바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 BE 세포의 세포 구조 및 단백질 국소화에 대한 약물 치료의 효과를 평가하는 것입니다. 이는 유리 커버 슬립에 성장한 BE 세포를 표준 세포 배양 조건에서 선택한 약물로 배양함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 처리된 세포를 고정액으로 배양하여 단백질 구조와 국소화를 보존합니다.

다음으로, 형광 현미경 검사를 통해 선택된 표적 단백질의 변화를 시각화하기 위해 고정 be 세포를 1차 및 형광 표지된 2차 항체와 함께 순차적으로 배양하고, 면역형광 염색의 시각화를 기반으로 be 세포의 약물 처리가 단백질 국소화 및 세포 구조를 어떻게 변화시키는지 보여주는 결과를 얻습니다. 이 방법은 바렛 식도에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암 및 정상 세포를 포함한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 18mm 커버 슬립을 유리 페트리 접시에 넣고 오토클레이브하여 이 절차를 시작합니다.

그런 다음 진공관에 부착된 멸균 유리 피펫을 사용하여 오토클레이브 커버 슬립을 12웰 조직 배양 접시로 옮깁니다. 세탁 후 덮개가 멸균 PBS와 매체로 미끄러집니다. 다음 트립신.

불멸화 된 세포는 자동화 된 세포 계수기 또는 혈류 세포 분석기를 사용하여 세포를 계수 한 후 배양 배지에서 세포를 밀리리터 당 20, 000에서 40, 000 세포의 농도로 희석합니다. 그런 다음 커버 슬립이 들어 있는 각 웰에 1밀리리터의 세포를 넣습니다. 웰당 총 세포 수가 20, 000 - 40, 000인 경우 멸균 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립을 웰 바닥으로 부드럽게 밀어 셀이 커버 슬립에 부착되도록 합니다.

BE 세포를 처리하려면 선택한 약물을 섭씨 37도 매체에 튜브를 반복적으로 뒤집거나 와류 믹서를 사용하여 원하는 농도 혼합물로 잘 희석합니다. BE 세포의 초기 안착 후 24시간 후에 치료를 시작하여 세포를 덮개에 부착할 수 있도록 이제 사전 라벨링된 약물 및 차량 처리 샘플 플레이트를 실험실 펜으로 밀어 넣어 비교와 대조를 구별합니다. 배양 배지에 희석된 0.1% 비히클로 BE 세포의 추가 커버 슬립을 처리합니다.

그런 다음 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 98%의 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 이제 약물 처리의 원하는 배양 시간이 지나면 배지를 흡인하고 실온에서 하나의 XPBS로 커버 슬립을 빠르게 세척하십시오. 그런 다음 PBS를 흡인하고 각 웰에 4%PFA가 포함된 PBS 1ml를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 4%P-F-A-P-B-S 세척 커버 슬립을 실온에서 PBS로 매번 5분 동안 세 번 세척합니다. 원하는 경우 섭씨 4도에서 PBS 및 0.1%PFA에 일주일 동안 커버 슬립을 보관하십시오. 항체가 세포 내 표적에 접근할 수 있도록 고정된 PFA 세포를 투과할 수 있도록 PBS에 희석된 50밀리몰 염화암모늄으로 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 실온 PBS로 5분 동안 한 번 씻으십시오. 이렇게 하면 백그라운드가 줄어들어 항체가 세포 단백질에 비특이적으로 결합하는 것을 방지할 수 있습니다. 0.1%의 트로포닌과 0.5%의 BSA를 함유한 100-300마이크로리터의 PBS에서 BE 세포를 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 챔버 바닥에 젖은 종이 타월을 겹겹이 쌓고 그 위에 퍼퓸 층을 올려 정사각형 생물 검정 접시를 준비합니다. 커버 슬립을 식별하기 위해 실험실 펜으로 퍼퓸을 표시합니다. 덮개가 위쪽을 향하도록 셀을 집게와 주사기 바늘을 사용하여 매개변수에 부드럽게 옮깁니다.

이제 0.5% BSA와 0.1% 사포닌을 모두 함유한 PBS에서 1차 항체를 희석하여 차단 용액을 부드럽게 닦아냅니다. 실험실 조직을 사용하여 1차 항체 용액 100마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 be 세포를 배양합니다. 다음 날.

0.5%BSA와 0.1%트로포닌이 함유된 PBS로 슬라이드를 실온에서 매번 5분 동안 세 번 세척합니다. 그런 다음 0.5%BSA와 0.1%ponent를 함유하는 PBS에서 형광 태그로 접합된 2차 항체를 희석합니다. 각 커버 슬립에 100마이크로리터의 희석된 항체를 추가하고 2시간 후 실온에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.

0.5%BSA와 0.1%트로포닌을 함유한 PBS에서 커버 슬립을 3회 5분씩 세척합니다. 세탁 버퍼를 제거하고 커버 슬립에 100-300마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 집게로 커버 슬립을 부드럽게 들어 올리고 실험실 티슈나 종이 타월을 사용하여 PBS를 닦아냅니다.

그런 다음 DPI가 포함된 적절한 Antifa 장착 매체 15마이크로리터를 커버 슬립에 추가합니다. 거꾸로 된 커버 슬립을 세포가 아래를 향하도록 하여 유리 현미경 슬라이드에 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 슬라이드 폴더에 넣고 Antifa 매체가 경화될 수 있도록 실온에서 밤새 직사광선을 피하십시오.

Antifa 매체가 설정되면 슬라이드는 현미경으로 시각화할 때까지 섭씨 4도 또는 섭씨 마이너스 20도에서 저장할 수 있습니다. 이 단계에서는 보관 슬라이드를 섭씨 영하 20도 또는 섭씨 4도에서 제거하고 실온으로 데우십시오. 현미경과 수은 아크 램프를 켭니다.

커버 슬립이 대물렌즈 쪽을 향하도록 현미경 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다. 그런 다음 DAPI 필터를 선택하고 셔터를 엽니다. 이미지가 나타날 때까지 접안렌즈를 통해 보면서 대물렌즈의 초점을 맞춥니다.

모든 세포가 dpi로 염색되었기 때문에 핵을 쉽게 관찰할 수 있어야 합니다. 이 그림에서 CPC 및 CPD가 있는 슬립을 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 수집하고, SRC 억제제의 차량 또는 1개의 마이크로몰로 처리했습니다. SKI 6 0 6 24 시간 동안 세포를 고정하고 염색 하였다.

설명된 프로토콜에 따르면, 녹색으로 표시된 베타 카테닌은 특정 항체와 LOR 4 88에 결합된 2차 항체를 사용하여 시각화하고, 핵은 파란색으로 표시된 DPI로 염색했습니다. 베타-카테닌(beta-catenin)의 위치가 핵에서 세포막으로 변하는 것을 주목하라. SKI 치료 후 6 0 6.

이 동영상을 시청한 후에는 단백질 국소화 또는 세포 구조를 조사하기 위해 바렛 식도를 형광 염색하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.