Name: 신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 학습하세요 임피던스 기반 실시간 세포 분석기를 이용하여 신경 세포주의 사이토프로텍션을 모니터링하고 제2전달체 경로의 역할을 규명하는 방법을. 이 기술은 신경보호 화합물을 고효율로 평가할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

연구에 제시된 실험에 대한 재정적 지원은 스위스 국립과학재단의 Marie Heim-Vögtlin 프로그램에서 제공되었습니다.
실시간 세포 분석기 데이터에서 통계적으로 유의미한 차이를 스크리닝하기 위해 수정된 MATLAB 프로그램 세트를 개발한 Johanna Nyffeler와 유익한 토론을 해주신 Yama Abassi 박사님께 감사드립니다.

1 준비 <ol><li> 37 ° C에서 5 % CO 2 세트 조직 문화 인큐베이터에서 실시간 세포 분석기의 역을 놓습니다. 멸균 조건 하에서 조직 배양 후드 내의 모든 세포 배양 처리 및 약리 치료를 수행한다. </li><li> NOTE : 표준 배양 조건에 비해 서로 다른 온도 설정을 필요로하는 신경 세포 라인, 그에 따라 조정되어야한다. 약하게 부착 세포주를 들어, E-96 플레이트의 웰의 바닥에 금 미소 전극과 세포의 상호 작용을 용이하게하기 위해 코팅제를 사용한다. </li><li> (적당한 용매에 신경 보호제 또는 두번째 메신저 경로 억제제 - 디메틸 설폭 사이드 또는 멸균) 1000 배 스톡 세포 배양 치료를위한 약물 화합물의 솔루션을 준비하고 -20 ° C에 저장합니다. 다음과 같은 치료에 차량과 같은 용매를 사용합니다. </li><li> DMEM / F1 문화 인간 신경 모세포종 SK-N-SH 세포이 매체는, 약 75 %의 밀도로 175cm 2면과 세포 배양 플라스크에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS) (증식 배지)로 보충. 세포 증식 및 세포 독성에 대한 응답 속도의 관점에서 실험 사이의 일관성을 확인하기 위해 (약 10 유로의) 범위 내에서 세포 통로 번호를 유지합니다. 하부 통로 번호가 바람직하다. </li><li> PBS에 부착 SK-N-SH 세포 층을 세척하고, 37 ℃에서 5 분 동안 0.05 % 트립신-EDTA 용액으로를 Trypsinize. 원심 분리기는 5 분 동안 170 × g에서 세포를 트립신을 제거합니다. 10 ml의 증식 배지에서 세포를 재현 탁. 홀 셀 카운터 셀 카운트 및 증식 배지로 희석하여 세포를 300,000 세포 / ml의 세포 수를 조정한다. </li></ol> 2 도금 및 SK-N-SH 세포의 증식 <ol><li> E-플레이트 (96)의 각 웰에 100 ㎕의 증식 매체를 추가하고 평형을 RT에서 조직 문화 후드에서 30 분 정도 둡니다. E-괞 찮아 삽입37 ° C에서의 CO 2 배양기에서 실시간 세포 분석기 역에서 테 96. </li><li> 실시간 셀 분석기 소프트웨어를 시작. 레이아웃 페이지에서 우물 실험에 포함 된 선택하고 편집 상자에 셀 타입, 휴대폰 번호, 이름 및 세포 치료에 사용되는 화학 물질의 농도에 대한 정보를 입력합니다. 참고 :이 프로토콜의 목적을 위해 최소 4 회 반복 각각의 치료를 위해 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 스케줄 소프트웨어 페이지 실험에서, 세포 지수와 각 단계의 스위프 사이의 간격을 측정 스위프의 번호를 선택하여 포함 &quot;단계&quot;를 결정한다. 1 단계는 배경에 소정의 측정되기 때문에, 셀 인덱스 96 시간 동안 15 분마다 측정하고, 2 단계로 설정 &quot;하는 단계를 추가&quot;를 선택한다. 참고 : 치료를 들어,있는 빠른 반응 속도와 효과가 예상되는 짧은 간격으로 스윕을 설정합니다. </li><li> 자동으로 미리 정해진 단계를 시작하려면 시작을 클릭 한및 매체의 배경 임피던스를 측정한다. 세포를 웰에 첨가하면이 값이 자동으로 각 데이터 포인트에서 소프트웨어에 의해 감산된다. </li><li> 증식 배지에서 300,000 세포 / ml의 1.5 이전 단계에서 제조 됨) 세포 현탁액을 사용한다. / 웰 세포 독성 / 신경 연구와 잘 세포 증식 연구를위한 15,000 세포 / 30,000 세포. E-플레이트를 꺼내 세포 독성 / 신경 연구를 위해 잘 당 100 ㎕의 세포 현탁액을 추가하고 세포 증식 연구를 위해 잘 당 50 μL 세포 현탁액 50 ㎕의 증식 매체를 추가 할 수 있습니다. 