Name: 두 발견 거미 진드기의 적용 점박이 응애 식물 해충의 상호 작용 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 거미 진드기 수집 및 식물 감염 방법을 이용한 식물-해충 상호작용 연구. 이 기술은 Tetranychus urticae를 빠르게 채집하고 피해를 정량화하여 농업 해충 관리 연구에 효율성을 제공합니다.

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이 프로젝트는 Genome Canada와 Ontario Genomics Institute(OGI-046) 및 Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035(M.G. 및 V.G.로)를 통해 캐나다 정부의 자금 지원을 받았습니다.T.V.L.은 Fund for Scientific Research Flanders(FWO)의 박사 후 연구원입니다.

거미 진드기 인구의 1. 유지 보수 참고 : 거미 진드기는 (파세 러스 불가리스)가 캘리포니아 붉은 강 낭 콩에서 사육된다. <ol><li> 이전에 감염 2 ~ 3 주에 씨앗에서 콩 식물을 성장. </li><li> 감염된 식물 인터는이 식물; 성인 진드기 빠르게 신선한 식물 재료에 정착합니다. </li><li> 신선한 식물로 대체, 7 ~ 10 일마다 이전 만연 된 콩 식물을 제거합니다. </li></ol> 2. 성인 여성 진드기를 수집 <ol><li> 세척 방법을 사용하여 컬렉션 진드기 <ol><li> 진드기를 수집하려면 1 ~ 2 일 전에 실험에 감염 식물과 접촉 신선한 콩 식물을 배치. </li><li> 1,000 ~ 2,000 성인 여성 진드기를 수집하기 위해 20 ~ 30 신선한 콩 식물을 사용합니다. </li><li> RT 수돗물을 사용하여 0.001 %에서 트윈 20 용액을 준비합니다. </li><li> 한 번에 2 ~ 3 식물을 사용하여, 트윈 20 용액에 오염 된 콩 식물을 씻으십시오. </li><li&gt; 각각의 식물은 잎의 모든 진드기를 수집하기 위해 2 - 3 배를 세척한다. </li><li> 단계를 완료 진드기 사망을 피하기 위해 10 분 이내 2.1.4. </li></ol></li><li> 정의 메쉬 크기의 체를 통해 진드기 현탁액의 여과 성인 여성 진드기의 분리 <ol><li> 다음 메쉬 크기의 체를 준비 : 500 μm의 (파편을 제거하기 위해) 및 300 μM (여성 성인 진드기를 수집하기 위해) (그림 1A). </li><li> 500 μm의 체를 통해 현탁액을 필터링합니다. </li><li> 300 μm의 체를 통해 서스펜션 대해 필터링. 성인 여성의 진드기가 유지됩니다. </li><li> 트윈 20을 제거하기 위해 깨끗한 수돗물의 성인 여성 진드기와 300 μm의 체를 찍어. </li><li> 체의 바닥에 단일 층으로 진드기를 전파. </li><li> 체의 메쉬 측면에서 과잉의 물을 제거하기 위해 종이 타월을 사용합니다. 참고 : 진드기 복구하기 위해 신속하게 건조해야하기 때문에이 작업이 완료됩니다. </li><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 조립체를 준비B; 이 진드기가 자유롭게 이동 할 수 있지만이 빠져 나가는 것을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 지원으로 사용되는 체의 상단에 진드기 체를 놓습니다. </li><li> 분산에서 진드기를 방지하기 위해 물과 바닥 체를 둘러싸고 있습니다. 참고 : 진드기 후 약 5 분을 복구하기 시작합니다. 약 30 분 후, 이동하는 진드기의 수는 컬렉션 (도 1D)을 시작하기에 충분하다. 가 컬렉션을 방해 실크를 생산으로 진드기, 1 시간 이내에 수집해야한다. </li></ol></li></ol> 진드기 3. 공장 침입 참고 : 성인 여성 진드기가 회복되면, 그들은 식물의 침입에 사용할 수 있습니다. ) 좋은 브러쉬 (프로토콜 3.1)를 사용하고 B) 펌프 또는 진공 라인 (프로토콜 3.2)를 사용하여 : 성인 여성 진드기 실험 식물을 만연하는 데 2​​ 가지 방법이 있습니다. <ol><li> 브러시를 사용하여 진드기 침입 참고 : 거미 진드기의 침입브러시는 공장 당 최대 30 진드기의 응용 프로그램에 사용됩니다에. <ol><li> 크기 00 또는 미세한의 부드러운 머리카락 라운드 아트 브러쉬를 사용합니다. </li><li> RT 수돗물과 브러쉬를 적시고. </li><li> 부드럽게 브러쉬를 사용하여 체에서 진드기를 들고 식물로 전송. </li></ol></li><li> 펌프를 사용하여 침입 진드기 주 : 30 개 이상의 진드기가 적용되면 펌프 / 진공 라인에 의해 수집 된 진드기와 공장 감염이 사용됩니다. 이 방법을 위해, 마이크로 전자 부품이 픽업 또는 진공 라인을위한 진공 펌프가 사용될 수있다. 그것은 공기 일정하고 충분한 강도 (2-4 PSI)을 유지하는 것이 중요합니다. <ol><li> 펌프 / 진공 튜브와 팁 사이의 어댑터로 바닥에 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브 컷을 사용하여 펌프 또는 진공 라인에 연결하는 튜브에 1 ㎖ 피펫 팁을 부착합니다. </li><li> 피펫 팁 및 어댑터 (1.5 ML의 원심 분리기 튜브) 사이에 종이 타월의 조각을 놓습니다. 