 된 바와 같이, 단일 hPSC 세포 플레이트에 약 70 % 합류점을 형성, 분화 이전에 48 시간 동안 클러스터로 확장 할 도말. 그런 다음 분화 한 후,이 세포는 짧은 3 ~ 4 일 만에 전체의 합류에 도달하고, D16-D17 주위에서 시작하여,이 합류 세포는 판에 약간의 공간을 만들기 위해 시작, 일부 축삭 / 신경 돌기는 이미 수이러한 공간 및 세포층으로 관찰 될 수있다. D20에 도말 한 후, 분화 세포 부착 및 작은 덩어​​리...

우리는 발달 생물학의 지식과 발표된 연구를 바탕으로 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 A9 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜을 개발했으며, 이는 파킨슨병에 대한 질병 모델링 및 세포 대체 요법에 유용할 것입니다.

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

이 절차의 전반적인 목표는 체외(in vitro)에서 매우 효율적인 도파민성 뉴런 분화를 유도하는 것입니다. 이는 먼저 인간 다능성 줄기세포의 단일 세포 부착 배양물을 준비함으로써 달성됩니다.두 번째 단계에서는 세포 배양액을 신경 유도 배지로 교체하여 floorplate 전구세포를 유도합니다. 다음으로, 도파민성 신경세포를 성숙 배지에서 배양합니다. 마지막으로, 단일 세포 도파민성 신경세포 전구세포를 poly L ornithine 및 fibronectin이 코팅된 플레이트에서 성숙 배지를 사용하여 30일 동안 배양합니다.최종적으로, 면역형광 현미경법을 사용하여 중요한 도파민성 신경세포 마커의 발현을 평가할 수 있습니다. 이 기술은 기존의 신경구 및 신경산 프로토콜보다 더 큰 장점이 있습니다. 이는 더 높은 효율로 더 균질한 이중 신경 세포군을 생성할 수 있습니다.계대 배양 4일 후 세포 배양물에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 웰당 1 mL의 Accutane을 사용하여 세포를 탈착시키고 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 6-웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 gelatin을 첨가한 다음, 해당 플레이트를 새로 준비된 matri gel 코팅 플레이트와 함께 인큐베이터에 넣습니다.세포가 반쯤 부유 상태가 되면, 피펫으로 여러 번 상하로 섞어 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 그 다음 세포를 15 milliliter 튜브로 옮겨 3분 동안 원심분리합니다. 258 Gs 및 상온 조건에서, 펠렛을 혈청이 보충된 적절한 양의 인간 다능성 줄기세포 배양 배지에 다시 현탁하고 thi vivin을 최종 농도가 2 millimolars가 되도록 첨가합니다.다음으로, 젤라틴이 코팅된 플레이트에서 세포를 1:1 비율로 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 메토(meth) 피더 세포를 제거하려면 세포를 새로운 15 mL 튜브로 옮깁니다. 혈청이 첨가된 인간 만능 줄기세포 배지로 희석하고, 세포를 다시 원심 분리한 후 수를 측정합니다. 그 다음, thias Ivan이 포함된 MT.SR one 배지에서 세포 농도가 180,000 cells/mL가 되도록 세포를 재부유시킵니다.그런 다음 코팅된 플레이트에서 matrigel을 흡입하여 제거하고, 웰당 2 mL의 세포를 분주합니다. 세포를 matrigel 플레이트에 재배양한 후 48시간 동안 배양합니다.각 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그 다음, SB 4 31, 50 42 및 L DN 1 9 3 1 8 9가 첨가된 KSR 분화 배지 2 mL를 세포에 추가하며, 표에 설명된 대로 D 0부터 D 20까지 매일 배지를 교체합니다. 20일째에 분화 배지를 흡입하여 제거하고, 웰당 37 °C의 acutus 1 mL를 사용하여 37 °C에서 5분 동안 세포를 탈착시킵니다. 배양하는 동안, poly L orine laminin fibronectin 플레이트를 인큐베이터에서 예열합니다.그 후 Resus를 거쳐 분리된 세포를 단일 세포 현탁액으로 만든 다음, neuro basal media로 세포를 희석합니다. 세포 수를 측정한 후, 세포를 원심 분리하고 펠렛을 1 million cells per milliliter 농도의 B 27 분화 배지로 재현탁합니다. 그런 다음 polyol orine laminin fibronectin 플레이트에서 피브로넥틴을 흡입하여 제거합니다.PBS로 두 번 세척한 후, 각 웰에 400 microliters의 세포를 옮깁니다. 마지막으로 첫 24시간 후에 배지를 교체하고, 이후에는 실험 종료 시점까지 이틀마다 배지를 교체하여 부착되지 않은 사멸 세포를 제거합니다. 이 이미지들에서 보는 바와 같이, 재배양된 단일 세포 인간 다능성 줄기세포 배양물은 분화 초기 48시간 동안 클러스터 형태로 증식하여 약 70% confluency에 도달하게 됩니다.분화 후, 세포들은 짧게는 3~4일 만에 완전한 합류(confluence) 상태에 도달합니다. 20일째가 되면 분화된 세포들이 부착되어 작은 덩어리 형태로 성장합니다. 이후 5일 동안, 덩어리 내에서 훨씬 더 조밀하고 형태학적으로 온전한 축삭(axon)과 신경돌기(neurite)가 나타나며, 덩어리 사이에 일부 연결을 형성합니다.11일간의 분화를 거치면 인간 다능성 줄기세포를 바닥판 전구세포로 효율적으로 전환할 수 있습니다. 이 이미지들에서 확인할 수 있듯이, 거의 모든 세포가 바닥판 전구세포 표지자인 nestin과 foxA2를 발현하며, 90% 이상의 세포가 Corin, OTX2 및 LMX1A를 발현합니다. 추가 분화 후, 바닥판 전구세포는 TUJ1과 TH를 발현하는 도파민성 뉴런으로 전문화됩니다. 이 도파민성 뉴런들은 Girk2를 발현하고 calbindin에 대해 음성을 나타내므로 A9 정체성을 가집니다. 면역 염색 실험 또한 GFAP 성상교세포가 없으며 GABA성 뉴런이 매우 적음을 보여주며, 이는 분화가 도파민성 뉴런 계보에만 배타적으로 특이적임을 나타냅니다.이 절차를 테스트할 때는 일상적인 세포 배양의 일관성을 유지하고, 배지가 정확한 성분으로 신선하게 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