물론 당 도금 셀의 수는 경험적으로 각 세포주에 대해 최적화 될 필요가있다. </li><li> 조심스럽게 세포의 경우에도 도금 E-플레이트 96 소용돌이 친다. 세포가 웰의 바닥에 균일하게 정착 할 수 있도록 RT에서 조직 배양 후드에서 30 분 동안 E-플레이트 (96)를 떠난다. </li><li> 실시간 세포 분석 국에 E-플레이트 (96)를 삽입하고 일정 페이지에 2 단계를 시작연령. 플롯 페이지 및 소프트웨어 셀 인덱스 페이지 원시 셀 색인 데이터 셀 곡선을 보면 실험 내내 셀 인덱스 값을 모니터한다. </li></ol> 3 혈청 박탈 <ol><li> 24 시간 후 세포를 도금 실험을 일시 중지하고, 실시간 셀 분석기 역 E-플레이트 (96)를 제거한다. DMEM / F12의 무 혈청 배지로 1000 배 주식에서 두번째 메신저 억제제를 희석 - 200에 최종 농도 ×. 각각의 경로를 억제하기 위해, 두번째 메신저 경로의 1 μL 억제제가 30 분 세포 독성을 시작하기 전에 신경 독성 / 신경에서의 참여를 판정하는과 세포를 치료. 역에 E-플레이트 (96)를 돌려 실험 휴대 지수 측정을 다시 시작합니다. </li><li> 30 분 후 다시 실험을 일시 중지합니다. 조심스럽게 부착 된 세포층을 방해하지 않도록주의하면서 피펫 (또는 멀티 채널 피펫)와 E-플레이트에서 완전히 96 우물을 확산 매체를 제거웰의 코너 피펫 팁의 끝을 지시함으로써. 200 μL / 무 혈청 DMEM / F12 배지 (혈청 박탈 매체)의도를 추가합니다. 세포의 기계적 교반을 최소화하는 세포 배양 배지의 신속한 교환을 보장한다. </li><li> 화합물을 희석하는 최종 농도 × 200 무 혈청 DMEM / F12 매체와 1000 배의 재고 자신의 신경에 미치는 영향을 평가한다. 1 ㎕의 화합물을 추가하는 것은 자신의 신경 보호 효과와 실험 계획에 따라 개별 우물에서 두번째 메신저 경로의 1 μL 억제제 테스트합니다. </li><li> 확산 연구에 대한 세포에서 매체를 변경하지 않습니다. 물론 당 1 μL로 처리 증식 배지에서 문화를 계속 확산 매체의 최종 농도 × 200에 1000 배의 재고에서 테스트 할 화합물을 희석. </li><li> 이전에 설정 한 96 시간 동안 셀 지수 측정과 매 15 분을 계속 실험을 다시 시작합니다. </li></ol> (4) 데이터(분석) <ol><li> 신경 독성은 / 신경 데이터는 플롯 페이지의 &quot;시간을 정상화&quot; &quot;표준화 된 셀 인덱스&quot;를 선택하여 실험 간의 편차를 줄이고하기 위해 약물 치료 또는 매체 변경 전 마지막 포인트로 셀 인덱스를 정상화. </li><li> 관심의 실험 조건에 대한 플롯 페이지의 우물을 선택하고 정규화 된 셀 인덱스 곡선을 그릴 &quot;추가&quot;를 클릭합니다. 또는 시간의 함수로 정규화 된 셀 인덱스 곡선으로 두번째 메신저 억제의 신경 독성 / 신경 보호 효과의 반응 속도를 관찰한다. </li><li> 증식에 대한 신경 보호 효과 / 신경 독성 효과에 관여되는지 여부를 평가하기 위해 시간의 함수로서 증식 배지에서 시험 약물 치료 용 세포 지수 곡선을 관찰한다. </li><li> 결과의 통계적인 평가를 개시 엑셀 파일로 셀 색인 소프트웨어 페이지의 모든 셀 인덱스 시점에 대한 정보를 내보내는 실험 <br/&gt; NOTE : 통계 분석에서 초기 단계의 p 값, 웰치 t-테스트를​​ 사용하여 개질 MATLAB 프로그램 세트 semilogarithmically 플롯으로 (보조 코드 파일로 제공되는)의 시간 척도에 대하여 반전 축을 이용한다. 이러한 프로그램은, 전체 실시간 셀 분석기 실험의 시간 과정을 통해 P-값의 검출을 허용하고, 따라서보다 상세한 통계적 분석 시점의 선택을 돕기. 프로그램에 대한 자세한 내용은 보충 자료를 참조하십시오. </li><li> 특정 시점에서 다른 처리 조건 하에서 셀 인덱스 값의 차이의 통계적 분석을 위해, 반출 엑셀 파일에서 각각의 시점에서 셀을 선택 인덱스 값. 통계 소프트웨어를 이용하여 사후 시험 뒤에 분산의 단방향 또는 양방향 분석 (ANOVA)으로 선택한 시점에서 셀 인덱스 값들을 분석한다. </li></ol>

