물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차

다음 실험의 전반적인 목표는 원래 바이러스 농축을 위해 설계된 소규모 기술을 사용하여 물에서 바이러스 회수율을 최적화하는 것입니다. 유리 셀룰로오스 필터가 물에서 아데노바이러스를 농축하는 데 가장 적합한 양전하 필터인 것으로 나타났습니다. 2차 용출의 경우, 셀라이트(celite) 2차 농축 기술이 필터 표면에서 아데노바이러스를 용출시키는 데 가장 효과적인 것으로 입증되었습니다. 결과적으로 이 기술은 테스트한 모든 필터 및 용출 조합 중에서 가장 높은 회수율을 보여, 수돗물로부터 가장 많은 아데노바이러스를 회수합니다.

대규모 부피 농축과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 더 적은 양의 시료 부피를 사용한다는 것이며, 이를 통해 다수의 농축 변수를 빠르고 쉽게 평가할 수 있습니다.

이 프로토콜을 준비할 때, 1mL당 10~100,000 MPN 농도로 0.22 micron 필터링된 바이러스 용액을 포함하여 필요한 모든 용액을 미리 준비하십시오.

먼저 멸균된 수돗물 1L를 측정합니다. 이를 마그네틱 스터바가 들어 있는 2L 비커로 옮깁니다. 물을 교반하면서 티오황산나트륨 0.7g을 첨가하고 완전히 용해될 때까지 기다립니다. 그런 다음 1M 산 또는 염기 표준 용액을 한 방울씩 첨가하여 pH를 7에서 7.5 사이로 조정합니다. 다음으로, 물에 바이러스를 접종합니다. 준비된 바이러스 용액 1mL를 모두 첨가합니다. 플라스크를 멸균 랩으로 덮고 바이러스가 물과 섞이도록 10분 동안 둡니다.

그동안 Millipore 필터를 준비합니다. 먼저 포장재에서 필터를 꺼내 상단 보울과 하단 스크린 사이에 빈틈없이 밀착되었는지 확인합니다. 다음으로 필터의 코르크 재질이 1L 사이드암 플라스크의 입구에 꼭 맞는지 확인합니다. 이제 필터의 상단 보울을 제거하고, 핀셋을 사용하여 47mm 양전하 필터 디스크를 필터 스크린 위에 정확하게 배치합니다. 그런 다음 보울을 다시 부착하고 반시계 방향으로 돌려 고정합니다.

멸균 실린더를 사용하여 스파이크 처리된 수돗물 100 milliliters를 측정합니다. 그런 다음, 이 물을 2 liter 플라스크에 준비된 필터 하우징으로 옮깁니다. 필터의 양전하 디스크는 플리츠형 유리-셀룰로오스 또는 나노 알루미나 유리 섬유일 수 있습니다. 필터에 남은 물을 통과시키기 위해 약한 진공을 사용할 수 있습니다.

이제 필터 하우징을 250 milliliter 사이드암 플라스크로 옮기십시오. 소고기 추출액 100 milliliters를 측정하여 필터 위에 천천히 붓습니다. 추출액이 천천히 통과하게 두고, 약한 진공을 사용하여 잔류물을 끌어내십시오.

그다음 두 가지 2차 농축 옵션 중 하나를 선택하여 진행하십시오.

Celite를 사용하여 바이러스를 농축하려면, 바이러스가 포함된 250 milliliter 플라스크의 내용물을 교반기에 옮깁니다. 마그네틱 바를 사용하여 작은 와류를 형성합니다. 다음으로, 100 milliliters의 소고기 추출물에 0.1 grams의 Celite 분말을 첨가합니다. Celite가 분산되도록 두고 용액의 pH를 조절할 준비를 합니다. 0.1 molar 염산을 한 방울씩 첨가하여 pH를 4.0으로 낮춥니다.

그 다음 용액을 10분 동안 혼합합니다. 혼합하는 동안 47 mL 프리필터를 2 L 플라스크에 장착합니다. 이제 소고기 추출물-celite 혼합물 100 mL를 프리필터에 통과시켜 붓습니다. 완료를 위해 약한 진공을 사용할 수 있습니다.

다음으로 필터 하우징 스파우트 끝에 금속 튜브 클립을 끼웁니다. 클립에 멸균된 15 milliliter 폴리프로필렌 수집 튜브를 부착한 후, 플라스크에 필터를 다시 조립합니다.

이제 pH 9의 1X PBS 5 mL를 사용하여 Celite 입자로부터 바이러스를 용리합니다. PBS의 대부분이 중력에 의해 15 mL 튜브로 떨어지도록 둔 다음, 잔여물은 약한 진공을 사용하여 끌어내립니다. 유기 응집법(organic flocculation)을 이용하여 바이러스를 농축하려면, 바이러스가 포함된 250 mL 플라스크의 내용물을 교반기에 옮깁니다. 스터 바(stir bar)를 사용하여 작은 소용돌이를 만듭니다. 1 M 염산을 한 방울씩 첨가하여 용액의 pH를 3.5로 조정합니다. 그런 다음 혼합물을 30분 동안 교반합니다. 이후 용액을 멸균된 250 mL 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4 °C에서 2,500 g로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 튜브를 다룰 때 펠렛(pellet)이 손상되지 않도록 주의하십시오. 상층액을 조심스럽게 따라내고 펠렛을 pH 9의 PBS 5 mL에 재현탁합니다. 펠렛이 완전히 용해되었는지 확인합니다. 그 다음 재현탁액을 4 °C에서 4,000 g로 10분 동안 원심분리합니다. 이제 농축된 바이러스가 포함된 상층액을 수집합니다. 펠렛은 폐기해도 좋습니다.

본 프로토콜을 최적화하는 과정에서 세 가지 종류의 셀라이트(celite)를 비교하였습니다. 입자가 더 큰 셀라이트를 사용했을 때 ADV 40과 ADV 41 모두의 회수율이 더 낮게 나타났습니다.

필터에서 ADV 입자를 수집하는 데 가장 효과적인 조건을 결정하기 위해 pH 7.5에서 12 사이에서 필터 용출 시험을 진행하였습니다. 유리-셀룰로오스 필터에 pH 10의 소고기 추출물과 셀라이트(celite)를 함께 사용했을 때 가장 높은 회수율을 얻었습니다. ADV 40과 ADV 41에서도 동일한 결과가 나타났습니다.

pH 10에서의 소고기 추출물이 유기 응집보다 더 우수한 것으로 입증되었습니다.

최적화된 방법을 25% trypsin을 추가한 경우 및 소고기 추출물에 0.1% sodium polyphosphate를 첨가한 경우와 비교하였습니다. 두 처리 모두 ADV 회수율을 유의미하게 개선하지 못했습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 45분 이내에 완료할 수 있습니다.