이 비디오는 비형질전환 및 형질전환 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 신경전구세포의 생성을 보여줍니다. hPSC는 신경세포 분화 배지를 사용하여 신경전구세포로 분화됩니다. 분화는 작은 분자를 사용하여 비형질전환 세포에서 유도되는 반면, 형질전환 hPSC는 뉴런 분화 특이적 전사 인자를 위해 프로모터를 유도하는 항생제를 첨가하여 분화됩니다.

Non-Transgenic 및 Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells (비유전자 변형 및 형질전환 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화)

이 비디오는 테트라사이클린 반응성 요소의 제어 하에 신경인성 전사 인자 유전자를 운반하는 엔지니어링된 렌티바이러스로 인간 만능 줄기세포를 형질 주입하여 뉴런으로 분화하도록 유도한 후 테트라사이클린 유도체 및 성숙 배지로 처리하는 과정을 보여줍니다.

조작된 렌티바이러스를 사용한 뉴런의 인간 만능 줄기세포 분화

이 비디오는 파킨슨병 연구를 위한 모델을 제공하기 위해 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 도파민 뉴런으로 분화하는 방법을 보여줍니다. hESC는 마이크로웰 플레이트의 신경 유도 매체에서 배양되어 3D 신경구를 형성합니다. 그런 다음 이들은 도파민 전구 뉴런으로의 분화를 촉진하기 위해 신경 유도 배지에서 배양됩니다. 뉴런의 최종 성숙은 공기-액체 계면 조건의 배양 삽입물에서 발생하여 성숙한 도파민 뉴런으로 구성된 3D 오가노이드가 생성됩니다.

인간 배아 줄기 세포에서 도파민 신경 세포 오가노이드 생성

이 절차는 인간의 개발 기간 동안 관찰 것과 유사한 대를 이동하여 telencephalic 뉴런을 산출. 세포는 자발적으로 차별화 할 수있는 신경 계통 기수를 밀어 요인에 노출되어 격리되며, 터미널 차별화과 성숙을 할 수 있도록 coverslips에 도금되어 있습니다.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.

피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

학습하세요 인간 다능성 줄기세포에서 A9 중뇌 도파민 신경세포로 효율적으로 분화시키는 최적화된 프로토콜을. 이 방법은 파킨슨병 질병 모델링과 세포 치료제 개발에 활용됩니다.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

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