<ol><li>Cavallucci, V., D'Amelio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+of+life+and+death%3A+the+pharmacological+approaches+targeting+apoptosis+in+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases.</a> Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).</li>
<li>Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBull%2C+S+%22Focus+on+Neurological+Diseases%22">Focus on Neurological Diseases</a>. , Health Protection Agency. (2007).</li>
<li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Diemert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+measurement+for+real-time+detection+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).</li>
<li>Kustermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free%2C+impedance-based+real+time+assay+to+identify+drug-induced+toxicities+and+differentiate+cytostatic+from+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects.</a> Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).</li>
<li>Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT2A+serotonin+receptor+agonist+DOI+alleviates+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%3A+role+of+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).</li>
<li>González-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+recruit+specific+cortical+5-HT%282A%29+receptor-mediated+signaling+pathways+to+affect+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+%285-HT%29+induces+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+%28GDNF%29+mRNA+expression+via+the+transactivation+of+fibroblast+growth+factor+receptor+2+%28FGFR2%29+in+rat+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells.</a> J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).</li>
<li>Galante, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity%2C+conformation+and+morphology+of+typical+initial+aggregation+states+of+A%CE%B21-42+and+A%CE%B2py3-42+beta-amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).</li>
<li>Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+or+target+deprivation-induced+neuronal+death+causes+oxidative+neuronal+accumulation+of+Zn2%2Band+loss+of+NAD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).</li>
</ol>

현재 비디오 기사에 대한 출판 비용은 &quot;ACEA 생명 과학&quot;에 의해 후원되었다.

현재 프로토콜은 연속적 및 라벨없는 조건에서 신경 세포주에서 화합물의 신경 / 신경 독성 효과를 평가하기 위해 상기 효과에 관련된 제 메신저 경로에 대한 통찰력을 얻기 위해 실시간 셀 분석기의 유틸리티를 제공한다. 세포 독성 및 세포 증식에​​ 대한 약물의 효과를 연구하기 위해 실시간 셀 분석기 효용은 일반적으로 인식 되더라도, 단지 몇 연구는 신경 관련 세포 유형에서 사용했다. GALANTE 외.은, 도시 한 상태에서 우리는 이전에 그것의 신경 독성을 평가하기 위해 사용될 수 있으며, 인간 신경 아세포종 SK-N-SH 세포에서의 5-HT 2A 수용체 작용제의 신경 보호를 모니터링하는 실시간 셀 분석기의 유용성을 보여 주었다 인간 신경 모세포종 SH-SY5Y 세포 7,10 베타 - 아밀로이드 펩타이드. 최근의 연구는 실시간 셀 분석기 측정하면서 안정적으로 증식과 세포 사멸 세포를 제안했다euronal 세포주 및 신경 전구...

