Name: 바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 학습하세요 바렛 식도 세포의 면역형광 염색법으로 약물 처리 후 단백질 위치 변화와 세포 구조를 형광 현미경으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 암 세포 연구에도 적용 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 세인트 조셉 재단 (AJF, LJI)과 미국 폐 협회, RG-224607-N (LJI)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 셀 라인의 유지 보수 <ol><li> 불후의 성격 효소 (TERT) 단백질 11 반대로 인간 텔로 머라 아제의 안정적인 형질 전환에 의해 고급 이형성 (CP-B, CP-C, CP-D) 및 화생이 있으면서 (CP-A) 세포주합니다. </li><li> 유지 세포 소 뇌하수체 추출물 (BPE), 표피 성장 인자 (EGF), 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 비 필수 아미노산 (NEAA), 페니실린 - 스트렙토 마이신-네오 마이신 (PSN)로 보충 각질 미디어 라인 및 표준 BE 조직 배양 조건 (37 ° C에서 5 % CO 2, 98 % 습도). </li></ol> 2. 셀 도금하고있다 <ol><li> 12 - 웰 플레이트 / 커버 슬립의 제조. 유리 페트리 접시와 오토 클레이브에 18mm 커버 슬립을 놓습니다. 전송 진공관에 부착 멸균 유리 피펫을 사용하여 12 - 웰 조직 배양 접시에 18mm 유리 커버 슬립을 멸균. 멸균 PBS 및 미디어 커버 슬립을 씻으십시오. </li><li> 를 Trypsinize 및 불후의 BE 세포를 계산합니다. 세포 USI를 계산자동 셀 카운터 또는 혈구를 겨. 20,000-40,000 세포 / ml의 농도로 배양 배지에서 세포를 희석. </li><li> 각이 잘 20,000-40,000 세포 / 웰의 총 세포 수에 대한 커버 슬립을 포함에 세포를 1 ㎖를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 세포가 커버 슬립에 부착하도록 우물의 바닥에 커버 슬립을 밀어 멸균 피펫 팁을 사용합니다. </li></ol> BE 세포의 3. 약물 치료 <ol><li> 원하는 농도로 따뜻한 (37 ℃) 매체 선택 약을 희석 반복 튜브를 반전 또는 와류 믹서를 사용하여 잘 섞는다. 경험적으로 결정 약물 농도. 커버 슬립에 대한 세포의 부착을 허용하는 BE 세포의 초기 시딩 다음 치료 24 시간을 시작합니다 </li><li> 비교 및 제어를 위해, 배양 배지에 희석 0.1 % 차량 (디메틸 설폭 사이드 [DMSO] 또는 대리인이 화합물을 용해하는 데 사용)과 함께 세포의 추가 커버 슬립을 취급합니다. 약을 확인하고 Ve에 대한 실험실 펜 라벨 판차 량은 샘플을 처리. 37 ° C, 5 % CO 2, 98 %의 습도로 설정 세포 배양 인큐베이터에 세포를 넣고 원하는 시점에 품어. </li></ol> 4. 면역 형광 염색법 <ol><li> 정착 <ol><li> 약물 치료의 원하는 배양 시간에 따라, 미디어를 대기음 실온 (RT, 25 ° C)에서 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 신속하게 커버 슬립을 씻는다. </li><li> PBS를 대기음도 각각 4 % PFA [4 % PFA / PBS를 함유하는 PBS 1 ㎖를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 4 % PFA / PBS를 대기음 RT에서 PBS와 coverslips는 3 배, 5 분마다 씻어. 원하는 경우 4 ° C에서 PBS/0.1의 % PFA에 일 주일간 매장의 coverslips. </li></ol></li><li> Permeabilization / 차단 항체가 세포 내 표적 액세스 할 수 있도록 고정 PFA 세포를 투과. 세포는 단백질 표면의 경우, 1X의 PBS/0.5의 %의 BSA 용액에 첨가 사포닌하지 않고 이후의 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> 실온에서 10 분 동안 PBS에 희석하는 50 mM NH 4 망할 CIA와 함께 배양하여 배경을 줄이고 5 분 동안 한 번 RT PBS로 세척. </li><li> 0.1 % 사포닌 및 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS의 100-300 μL에 30 분 동안 BE 세포를 배양한다. , 필터 살균 10 %의 주식에서 사포닌을 희석 물을 준비하고 4 ℃에서 저장 </li></ol> 참고 :이 0.5 % BSA의 첨가에 의한 커버 슬립을 차단하여 세포 단백질에 대한 항체의 비특이적 결합 방지 할 수 있습니다. 또한, 항체의 비특이적 결합을 줄이기 위해 5 %로 희석 염소 혈청과 BSA를 대체합니다. </li><li> 인간의 상공 회의소의 준비 <ol><li> 젖은 종이 타월 챔버의 바닥을 적층하여 사각형 생물 검정 접시를 준비하고 위에 파라 필름의 층을 배치합니다. </li><li> 부드럽게 겸자 및 주사기 바늘을 이용하여 파라 필름 상으로 향하도록 커버 슬립, 세포를 옮긴다. </li><li> 커버 슬립을 식별 할 수있는 실험실 펜으로 파라 필름을 표시합니다. </li></ol></li><li>일차 항체 배양 <ol><li> 0.5 % BSA 및 0.1 % 사포닌을 모두 함유하는 PBS에 일차 항체를 희석. </li><li> 부드럽게 실험실 조직을 사용하여 차단 솔루션을 몰아 내고 차 항체 용액 100 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 하룻밤 BE 세포의 일차 항체를 품어 </li></ol></li><li> 차 항체 보육 <ol><li> 슬라이드는 RT에서 5 분마다 PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌으로 3 배 씻으십시오. </li><li> 차 항체는 일차 항체가 발생되었을 때의 종을 인식 PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌에 형광 태그로 복합 이차 항체를 희석. </li><li> 각 coverslip에 희석 항체의 100 μl를 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 차 항체를 품어. </li></ol></li><li> 세척 및 Coverslips는 실장 <ol><li> PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌에 coverslips는 3 배, 5 분마다 씻으십시오. 세척 버퍼를 제거하고 커버 슬립에 PBS의 100 ~ 300 μl를 추가합니다. 