참고 : 이것의 목적은 t 내부 트랩 진드기이다그는 흡입 과정에서 끝을 피펫 또한 공기 흐름 (그림 1C)을 줄일 수 있습니다. </li><li> 피펫 팁을 사용하여 체에서 직접 진드기를 수집합니다. </li><li> 또한, 입체경을 사용하여 오염 된 잎에서 진드기 하나 하나를 수집합니다. </li><li> 진드기의 필요한 번호를 수집 한 경우, 피펫 팁의 뒷면에 종이 타월의 조각이 방해받지되어 있는지 확인하고, 관에서 피펫 팁을 제거합니다. </li><li> 피펫 팁을 눌러과 함께 진드기를 응집하여 진드기를 수집합니다. 그런 다음 잎에 배치; 초 이내에, 진드기는 잎에 분산하기 시작합니다. </li></ol></li></ol> 4. 기록하고 평가하는 공장 피해 <ol><li> 녹화 식물의 손상 주 : A. 위해 장대, 식물 손상은 진드기의 먹이의 4 일 후 평가된다. 공격력이 백화 반점의 총 표면적으로서 기록된다. 피해 측정을 위해 전체 장미는 절단 및 스캔됩니다.설명한 스캐닝 파라미터 엡손 V30 스캐너이지만 유사한 평판 스캐너를위한 좋은 출발점으로 작동 할 것이다. 수 있도록 모든 실험에 대한 지속적인 검색 매개 변수를 유지 개별 실험을 실행 사이의 비교. <ol><li> 식물 재료와 스캐너 표면을 오염시키는 것을 방지하기 위해 투명 시트를 스캐너 침대 커버. </li><li> 그래서 잎의 향축 (위) 측이 스캐너의 광원 및 캡처 요소에 직면하고 스캐너 침대에 전체 장미와 장소를 잘라. 또한, 근엽 스캐너 침대에 배치하기 전에 각각의 나뭇잎이나 미세 가위와 겹치지 않는 잎의 그룹으로 장미를 해부, 중복없이 각각의 잎을 캡처 너무 조밀 한 경우. 여러 근엽을 동시에 스캔 할 수 있습니다. </li><li> 준수와 스캐너 덮개의 오염을 방지하기 위해 흰색 종이와 근엽 또는 잎을 커버. </li><li> 닫기 스캐너 덮개 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 검사를 수행 : 해상도 : 1,200 dpi로; 컬러 모드 : 어도비 RGB; 밝기 : +25; 파일 형식 : 최대 품질 JPEG. </li><li> 이후 피해 분석을 위해 이미지 파일을 저장합니다. </li></ol></li><li> 식물 피해 정량화 NOTE : 손상의 면적 수동 포토샵을 사용하여 계산된다. 때문에 진드기의 먹이의 결과로 잎 모양과 증상의 색의 강도에 큰 차이로 자동 방법은 신뢰할 수 있었다. 따라서, 그리드 방법은 식물의 손상을 평가하기 위해 사용된다 : <ol><li> 포토샵과 식물의 이미지를 엽니 다. </li><li> (-보기 - 그리드, 단축키 Ctrl + &#39;보기 또는 표시) 새 레이어를 만든 다음 0.25 mm X 0.25 mm 부문의 격자로 스캔 한 이미지를 오버레이. </li><li> 오버레이 층에서 점 ( &quot;연필 도구&quot;, 키보드 단축키 B를 사용)를 사용하여 손상된 잎 영역을 표시합니다. 그리드 유닛의 반 이상을 덮고 손상이있는 아래의 그리드의 각 정사각형에 대한 하나의 점을 사용합니다. 도트의 크기 (픽셀 단위로 정의된다, 즉, </eM&gt; 도트 당 52 픽셀). </li><li> 레이어의 화소 수를 결정하기 위하여 - 그리드 유닛의 적어도 절반을 덮는 식물 손상이 그리드의 모든 사각형은 점으로 표시되는 경우, 히스토그램 도구 (히스토그램 윈도우)를 사용한다. 히스토그램 도구는 픽셀의 개수를 측정하는 일을 허용한다. 각 도트 픽셀의 일정한 알려진 번호로 표시되기 때문에, 히스토그램 도구, 연장에 의해, 도트의 총 수를 나타내는 총 픽셀 수를 측정 한 것이다 표시된 사각형의 총 수. </li><li> 수식을 이용하여 표시된 &quot;점&quot;의 수를 계산한다 : 점의 수 = 도트 당 픽셀의 픽셀 / 수의 총 수입니다. </li><li> 한 점은 그리드의 한 광장에 대응으로, 그리드의 1 평방의 면적으로 이미지에 표시된 점의 수를 곱하여 손상의 전체 면적을 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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이 동영상은 분리하고 성인 여성 진드기 많은 수의 식물을 만연하는 데 사용되는 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 A.를 사용하여이 프로토콜을 제시하지만 장대, 어떤 식물 거미 진드기의 상호 작용 시스템에 사용할 수 있습니다 및 현재 성공적으로 토마토와 포도 (비 티스 VINIFERA) 식물에도 적용되고있다. 수집 된 진드기 (그림 3) 비교 생리 학적 상태에 있음을 나타내는 프로토콜 수익률 재현 가능한 결과. 이러한 프로토콜을 수행하는 간단하지만 그들은 진드기 회복에 영향을 미치기 때문에, 몇 가지 중요한 단계는 특별한주의가 필요합니다. 잎에서 세탁 진드기는 동시에 최대 세 콩 식물에서 수행하고, 실온에서 물을 사용하여 10 분 이내에 완료해야합니다. 또, 진드기 급속 건조 체에 확산되어야한다. 진드기 회복이 만족스럽지 않은 경우, 트윈 20 세제의 권장 금액은 우리 여부를 확인하는 것이 중요합니다ED...