신경 세포의 사멸이 많은 뇌 관련 질환의 병태 생리 1에서 중요한 역할을한다. 체외 독성 분석의 신뢰성 및 높은 처리량의 가용성은 신경 독성의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 약물 개발이의 치료 후보로 신경 분자를 선택하기 위해 매우 중요합니다. 그러나 가장 널리 운동 해상도를 허용하지 않는 하나의 시간 시점에서 신경 독성 / 신경을 평가 체외 신경 독성 assays.They 사용에 많은 제한이있다; 종종 신호 전달 경로를 방해하고 같은 세포 집단에서 추가 연구를 제한하고, 종종 노동 집약적이며, 많은 경우에 기계적인 통찰력을 제공하지 않습니다 수 있습니다 라벨 또는 프로브를 사용합니다. 본 연구에서 우리는 실시간 미만 신경 세포주에서 세포 독성 및 신경 보호를 결정하기 위해 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 증명 라벨없는조건 효과에 관련된 제 메신저 경로의 분석을 통해 하류 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고. 이전의 연구는 표준 기법 3,4,5,6 비해 세포 독성은 물론 세포주에서 세포 증식에 미치는 영향을 결정하기 위해 실시간 세포 분석의 유효성을 확인했다. 예를 들어, 상관 관계는 기저 증식 조건 및 HeLa 세포에서 3 개의 다른 독성 패러다임 후 여러 시점에서 표준 세포 생존 WST-1 분석의 판독 및 셀 인덱스 값 사이에서 관찰되었다. 셀 지수 측정에 의해 평가하고 표준 적 사용 sulforhodamine의 B (SRB) 분석 4시 미세 소관 안정 파클리탁셀과 자극 A549 및 MDA-MB-231 세포의 증식과 세포 독성은 매우 유사한 값을 나타내었다. 불후의 해마 신경 세포의 신경 세포 라인에서 HT-22 세포 지수 측정은 자신의 능력 t에 대해 검증 하였다O 널리 사용되는 3 - (4,5 - 디메틸 -2 - 일)에 대해 세포 증식, 글루타메이트 독성 세포 보호 및 2,5 - 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석 (5)를 검출한다. 같은 연구에서, MTT 분석 결과 및 셀 인덱스 측정은 또한 팬 카스파 제 억제제 QVD (5)에 의해 성장 인자 결핍 및 세포 독성의 복구 후 신경 전구 세포의 증식, 세포 독성을 측정하는 상관 관계. Vandetanib (혈관 내피 성장 인자 수용체 및 표피 성장 인자 수용체 억제제)으로 NIH 3T3 세포에서 유도 된 세포 독성 세포 인덱스 값 또는 중성 적색 흡수 분석법 (6)로 측정 유사한 결과를 보였다. 우리가 최근 세로토닌 2A의 신경 보호 효과를 평가하기 위해 실시간 세포 분석 시스템을 사용 하였다 (5-HT 2A) 수용체 작용제, (±) -2,5 - 디메 톡시 4 - iodoamphetamine 염산염 신경 세포주 (DOI) ( SK-N-SH 세포)와 세코의 참​​여에 대한 검사관찰 된 신경 보호 (7) 상에 화학적 억제의 효과를 모니터링을 통해 차 메신저 경로. 흥미롭게도, 5-HT의 2A 수용체는 일반적으로 별개의 두번째 메신저 경로 팔 모두를 활성화시킬 수있다 (DOI 및 lisuride 각각 같은) 환각 및 nonhallucinogenic 모두 효능을 가지고 있습니다. 제시된 기술의 이점은, 일의 과정에서 세포 생존에 대한 정보를 실시간으로 수집하는 신경에​​ 대한 증식 효과 가능한 공헌을 평가하고 최적 시간을 선택하는 제 메신저 경로가 관여 묘사 할 수 있다는 점이다 같은 세포 집단에 대한 자세한 엔드 포인트의 연구. 현재 프로토콜의 워크 플로우의 개략도는 그림 1에 제시되어있다.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence&nbsp; RTCA SP 시스템 번들</td><td>ACEA Biosciences</td><td>번호: 00380601030</td><td>RTCA 분석기, RTCA SP 스테이션 및 RTCA 제어 장치로 구성</td></tr><tr><td>E-plate 96</td><td>ACEA Biosciences</td><td>번호: 05232368001</td><td>RTCA SP Station</td></tr><tr><td>SK-N-SH 세포</td>에 삽입된 세포 배양을 위해 <td>ATCC (LGC 표준과 협력하여)</td><td>HTB-11</td><td>다른 관심 있는 부착 뉴런 세포선으로 대체될 수</td></tr> 있습니다<tr><td>. DMEM/F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>16140-063</td><td>보충제 증식, 혈청 박탈 배지는 아님</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.302</td><td>나중에 E-Plate 96</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>에 도금될 세포 배양용조직 배양 플라스크에서 배양된 세포의 트립신화용</td></tr><tr><td>Scepter 2.0 cell counter</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Automated cell counter</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>세포 세척용</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-DOI 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D101</td><td>5-HT2A 세포 배양 치료용 작용제</td></tr><tr><td>LY-294002 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9908</td><td>PI3-K 억제제 세포 배양 치료용&nbsp;</td></tr><tr><td>세포 배양 처리를 위한 5-HT2A 작용 활성을 가진</td> <td>리수리드</td> 말레산염 <td>Tocris Bioscience</td><td>4052</td> 화합물</tr><tr><td>LY-294002 및 리수리드 말레산염 용해용</td> <td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>D4540</td></tr></tbody></table>