참고 : 더블 안티 들어몸의 얼룩, 반복 토론에 나와있는 정보에 따라 원하는 추가 기본 및 보조 항체 4.4-4.5 단계를 반복합니다. </li><li> 집게를 사용하여 부드럽게 커버 슬립을 들어 올려 실험실 조직이나 종이 타월을 사용하여 PBS를 얼룩. </li><li> 유리 현미경 슬라이드에 세포 아래로, 커버 슬립에 4를 포함하는 적절한 안티 페이드 설치 미디어 &#39;-1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)의 15 μl를 추가하고, 커버 슬립을 반전. </li><li> 슬라이드 폴더에 슬라이드를 삽입하고 하드 설정 반대로 페이드 매체는 치료 할 수 있도록 RT에서 하룻밤 직사 빛에서 배양, 제조 업체의 지침에 따라. 반대로 페이드 매체가 설정되면, 슬라이드는 현미경 가시화 될 때까지 C ° 4 °의 C 또는 -20 하나에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> Coverslips는 5. 현미경 시각화 염색 된 세포는 공 초점 현미경 또는 하나를 통해 이미지화 할 수있는 경우 가능한 수직 microscop전자. 공 초점 현미경은 불연속 깊이에 고해상도 이미지를 제공하지만, 직립 현미경 빠르고 유용한 이미지를 생산할 수있다. 간결하게, 영상의 방법은 표준 현미경을 제시하여 셀 BE 스테인드. 일반적으로 이미지 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 또는 유사한 형광 물질 (즉, 녹색 형광 단백질)로, 텍사스 레드와 DAPI,이 형광 물질을 구별 할 수있는 필터를 사용하여 현미경이 필요합니다. 호환 형광을 결정하는 프로토콜을 시작하기 전에 현미경을 확인합니다. <ol><li> 표준 IF 현미경 영상 <ol><li> -20 ° C ~ 4 ° C에서 저장 슬라이드 / 커버 슬립을 제거하고 실내 온도를 따뜻하게 할 수 있습니다. 현미경 및 수은 아크 램프의 전원을 켭니다. </li><li> 커버 슬립이 현미경 무대에 목표를 향과 현미경 슬라이드를 놓습니다. 오일 침지 목적의 사용을 위해, 커버 슬립 상에 침지 기름 방울을 추가한다. </li><li> DAPI 필터를 선택하고 셔터를 엽니 다. </li&gt; <li> 이미지가 나타날 때까지 접안 렌즈를 통해보고하는 동안 목표를 초점을 맞 춥니 다. 모든 셀 DAPI로 염색되므로, 핵은 쉽게 관찰되어야한다. </li><li> 각각의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 수집한다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrett%27s+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma%3A+time+for+a+new+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li>
<li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+Barrett%27s+esophagus+in+the+US%3A+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li>
<li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex%2C+stage%2C+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).</li>
<li>Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Barret%27s+adenocarcinoma+cell+growth+by+simvastatin%3A+involvement+of+COX-2+and+apoptosis-related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins.</a> J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett%27s+adenocarcinoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase%2C+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett%27s+esophagus+cell+lines%3A+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li>
<li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic%2C+Barrett%27s+cell+line+%28BAR-T%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li>
<li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461(2011).</li>
<li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+benign+Barrett%27s+epithelial+cells%2C+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li>
<li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+lifespan+of+Barrett%27s+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit%3A+a+useful+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li>
<li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li>
<li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60%28c-Src%29-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+%CE%B2-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li>
<li>Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin%2FCatenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li>
<li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li>
<li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는이 세포에 따라 타겟 요법의 생리적 효과를 해명으로 BE 세포의 IF를 적용하는 방법을 설명했다. 우리는 BE 세포 향한 이러한 절차의 사용을 설명하는 동안, 우리는이 방법 또한 다른 세포 유형 13,17,18의 다양한 적용 할 수있는 것으로 나타났습니다. 또한, 이러한 절차는 특정 대상에 대한 염색을 최적화하는 여러 가지 방법으로 변경할 수 있습니다. 우리는 적절한 IF에 따라 직접적인 영향을 하나의 매개 변수가 고정의 선택을 찾을 수 있습니다. 우리는 위의 절차에 고정 용 4 % PFA / PBS를 사용하는 방법을 설명했지만 대안 고정 제는 또한 적용 가능하다. 냉 메탄올 고정은 (-20 ° C) 20 분 동안 PBS로 세척 한 후 특정 단백질 / 항체 13에 적합합니다. 고정 용 냉 메탄올의 사용은 세포를 투과 할 필요성을 부정. 그러나, 정착의 선택 (4 % PFA / PBS 또는 냉 메탄올)는 경험적으로 결정해야합니다. <...