식물 해충의 상호 작용이 큰 과학 및 경제적 중요성의 주제입니다. 그것은 역사적으로 (예, 토마토 등) 모두 작물과 모델 식물, A.를 사용하여 조사 하였다 장대. 두 경우 모두, 초식 동물에 식물의 감수성은 초식 동물의 공격 또는 간접적으로 해충의 성능 평가를 통해 직접 식물의 표현형의 평가를 통해 하나를 측정 할 수있다. 식물 감수성의 직접적인 측정은 다양한 방법을 사용하여 해충 종의 개수에 대해 이전에 사용되었다. 예를 들어, 나비목 유충의 초식 동물은 격자 (12)의 도움으로 육안으로 배추 xylostella (나방) 또는 Trichoplusia NI (양배추 자벌레) 중 하나에 의해 소비 식물 조직의 일부의 추정으로 측정된다. 또한, 이후의 정량 이미지 분석과 잎 손상의 디지털 이미징을 활용 방법이 있습니다. 이러한 방법이 사용되었다A. 연구 Frankliniella occidentalis (서양 꽃 총채 벌레) 13 Scaptomyza의 Flava의 (잎 마이닝 초파리) (14), 및 T.와 장대의 상호 작용 NI 15. 식물 감수성의 간접 측정 널리 식물 해충의 상호 작용의 연구에 사용된다. A. 예를 들어, 민감도 초식 동물 persicae 진딧물 Myzus을 복숭아하는 장대는 일반적으로 해충의 번식력과의 상호 작용 (16, 17) 후 식물의 심한 형태의 설명의 분석을 통해 평가된다. A.의 또 다른 전형적인 간접 표시 해충에 장대 감수성은 초식 동물의 건조하거나 습 중량 평가입니다. 이 매개 변수는 일반적으로 같은 Pieris rapae (작은 흰색), P.로 lepidoterans의 초식 동물을 특성화하는 데 사용됩니다 xylostella, 또는 T. 자신의 유충이나 번데기에서 NI는 15, 17 스테이지. 거미 진드기는 셀 내용 FE 있습니다eders. 진드기에 의한 손상은 녹색 엷은 흰색의 색상 범위 백화 관광 명소의 컬렉션으로 인식되고 있습니다. 거미 진드기 초식 동물에 식물 호스트의 취약성은 이전에 거미 진드기 성능 일의 분석을 통해 하나를 간접적으로 평가 된 후 감염 18, 19, 또는 직접 식물 주 후 감염 (18)의 심한 형태를 사용하거나 노출 된 잎의 디지털 이미징을 사용하여 이후 자동 이미지 분석 (19) 일 동안 진드기. 이러한 방법은 개발 및 토마토 식물과 T. 사이의 상호 작용의 연구에 사용 된 응애, 전형적 혼합 진드기 모집단으로부터 수거하고 부드러운 강모 솔을 사용하여 잎 표면에 넣었다 거미 응애의 수가 적은 경우 (처리 당 5-15)을 사용 하였다. 그러나, 이들 방법은 더 많은 수의 진드기가 적용될 필요 연구에는 적합하지 않다. 또, 잎 동안 이미지를 직접 처리 이미지 분석 소프트웨어어도비 포토샵 (산호세, CA) 또는 ImageJ에 20 토마토 손상의 분석에 이용 될 수있는 바와 같이, 이들 프로토콜은 표면의 큰 반사율이 있거나 가볍게 착색되어 시인성 상체 (trichome)를 (이 잎에 적용하기 위해 수정이 필요 식물의 손상을 표시 백화 반점의 자동 선택을 방해 예를 들면, A. 장대). 또한, 쉽게 이전의 방법으로 이용 될 수있는 거미 진드기의 발달 단계는 가장 널리 쉽게 식별 성인 여성에 한정하고 다른 발달 단계의 사용을 배제하고 있습니다. 식물 거미 진드기의 상호 작용의 높은 처리량 분석하는 첫 번째 중요한 단계는 거미 진드기와 식물에 도전하고 안정적​​으로 상호 작용의 결과를 평가하기 위해 재생 가능한 간단하고 강력한 프로토콜을 설정하는 것입니다. 이 비디오, 큰 숫자를 빠르고 쉽게 수집을위한 효율적인 방법은BER 성인 여성 진드기, 실험 공장 호스트 인해 거미 진드기의 먹이 식물 손상의 평가에 자신의 응용 프로그램이 설명되어 있습니다. 제시된 프로토콜은 후속 실험 응용 프로그램에 사용될 수있는 모든 발달 단계 (알, 유충, 약충, 성인 남성 및 여성)에 개인의 수백 빠르고 효율적으로 수집 할 수 있습니다. 또한, 이러한 프로토콜은 진드기 숙주 식물에 적용 할 수 있지만, 구체적 A.의 경우 입증된다 장대.