신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

많은 뇌 관련 질환은 병태 생리에 관여하는 신경 세포의 죽음이있다. 약물과 신경 / 신경 독성의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 확보하고 잠재적으로 신약 개발을 촉진 할 수 있습니다 도움이 될 관련 다운 스트림 경로의 신경 또는 신경 독성 효과를 연구하기 위해 체외 모델에서 개선. 그러나, 기존의 많은 시험 관내 독성 분석법은 중요한 제한이 - 가장 안 시간 코스 및 효과의 동력학을 관찰 할 수 있도록, 하나의 시점에서 신경 보호 및 신경 독성을 평가한다. 또한, 실시간으로 신경 보호에 관여하는 신호 전달 경로 다운 스트림에 대한 정보를 수집 할 수있는 기회는 매우 중요하다. 현재의 프로토콜에서는 라벨없는 실시간 condit하에 신경 세포주에서 세로토닌 2A (5-HT의 2A) 수용체 작용제의 신경 보호 효과를 결정하기 위해 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 사용을 설명임피던스 측정을 이용하여 이온. 더욱이, 우리는 제 메신저 경로의 억제제는 신경 보호 효과에 관여하는 분자 스트림을 묘사하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 우리는 또한 세포 증식에​​ 영향이 관찰 된 신경 보호 효과에 기여 여부를 확인하려면이 기술의 유틸리티를 설명합니다. 시스템은, 웰의 바닥 표면에 금 미세 전극 배열을 교대 셀 센서로서 포함 E-플레이트라고도 특수 마이크로 플레이트를 이용한다. 임피던스 읽기가 부착 세포, 세포 생존, 형태, 및 접착 숫자로 변경된다. 셀 인덱스라는 무 차원 파라미터는 전기 임피던스 측정으로부터 도출되고, 상기 셀의 상태를 나타내는 데 사용된다. 전반적으로, 실시간 임피던스 기반 세포 분석기는 더 기여 실시간, 신경 보호 및 신경 독성의 라벨없는 평가, 및 제 메신저 경로 개입의 평가를 허용치료 후보를 선택하기위한 시험 관내에서 잠재 신경 화합물의 상세하고 높은 처리량 평가.