바렛 식도 (BE)은 식도의 편평 상피 세포 및 정상적인 위 식도 역류 질환 (GERD) (1)로부터 얻어진 위 내용물에 대한 만성 노출의 결과에 화생이 있으면서 변화이다. BE는 GERD에 대한 응답으로 보호 메커니즘 것으로 생각됩니다, 그러나 BE의 존재는 식도 선암 (EAC), 현저하게 생존율 1을 전달하는 질병의 증가 위험을 부여. 현재 견적은 미국 인구의 최대 5.6 %가달라고하는 것이 좋습니다 BE는 종종 무증상으로, 그러나, BE의 대부분이이 진단되지 않은 남아 있다고 생각합니다. GERD와 EAC 모두의 발생률이 계속 성장 3 본 바와 같이,이 정보는 잠재적으로 EAC하는의 진행을 방지하는 방향으로 치료 방법을 제공 할 수있다, 특히로, EAC하는의 진행에 관여하는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요 해지고있다. 1의 현재 패러다임에 성공. 만성 염증, 상처, 그리고 위의 내용에 장기간 노출로 인한 유전 독성 피해는 EAC에 종양의 진행을 촉진 BE 병변에 선택적 압력을 발휘. 유전 변경의 숫자는 동안 EAC 진행하는 확인되었습니다. 그러나 이것에도 불구하고 세포 신호의 정확한 변화와 세포의 구조와 기능에 따라 이후의 영향에 대한 이해의 명백한 부족하다. 특히 표적 치료 화합물의 효과를 조사에서, 세포 신호 전달의 효과를 연구하기위한 유용한 도구가 시험 관내 세포 라인에 불멸화. 불후의 BE 세포주의 최근 상용화는 연구 할 수 있습니다. 이러한 널리 사용 생존력 분석 높은 처리량 분석법은 세포 증식 및 스와시 타겟 요법의 효과를 평가하는데 유용 할 수 있지만rvival 4-6, 이러한 분석은 세포 형태에 따라 세포 신호 전달의 효과를 심문하는 데 유용하지 않습니다. 면역 형광 염색 (IF)는 세포의 형태학, 성장 및 생존 성과 관련된 단백질시 타겟 요법의 효과를 조사하기위한 유용한 기술이다. 우리 연구소는 약물 치료 7 가능한 화학적 예방법 처리 및 바이오 마커를 서술의 희망 BE 세포 라인에 따라 임상 적으로 사용 가능한 약물의 효과를 평가하는 경우에 사용하는, 불후의 BE 세포 라인으로 이러한 방법을 적용하고있다. 마찬가지로, EAC에서 이러한 기술의 응용 프로그램이 있고 그리고 불후의 식도 세포 라인은 EAC 진행 8-10 일 수에 관한 중요한 연구 결과를 서술하고있다. 표적으로 한 치료로 치료 세포의 분석은 세포 구조와 단백질 지방화의 변화 특성을 허용, 가치가 있다면, 우리는 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 우리의 방법을 제시 IF C로되어 영원 세포의약물 치료를 haracterize.