<table><tbody><tr><td>식물 재료 :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>캘리포니아 붉은 강낭콩</td><td>스톡스, 소롤드, 온타리오, 캐나다</td><td></td><td>2 주령, 사용 2-3 일 전에 거미 진드기에 잘 감염됩니다. Phaseolus vulgaris의 다른 품종을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>화학 물질 :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>트윈 20</td><td>시그마 -알드리치</td><td>P9416</td><td>1 % 스톡 용액은 수돗물 분취</td></tr><tr><td></td>를 단순화하기 위해 준비되었습니다 실온에서 열 및 냉 충격은 진드기 생존률과 성능에 영향을 미칩니다 기타 재료 및 장비 : <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 플라스틱 트레이 <tr><td></td><td></td>가위 세트 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 L 비커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>체의 세트</td><td>사내에서</td><td></td> 제조 <td>자세한 지침을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>얇은 브러시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td></td><td></td><td>0.2 및 1 ml</td></tr><tr><td>1.5 ml 원심 분리기 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>공기 펌프</td><td></td><td></td><td>: 공기 흐름이 반전된 수족관 유형 펌프. 진공 라인을 사용할 수 있습니다. 필요한 압력 강하는 약 2-4psi입니다.</td></tr><tr><td>입체경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스캐너</td><td>Epson</td><td>V30</td><td>스캔 품질을 필요한 수준으로 제어할 수 있는 모든 평판 스캐너. 우리는 실험에 Epson V30을 사용합니다.</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td></td><td></td><td>, Windows 또는 OS X, PC, 스캐너, 하드웨어 및 Adobe Photoshop 소프트웨어와 호환됩니다.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 소프트웨어</td><td>Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA</td><td>다양한</td><td>히스토그램 도구가 포함된 모든 버전.</td></tr></tbody></table>