<html> 혈청 부족은 실시간 셀 분석기로 연속적으로 모니터링 할 수있다 셀 인덱스 값에서 감소하는 리드 세포 신경 독성 자극 제시된 기법 및 특정 신경 독성 자극과 연구 세포 유형에 의존하는 역학과 실시간으로 모니터링 할 수있다 셀 인덱스 값의 저하를 초래할.도 2의 증가를 보여 SK-N-SH 세포는 고원 (녹색 선)과 박탈 매체 (빨간 선) 혈청하는 세포를 전환 한 후 새로운 낮은 수준에서 안정화 한 다음 세포 지수의 하락에 도달 할 때까지 증식 배지에서 재배되는 셀 인덱스입니다. 이 드롭 인해 혈청 철수 세포 접착 성 변화를 나타낼 수있다. 약물 치료의 신경 보호 효과는 실시간 셀 분석기로 연속적으로 모니터링 할 수있다 &quot;&gt; 동시에 (동시 처리) 또는 신경 독성 자극 후 (셀 회수 제안)에서 (전처리) 전에 ...

개선된 체외 신경독성 분석은 새로운 신경보호 화합물을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 신경 세포주에서 세포 독성 및 세포 보호를 결정하고 두 번째 메신저 경로의 관여를 설명하여 신경 보호 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위한 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 제시합니다.