<table><tbody><tr><td>CP-A (메타플라스틱 세포주)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4027</td><td></td></tr><tr><td>CP-B (고급 이형성 세포주)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4028</td><td></td></tr><tr><td>CP-C (고급 이형성 세포주)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4029</td><td></td></tr><tr><td>CP-D (고급 이형성 세포주)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4030</td><td></td></tr><tr><td>각질세포-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA (1x), 페놀 레드&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified, HI</td><td>Life Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>PSN 항생제 혼합물</td><td>Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>PBS - 인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>원형 유리 커버슬립 18mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-183-86</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-catenin 1차 항체(토끼)</td><td>세포 신호</td><td>9562S</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488(염소 토끼 방지)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>10cm TC 처리 PS 접시, 멸균</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>12웰 TC 처리 PS 플레이트, 멸균</td><td>USA Scientific</td><td>5666-5180</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 - 분획 V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>SKI-606 (Bosutinib)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1014</td><td></td></tr><tr><td>스퀘어 바이오아세이 디쉬&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>파라필름&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82024-546</td><td></td></tr><tr><td>일회용 파스퇴르 피펫, 플린트 유리</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom 미니 셀 카운터</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 계수 챔버</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Apotome 현미경&nbsp;</td><td>자이스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

식도 선암 (EAC)는 전체 생존보다 17 %의 속도와 EAC의 발병률은 지난 20 년 동안 극적으로 증가했다가 있습니다. EAC의 주요 위험 요인 중 하나는 바렛 식도 (BE), 만성 가슴 앓이에 대한 응답으로 정상 편평 식도의 화생이 있으면서 변화입니다. EAC 사이의 잘 설정된 연결에도 불구하고, 분자 이벤트의 진행을 포함 특히 변경된 신호 전달 경로의 심문은 EAC에, 제대로 이해 못할 것이다. 이 중 대부분은 이러한 질병을 연구하는 데 사용할 수 체외 모델에 적합한의 부족 때문이다. 최근 불후의 BE 세포주 BE의 생체 연구를 허용 시판되고있다. 여기서, 우리는 치료 화합물에 노출 된 후 세포 신호 및 구조의 시험 관내 특성화 있도록 BE 불멸화 세포주의 면역 염색을위한 방법을 제시한다. 이러한 기술의 적용은 그러는 것p는 EAC 진행하는에 관련된 메커니즘에 대한 통찰력을 개발하고 치료 및 EAC의 예방을위한 잠재적 인 수단을 제공합니다.