두 발견 거미 진드기의 적용<em&gt; 점박이 응애</em&gt; 식물 해충의 상호 작용 연구

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

두 점박이 응애, 점박이 응애는 경제적 가치의 150 개 이상의와 종의 매우 광범위한, 피드 유비쿼터스 광식 절지 동물 초식 동물입니다. 그것은, 특히 가지과와 박과 같은 옥수수, 면화와 같은 (예를 들면, 토마토, 가지, 고추, 오이, 호박) 및 온실 장식물 (예를 들면, 장미, 국화, 카네이션), 연간 필드 작물 (에, 온실 작물의 주요 해충이다 대두, 사탕무), 및 다년생 문화 (알팔파, 딸기, 포도, 감귤,, 자두), 2에서. 그것은 중요한 농업 해충, T. 만드는 극단적 인 polyphagy에 추가 응애는 제어 3-7에 사용되는 살충제 및 살비제의 다양한 저항을 개발하는 경향이있다. T. 응애는 (27 ° C에서 7 일 간) 빠른 수명주기를 가지고, 훌륭한 실험 유기체쉽게 실험실에서 고밀도로 유지 될 수있다. (현장 하이브리드 항체 염색법에 포함) 유전자 발현을 분석 실험하고 RNA 간섭을 이용하여 거미 진드기 내인성 유전자의 발현을 불 활성화하는 방법은 8-10 개발되었다. 최근, T.의 전체 게놈 서열 응애는 이미 기주 식물 (애기 장대와 토마토 까 lycopersicum) (11)의 일부에 존재하는 상응하는 게놈 자원 모델 생물로이 해충 초식 동물을 개발할 수있는 기회를 만들어보고되고있다. 함께,이 모델 생물은 식물 해충의 상호 작용의 분자 기초에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 여기에 빠르고 쉽게 성인 여성 진드기의 큰 숫자의 컬렉션, 실험 공장 호스트에서 자신의 응용 프로그램 및 때문에 거미 진드기의 먹이 식물 손상의 평가를위한 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. EN 제시 프로토콜이후 실험적인 응용 프로그램에 사용할 수있는 모든 발달 단계 (계란, 애벌레, 애벌레, 성인 남성 및 여성)에 개인의 수백의 신속하고 효율적인 수집을 에이블 스.

20 ~ 30 오염 된 콩 식물을 사용하여, 하나는 체를 사용하여 약 2,000 성인 여성 진드기를 수집 할 수 있습니다. 진드기를 전송하는 브러시를 사용하면 식물 당 20 진드기 10 식물 만연하는 데 필요한 시간은 약 15 분이다. 컬렉션 및 응용 방법의 조합은도 2에 나타낸다. 이 프로토콜은 수집 된 진드기 비슷한 생리 학적 상태와 식물 거미 진드기의 상호 작용 연구에 적합합니다 (그림 3)의 것을 보여주는, 식물 손상의 재현 가능한 결과를 생성합니다. 프로토콜의 재현성을 평가하기 위해, 성인 여성 진드기는 20 진드기가 삼주 이전 A.의 장미 잎에 배치 된 세척 방법을 사용하여 수집 된 젖은 브러시로 장대 식물 (기탁 골-0). 처리 된 식물이 스캐닝 하였다 사일의 postinfestation 손상의 면적은 전술 한 기술을 사용하여 정량 하였다. 반복 실험 결과의 비교는 ANO...

거미 진드기, 실험 식물의 침입, 그리고 식물의 손상 평가의 균일 한 시료의 효율적인 준비를위한 프로토콜, 식물 해충의 상호 작용의 연구에 필요한이 개발되었다.