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

이 절차의 전반적인 목표는 임피던스 기반 기술을 사용하여 뉴런 세포주의 실시간 세포 보호 작용을 추적함으로써 보호 과정에서 2차 전령 경로의 관여도를 규명하는 것입니다. 이는 먼저 임피던스 기반 실시간 세포 분석기에서 증식 조건 하에 뉴런 세포주를 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 잠재적으로 관련이 있는.신경 보호 처리를 세포주에 적용하기 전, 약리학적으로 2차 전령 경로를 억제합니다. 다음으로, 다양한 실험 조건 하에서 실시간 세포 분석기를 사용하여 신경 세포주의 상태를 관찰합니다. 최종적으로, 통계 분석을 통해 신경 세포의 세포 보호 과정에서 2차 전령 경로가 실시간으로 관여하는지 평가할 수 있습니다.이 기술의 기존 종말점 신경독성 분석법(endpoint neurotoxicity assays)과 같은 방법 대비 주요 장점은, 표지 없이 실시간으로 신경 세포주에서 Tito 보호 및 Tito 독성을 평가할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 in vitro에서 잠재적인 신경 보호 화합물을 더욱 고처리량으로 평가하고, 신경 보호에 관여하는 분자적 기전에 대한 통찰력을 제공함으로써 분자 신경생물학 분야의 신속한 의문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 먼저 부착성 신경 세포주 층을 세척하는 것부터 시작하십시오. 예를 들어, 여기서는 인간 신경모세포종 S-K-N-S-H 세포를 PBS로 세척한 후 37 °C에서 5분 동안 트립신 처리합니다.원심분리를 통해 트립신을 제거한 후, 세포를 10 milliliters의 증식 배지에 재현탁합니다. 세포 수를 측정한 후, 증식 배지를 더 추가하여 세포 농도를 3 × 10⁵ cells/milliliter로 희석하고, 조직 배양 후드 내의 실온 상태에서 EPL 96의 각 웰에 100 microliters의 증식 배지를 넣어 평형을 맞춥니다. 30분 후, 37 °C의 이산화탄소 배양기 내에 있는 실시간 세포 분석기 스테이션에 EPL 96을 삽입하고 실시간 세포 분석 소프트웨어를 실행합니다.그런 다음 레이아웃 페이지에서 실험에 적합한 웰을 선택하고, 단계 1이 미리 설정되어 있으므로 스케줄 소프트웨어 페이지의 편집 상자에 세포 종류, 세포 수, 그리고 관심 있는 화학 화합물의 이름과 농도를 입력합니다. 배경 측정의 경우, '단계 추가'를 선택하고 단계 2를 96시간 동안 15분마다 세포 지수(cell index)를 측정하도록 설정합니다. 그 후 '시작'을 클릭하여 단계 1을 개시하고 배지의 배경 임피던스를 측정합니다.이제 EPL을 제거하고 100 µL의 신경모세포종 세포 현탁액을 추가합니다. 각 실험 웰에 EPL 96을 조심스럽게 회전시켜 웰에 고르게 코팅한 다음, 세포가 가라앉을 수 있도록 조직 배양 후드 내의 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 EPL 96을 실시간 세포 분석기 스테이션에 다시 장착하고 2단계를 시작합니다. 실험 전반에 걸쳐 세포 지수 값을 모니터링하려면, 플롯 페이지의 세포 곡선과 세포 지수 페이지의 24시간 raw 세포 지수 데이터를 확인하십시오.세포를 플레이팅한 후, 실험을 일시 정지하고 실시간 세포 분석기 스테이션에서 플레이트를 제거합니다. 각 웰에 갓 희석한 관심 억제제 1 µL를 분주한 다음, EPL 96을 다시 장착하고 30분 후에 실험적 세포 지수 측정을 재개합니다. 다시 실험을 일시 정지하고, 부착된 세포층이 손상되지 않도록 피펫 팁의 끝을 웰의 모서리에 대고 각 웰에서 증식 배지를 빠르고 조심스럽게 제거합니다. 그 후 즉시 각 웰에 혈청 결핍 배지 200 µL와 갓 희석한 관심 신경 보호 화합물 1 µL, 그리고 해당되는 웰에 관심 2차 전령 경로 억제제 1 µL를 추가합니다.그 다음, 데이터 분석을 위해 이전에 설정한 대로 96시간 동안 15분 간격으로 세포 지수(cell index) 측정을 계속합니다. 이제 플롯 페이지에서 정규화된 세포 지수(normalized cell index)와 정규화된 시간(normalized time) 함수를 선택하여, 세포 배양에 변화를 주기 전 마지막 시점을 기준으로 세포 지수를 정규화합니다. 이는 실험 간의 편차를 줄이기 위함입니다. 플롯 페이지에서 관심 있는 실험 조건의 웰(well)들을 강조 표시하고 '추가(add)'를 클릭하여 정규화된 세포 지수 곡선을 플롯합니다.그다음, 특정 시점에서 서로 다른 처리 조건에 따른 세포 지수(cell index) 값의 차이를 통계적으로 분석하기 위해, 세포 지수 소프트웨어 페이지에서 모든 세포 지수 시간대별 실험 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 내보낸 스프레드시트 파일에서 각 시간대에 해당하는 세포 지수 값을 선택합니다. 마지막으로, 통계 소프트웨어를 사용하여 선택한 시간대의 세포 지수 값을 일원 또는 이원 분산 분석(one or two way analysis of variance)으로 분석한 후 사후 검정을 수행합니다. 세포에 신경독성 자극을 가하면 세포 지수 값이 감소합니다. 여기 그래프에는 S-K-N-S-H 세포를 증식 배지에서 배양했을 때의 세포 지수 증가와, 세포를 혈청 결핍 배지로 교체한 후 세포 지수가 하락했다가 새로운 낮은 수준에서 안정화되는 과정이 나타나 있습니다.세포에 혈청 결핍 배지를 공급했을 때 5 µM의 DOI와 20 µM의 IDE라는 두 가지 세로토닌 2A 수용체 작용제를 첨가하면 신경 보호 효과를 관찰할 수 있습니다. 신경 보호 연구에서 중요한 질문 중 하나는 세포 증식에 미치는 영향이 관찰된 화합물의 세포 생존 효과에 기여하는지 여부입니다. 이 그래프에서는 5 µM DOI 처리가 SKNS 세포 증식에 아무런 영향을 미치지 않음을 보여주며, 이는 세포 증식이 관찰된 신경 보호 효과에 기여하지 않는다는 것을 시사합니다.마지막 그래프에서 10 µM의 phosphatidylinositol 3-kinase 억제제인 LY 2 9 4 0 0 2 처리가 세포 생존에 미치는 영향과 혈청 결핍 SK NSH 세포에 대한 DOI의 신경 보호 효과를 관찰할 수 있습니다. LY 2 9 4 0 0 2는 혈청 결핍 단계 동안 DOI의 신경 보호 효과를 차단했으며, 자체적인 일부 독성 효과 또한 나타냈습니다. 이 영상을 시청한 후, 실시간 세포 분석기를 사용하여 신경 세포주에서 CTO 보호를 추적하는 방법과 보호 과정에서 이차 전령 경로의 관여를 규명하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