개시된 방법의 애플리케이션으로부터 얻어진 결과의 일례는도 1a-D에 도시되어있다. CP-D와 CP-C BE 세포와 커버 슬립은 Src에 가족 억제제 SKI-606, 또는 차량 (DMSO)의 1 μM로 24 시간 동안 처리하여 단백질, β 신호있는 adherens 접합 Wnt에 대해 위의 절차를 사용하여 염색 - 카테닌. 세포 핵의 라벨이 DAPI (파란색)로 표시하여 수행하는 동안 β-catenin의 시각화는, 녹색 형광체에 결합 된 항 토끼 IgG에있는 라벨에 의해 달성되었다. 커버 슬립은 하드 장착 설정하고 세포가 63X/1.4N 계획 - 고차 색지움 목표를 사용하여 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 몇 군데 사용하여 슬라이드를 현미경에 장착되었다. 선택 녹색 형광체는 488 nm에서 흥분과 505-525 nm에서 방출 필터를 사용하여 시각화 하였다. 마찬가지로, DAPI는 405 nm의 410-460 nm의 필터를 사용하여 수집 방출에 흥분했다. 티로신 키나제에서 Src의 활동 전의 ...

바렛 식도의 분자 드라이버에 대한 개선 된 정보를 식별 할 필요가있다. 면역 형광 염색은 세포 형태에 세포 신호 전달의 효과를 이해하기위한 유용한 기술이다. 우리는 바렛 식도 세포의 치료 적 처치를 평가하기 위하여 면역 형광 염색법을 사용하기위한 간단한 효과적인 프로토콜을 제시한다.