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

이 절차의 전반적인 목적은 특정 발달 단계의 응애를 빠르고 안정적으로 수집하는 것입니다. 이를 위해 먼저 콩 식물에 응애를 기릅니다. 그다음, 단일 식물에 접종할 응애의 수에 따라 붓이나 펌프를 사용하여 실험 식물에 암컷 응애를 감염시킵니다.마지막 단계는 그래픽 편집 프로그램의 그리드 방법을 사용하여 식물 피해량을 수동으로 정량화하는 것입니다. 최종적으로, 통계 분석을 통해 식물 계통이나 생태형의 응애 피해에 대한 감수성 차이를 나타냅니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 다수의 성체 암컷 응애를 빠르고 쉽게 수집하여 실험 식물 기주에 접종하고, 응애 섭식으로 인한 식물 피해를 평가하는 효율적인 방법을 제공한다는 점입니다.제시된 프로토콜을 통해 후속 실험 응용에 사용할 수 있는 모든 발달 단계의 개체 수백 마리를 빠르고 효율적으로 수집할 수 있습니다. 시작을 위해 캘리포니아 레드 키드니 콩 식물을 씨앗부터 심어 2~3주 동안 성장시킨 후, 이 식물들을 감염된 식물들과 함께 혼합하십시오. 성충 응애들이 신선한 식물 조직으로 빠르게 군집을 형성할 것입니다.세척법을 이용하여 응애를 수집하기 위해, 7~10일마다 감염된 오래된 콩 식물을 제거하고 새로운 식물로 교체하십시오. 실험 1~2일 전에 새로운 콩 식물을 감염된 식물과 접촉시켜 두십시오. 성체 암컷 응애 1000~2000마리를 수집하기 위해 20~30개의 새로운 콩 식물을 사용하십시오.실험 당일에 응애가 감염된 콩 식물의 기부를 자릅니다. 그 다음, 감염된 콩 식물을 한 번에 2~3개씩 0.001% tween 20 용액으로 세척합니다. 잎의 모든 응애를 수집하기 위해 각 식물을 2~3회 세척합니다.응애의 폐사를 방지하기 위해 10분 이내에 작업을 완료하십시오. 다음으로, 이물질을 제거하기 위한 500 µm 체와 성체 암컷 응애를 수집하기 위한 300 µm 체를 준비합니다. 현탁액을 500 µm 체로 여과한 다음, 다시 300 µm 체로 여과하여 현탁액을 채웁니다.체에 거품이 너무 많이 쌓이면 성체 암컷 진드기가 그대로 남아 있을 수 있습니다. 이 경우, 실온의 흐르는 수돗물 아래에서 조심스럽게 세척합니다. 성체 암컷 진드기가 담긴 300 µm 체를 깨끗한 수돗물에 담가 Tween 20을 제거하고, 진드기가 체 바닥에 단일 층으로 퍼지도록 합니다.종이 타월을 사용하여 체의 망과 측면에 남은 과잉 수분을 제거함으로써 진드기가 빠르게 건조되어 회복될 수 있도록 합니다. 다음으로, 진드기가 담긴 체를 지지대 역할을 하는 체 위에 올립니다. 진드기가 흩어지는 것을 방지하기 위해 하단 체의 주변을 물로 둘러쌉니다.이렇게 하면 응애가 자유롭게 이동할 수 있으면서도 탈출하는 것은 방지할 수 있습니다. 식물당 최대 30마리의 응애를 접종할 때는 붓을 사용한 응애 접종법을 이용합니다. 00호 또는 그보다 더 가는 사이즈의 부드러운 모를 가진 원형 미술용 붓을 사용하십시오.실온의 수돗물로 붓을 적십니다. 붓 끝을 사용하여 체에서 응애를 조심스럽게 집어 식물로 옮깁니다. 펌프 진공 라인으로 수집한 응애를 30마리 이상 접종하면 식물 감염이 이루어집니다.이 방법을 위해, 1.5 mL 원심분리 튜브를 사용하여 펌프 또는 진공 라인에 연결되는 튜브에 1 mL 피펫 팁을 부착하십시오. 펌프 진공 튜브와 팁 사이의 어댑터 역할을 하도록 튜브 하단을 절단하고, 피펫 팁과 어댑터 사이에 종이 타월 조각을 배치하십시오. 이는 흡입 과정 동안 피펫 팁 내부에 응애를 가두고 공기 흐름을 줄이기 위함이며, 피펫 팁을 사용하여 체에서 응애를 직접 수집하기 위한 것입니다.또는, 실체 현미경을 사용하여 감염된 잎에서 응애를 한 마리씩 수집합니다. 