real-time-impedance-based-cell-analyzer-as-tool-to-delineate

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 세포 임피던스 분석을 통해 부착 세포의 증식을 포함한 세포 이벤트를 실시간으로 모니터링하는 과정을 보여줍니다. 여기서 접착 셀은 절연체 역할을 하여 전극 사이의 전류 흐름을 제한하고 임피던스를 증가시킵니다.

세포 과정을 실시간으로 모니터링하기 위한 세포 임피던스 기반 분석

출처: Mudduluru, G., et. al. 암세포 이동 및 침입의 임피던스 기반 실시간 측정. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 교모세포종 세포 침입 및 이동을 측정하기 위한 임피던스 기반 분석을 보여줍니다. 세포는 세포외 기질을 분해하고, 미세 다공성 막을 통해 이동하며, 전극에 부착하여 임피던스를 생성합니다. 이 실시간 분석은 암 연구 응용 분야에 대한 침습적 잠재력을 반영합니다.

뇌암 세포 침입의 임피던스 기반 측정

이 프로토콜은 전기 세포 기판 임피던스 감지, 세포 부착, 증식, 운동성 및 약리 및 독성 자극에 대한 세포 반응의 정량화에 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 기록하고 분석 할 수있는 방법을 검토합니다. 내피 세포의 투과성과 세포 - 세포 및 세포 - 기질 연락처 평가의 검출이 강조된다.

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

이 원고는 무지개 송어 아가미 상피 세포를 사용하여 현장 휴대용 전기 전지 기판 임피던스 센서에 사용하기 위해 유체 바이오칩을 준비하는 방법을 설명합니다.  센서를 사용하여 신속한 음용수 독성 테스트를 실행하기 위한 프로토콜도 설명합니다.

준비 및 시험 독성에 대한 신속한 평가 음주의 물 샘플에 대한 RTgill-W1 세포와 유체 바이오칩을 임피던스 기반

여기에서는 임피던스 세포 분광법을 사용하는 혈액-뇌 장벽의 체외 쥐 모델을 설명하며, 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향에 중점을 둡니다.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 다양한 치료 조건하에서 암세포가 이동하고 침입하는 능력을 결정하는 것은 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 교모세포종 암 세포주들의 실시간 전이성 능력을 평가하는 방법을 제시한다.

암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정

우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

여기에서는 인간 세포에서 지카 바이러스 감염 및 복제를 실시간으로 연구하는 매우 쉽고 간단한 방법으로 세포 기반 전기 임피던스(CEI)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한, CEI 분석은 항 바이러스 화합물의 평가에 유용합니다.

지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼

여기에서는 뇌 내피 장벽 강도를 측정하기 위해 임피던스 기반 바이오센서인 ECIS 및 cellZscope를 사용하는 기술을 보여줍니다. 우리는 뇌 내피의 체외 모델에 다양한 자극을 추가하는 준비 및 기술에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 결과를 측정, 기록 및 대표 분석을 제공합니다.

암세포와 사이토카인에 대응하는 두 개의 임피던스 기반 바이오센서를 사용한 뇌내피 장벽 무결성 측정

우리의 연결 형태를 분석하는 컴퓨터 프로그램을 개발했습니다. 두개의 기존 오픈 소스 분석 도구와 함께, 우리의 프로그램은 숄 분석을 수행하고 neurites, 지사 지점 및 neurite 팁의 수를 결정합니다. 분석은 neurite 형태의 지역 변화가 관찰 수 있도록 수행됩니다.

여러 스케일에서 디지털의 연결 형태론의 자동 숄 분석

학습하세요 임피던스 기반 실시간 세포 분석기를 이용하여 신경 세포주의 사이토프로텍션을 모니터링하고 제2전달체 경로의 역할을 규명하는 방법을. 이 기술은 신경보호 화합물을 고효율로 평가할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

더 많은 동영상 탐색