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

다음 실험의 전체적인 목표는 약물 처리가 BE 세포의 세포 구조와 단백질 국소화에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이는 유리 커버슬립 위에서 배양한 BE 세포를 표준 세포 배양 조건에서 선택한 약물과 함께 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 처리된 BE 세포를 고정액과 함께 배양하여 단백질 구조와 국소화를 보존합니다.다음으로, 고정된 be 세포를 1차 항체와 형광 표지된 2차 항체로 순차적으로 배양하여 형광 현미경을 통해 선택한 표적 단백질의 변화를 시각화하며, 면역형광 염색 시각화를 기반으로 약물 처리가 be 세포의 단백질 위치 및 세포 구조를 어떻게 변화시키는지 보여주는 결과를 얻습니다. 이 방법은 바렛 식도(Barrett's esophagus)에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 암세포 및 정상 세포를 포함한 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 18 millimeter 커버슬립을 유리 페트리 접시에 넣고 오토클레이브하여 이 절차를 시작하십시오.그런 다음 진공 튜브에 연결된 멸균 유리 피펫을 사용하여 오토클레이브 멸균된 커버슬립을 12웰 조직 배양 접시로 옮깁니다. 그 후 멸균 PBS와 배지로 커버슬립을 세척합니다. 다음으로 트립신 처리합니다.불멸화 세포의 수를 자동 세포 계수기 또는 혈구 계수기를 사용하여 측정한 후, 배양액으로 희석하여 ml당 20,000 내지 40,000 cells의 농도로 맞춥니다. 그다음 커버슬립이 들어 있는 각 웰에 세포 현탁액 1 ml를 분주합니다. 웰당 총 세포 수가 20,000 내지 40,000 cells가 되도록 멸균 피펫 팁을 사용하여 커버슬립을 웰 바닥으로 부드럽게 밀어 넣어 세포가 커버슬립에 잘 부착되도록 합니다.BE 세포를 처리하려면, 선택한 약물을 37 °C 배지에 희석하여 원하는 농도로 맞춘 후 튜브를 반복해서 뒤집거나 볼텍스 믹서를 사용하여 잘 혼합합니다. 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 BE 세포를 처음 배양한 지 24시간 후에 처리를 시작하십시오. 이제 실험군과 대조군을 구분할 수 있도록 실험실 전용 펜으로 약물 처리 및 용매 처리 샘플 플레이트에 미리 표시하십시오. 추가적인 BE 세포 커버슬립 하나에는 배지에 희석한 0.1% 용매를 처리하십시오.그 후, 세포를 37°C, 5% 이산화탄소 및 98% 습도의 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 약물 처리 후 원하는 배양 시간이 지나면, 배지를 흡입하여 제거하고 실온의 XPBS 1회로 커버슬립을 빠르게 세척합니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 각 웰에 4% PFA가 포함된 PBS 1mL를 첨가한 후 실온에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 4% PFA-PBS를 흡입하여 제거합니다. 커버슬립을 실온의 PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 필요한 경우, 커버슬립을 4°C의 PBS 및 0.1% PFA에 넣어 일주일 동안 보관합니다. 항체가 세포 내 표적에 접근할 수 있도록 고정된 PFA 세포를 투과화하기 위해, PBS에 희석한 50 mM 염화암모늄으로 세포를 실온에서 10분 동안 배양합니다.그 다음, 상온의 PBS로 5분 동안 한 번 세척합니다. 이는 배경 신호를 줄여 항체가 세포 단백질에 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위함입니다. BE 세포를 0.1% troponin과 0.5% BSA가 포함된 100~300 µL의 PBS에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 챔버 바닥에 젖은 종이 타월을 깔고 그 위에 파라필름을 층으로 배치하여 정사각형 바이오어세이 디쉬를 준비합니다. 커버슬립을 식별할 수 있도록 파라필름에 실험실 펜으로 표시합니다. 핀셋과 주사기 바늘을 사용하여 커버슬립의 세포 면이 위를 향하도록 파라필름 위로 조심스럽게 옮깁니다.이제 0.5% BSA와 0.1% saponin이 포함된 PBS로 1차 항체를 희석하고, 블로킹 용액을 부드럽게 닦아냅니다. 실험용 티슈를 사용하여 1차 항체 용액 100 µL를 첨가하고, 세포를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날.실온에서 0.5% BSA와 0.1% troponin이 포함된 PBS로 슬라이드를 5분씩 세 번 세척합니다. 그다음 0.5% BSA와 0.1% ponent가 포함된 PBS에 형광 태그가 결합된 2차 항체를 희석합니다. 희석된 항체 100 µL를 각 커버슬립에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.0.5% BSA와 0.1% troponin이 포함된 PBS로 커버슬립을 5분씩 3회 세척합니다. 세척 버퍼를 제거하고 커버슬립에 100에서 300 µL의 PBS를 추가합니다. 핀셋으로 커버슬립을 조심스럽게 들어 올린 후 실험용 티슈나 페이퍼 타월을 사용하여 PBS를 닦아냅니다.그런 다음 DPI가 포함된 적절한 Antifa 마운팅 매질 15 µL를 커버슬립에 추가합니다. 뒤집힌 커버슬립을 세포 면이 아래로 향하게 하여 유리 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 이후 슬라이드를 슬라이드 폴더에 넣고, Antifa 매질이 경화될 수 있도록 상온에서 하룻밤 동안 직사광선을 피해 보관합니다.Antifa 배지가 굳으면, 현미경 관찰 전까지 슬라이드를 4 °C 또는 -20 °C에 보관할 수 있습니다. 이 단계에서는 -20 °C 또는 4 °C에 보관된 슬라이드를 꺼내어 실온에서 따뜻하게 합니다. 현미경과 수은 아크 램프의 전원을 켭니다.커버 글라스가 대물렌즈를 향하도록 현미경 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 다음으로 DAPI 필터를 선택하고 셔터를 엽니다. 접안렌즈를 통해 보면서 이미지가 나타날 때까지 대물렌즈의 초점을 맞춥니다.모든 세포가 dpi로 염색되었으므로, 핵을 쉽게 관찰할 수 있어야 합니다. 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 수집하십시오. 이 그림의 커버 슬립에 있는 CPC 및 CPD는 vehicle 또는 1 µM의 SRC 억제제인 SKI 6 0 6로 24시간 동안 처리되었습니다. 그 후 세포를 고정하고 염색하였습니다.설명된 프로토콜에 따라, 초록색으로 표시된 beta catenin은 특정 항체와 LOR 4 88이 결합된 2차 항체를 사용하여 시각화하였으며, 핵은 청색으로 표시된 DPI로 염색하였습니다. SKI 6 0 6 처리 후 beta-catenin의 위치가 핵에서 세포막으로 이동한 것을 확인하십시오.이 영상을 시청하신 후에는 단백질 위치 또는 세포 구조를 조사하기 위해 바렛 식도를 면역형광염색하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

an-immunofluorescent-method-for-characterization-barretts-esophagus

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

그러면 표면 항원 (DotScan CRC microarray)를 인식 맞춤 항체 microarrays에 캡처되어 가능한 단일 세포를 생산하는 대장암 (CRC)의 disaggregation에 대한 절차를 설명했다. microarray에 바인딩된 세포의 하위 인구는 형​​광 염료와 태그 단클론 항체를 사용하여 형광 멀티플렉싱하여 프로파일 수 있습니다.