필요한 수의 응애가 수집되면, 피펫 팁 뒤쪽의 종이 타월 조각이 흐트러지지 않도록 주의하며 튜브에서 피펫 팁을 제거합니다.피펫 팁을 톡톡 두드려 진드기를 모은 다음, 진드기들이 서로 뭉치게 합니다. 그 후 진드기들을 잎 위에 올립니다. 수 초 내에 진드기들이 잎 위로 퍼지기 시작할 것입니다.식물 손상을 기록하려면 스캐너 표면이 식물 재료로 오염되는 것을 방지하기 위해 스캐너 베드를 투명 시트로 덮으십시오. 로제트 전체를 절단하여 스캐너 베드 위에 놓습니다.잎의 엽축면이 스캐너를 향하도록 배치합니다. 광원과 캡처 요소를 통해 여러 개의 로제트를 동시에 스캔할 수 있습니다. 또는, 로제트가 너무 조밀하여 잎들이 서로 겹치지 않게 개별적으로 캡처하기 어려운 경우, 스캐너에 올리기 전 세밀한 가위로 로제트를 개별 잎이나 겹치지 않는 잎 그룹으로 분리하십시오.스캐너 덮개에 달라붙거나 오염되는 것을 방지하기 위해 로제트나 잎을 흰색 종이 한 장으로 덮습니다. 스캐너 덮개를 닫고 해상도는 1,200 DPI, 밝기는 +25, 파일 형식은 최대 품질의 jpeg로 설정하여 스캔을 수행합니다. 이후의 손상 분석을 위해 이미지 파일을 저장합니다.식물 피해를 정량화하려면, Photoshop으로 식물 이미지를 엽니다. 새 레이어를 생성합니다. 그런 다음 스캔한 이미지 위에 25 millimeter 간격의 그리드를 겹칩니다.오버레이 층에 25 밀리미터 간격의 분할선을 표시합니다. 연필 도구를 사용하여 점을 찍어 손상된 잎 부위를 표시하십시오. 아래 격자의 각 칸에서 손상 부위가 격자 단위의 절반 이상을 차지하는 경우, 해당 칸에 점을 하나만 찍으십시오.크기는 픽셀로 정의됩니다. 그리드 단위의 절반 이상을 덮는 식물 손상이 나타나는 모든 그리드 사각형을 점(.)으로 표시한 후, 히스토그램 도구를 사용하여 점의 개수를 나타내는 레이어의 픽셀 수를 결정함으로써, 결과적으로 표시된 사각형의 총 개수를 산출합니다.총 픽셀 수를 점당 픽셀 수로 나누어 표시된 점의 개수를 계산하십시오. 하나의 점이 그리드의 사각형 하나에 해당하므로, 이미지에 표시된 점의 개수에 그리드 사각형의 면적을 곱하여 총 손상 면적을 계산하십시오. 이 그래프는 3주 된 AANA 식물에서 측정된 손상 면적을 나타냅니다.암컷 점박이응애 20마리를 처리한 지 4일 후의 모습입니다. 식물 피해 결과가 재현 가능하다는 점은 수집된 응애들이 유사한 생리학적 상태에 있으며, 식물-점박이응애 상호작용 연구에 적합함을 입증합니다. 이 도표는 암컷 점박이응애 20마리를 처리한 지 4일 후, 3주 된 AANA 식물에서 측정된 피해 면적을 나타냅니다.실험적 적용의 예로, 식물당 20마리의 암컷 응애를 젖은 붓으로 접종하고 감염 4일 후 피해 정도를 기록하여, 세 가지 aana ess에 걸친 응애에 대한 자연 변이와 감수성을 평가하였습니다. 피해 데이터의 정량화 결과는 막대 그래프나 박스 플롯으로 나타낼 수 있으며, 적절한 통계 방법을 통해 분석할 수 있습니다. 본 예시에서 응애에 대한 감수성은 세션 간에 유의미한 차이를 보였습니다.분리 및 감염 단계는 샘플 수와 워크플로우 선택에 따라 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 응애를 20 용액에 10분 이상 담가 두어서는 안 된다는 점에 유의하십시오. 시드 시스템을 이용한 분리는 다양한 발달 단계의 응애 분획을 얻는 데 사용할 수 있으며, 이는 해충-식물 상호작용 분야뿐만 아니라 발달 생리학 및 분자 생물학의 다양한 실험에 활용될 수 있습니다.

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연구

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두 발견 거미 진드기의 적용

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