항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

이 동영상은 자유 부유 마우스 jejunum 동결절편에서 장 다발 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법을 보여줍니다. 장 융모 내에서, 확장된 붉은 뿌리 덩어리와 함께 내강 끝에서 녹색 형광의 공동 국소화는 다발 세포의 존재를 나타냅니다.

Jejunum cryosections에서 Tuft 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법

출처: Ear, P. H., et. al. 소장 신경내분비종양 스페로이드의 확립 및 특성화. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 소장 신경내분비 종양 스페로이드의 면역 형광 염색을 보여줍니다. 스페로이드는 고정, 투과화 및 차단된 다음 1차 및 2차 항체와 함께 배양됩니다. 형광 현미경으로 핵을 장착하고 시각화하기 전에 염색하기 위해 염료를 첨가합니다.

면역형광을 이용한 소장 신경내분비종양 스페로이드의 특성화

생명 염색 강화 형광 이미징 (VFI)은 선의 형태를 선택하고 원위 식도 종양 (고급 발육 이상 및 암)을 묘사하는 외인성 국소 형광 대비 높은 해상도 상피 영상을 결합하여 생체 기술의 소설이다.

생명 염색 강화 형광 이미징을 사용하여 바렛 식도에있는 신 생물의 진단

우리는 근섬유아세포 표현형을 가진 쥐와 인간 식도 기질 세포의 1차 배양을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 배양된 세포는 방추체 모양의 형태를 가지고 있으며 α-SMA 및 비멘틴을 발현하며 상피, 조혈 및 내피 세포 표면 마커가 없습니다. 특성화된 기질 세포는 상피-기질 상호 작용의 기능적 연구에 사용할 수 있습니다.

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

이 원고는 생산, 특성화 및 일반 차 인간의 식도 섬유 아세포와 드 cellularized 돼지 비계 내에서 시드 편평 상피 세포로부터 제조 된 조직 설계 3D 식도 구조의 사용 가능성에 대해 설명합니다. 결과 정상적인 인간 식도 유사한 성숙한 상피 성층의 형성을 입증한다.

3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

Multiparameter fluorescence immunohistochemistry는 종양의 미세 환경에서 면역 세포 집단의 수, 상대 분포 및 위치를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 구강 인두 암에서 T 세포 subpopulation을 분석하는이 기술의 사용을 설명합니다.

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

오가노이드-섬유아세포 공동배양은 생체 내 줄기세포 틈새를 연구하기 위한 모델을 제공한다. 여기서, 식도 오가노이드-섬유아세포 공동배양을 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 또한 전체 마운트 이미징을 사용하여 섬유아세포-오가노이드 상호작용을 시각화합니다.

Functional Characterization and Visualization of Espacageal Fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화)

본 프로토콜은 종양 진행의 여러 단계를 나타내는 식도 오가노이드 모델의 확립 및 조직학적 분석을 설명합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 정상 조직에서 암 조직으로 전환하는 동안 세포 형태, 공간 조직 및 분자 마커 발현 패턴의 변화를 연구할 수 있습니다.

정상 조직에서 암 조직으로의 진행을 모델링하는 식도 오가노이드의 확립 및 조직학적 분석

이 프로토콜은 식도 편평세포암(ESCC) 환자에서 동일한 환자에서 암세포, 암 관련 섬유아세포(CAFs), 비종양 관련 섬유아세포(CF)를 동시에 분리하는 방법을 설명합니다. 이러한 환자 맞춤형 자료의 활용은 환자 간 변동성 문제를 피하고 ESCC 연구에 적합한 실험 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

동일한 식도암 환자로부터 종양 오가노이드, 암 관련 섬유아세포 및 대응 섬유아세포의 형성

학습하세요 바렛 식도 세포의 면역형광 염색법으로 약물 처리 후 단백질 위치 변화와 세포 구조를 형광 현미경으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 암 세포 연구에도 적용 가능합니다.

바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법

더 많은 동영상 탐색