신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

이 절차의 전반적인 목표는 임피던스 기반 기술을 사용하여 신경 세포주의 실시간 세포 보호를 추적하여 보호 과정에서 두 번째 메신저 경로의 관여를 설명하는 것입니다. 이는 먼저 임피던스 기반 실시간 세포 분석기에서 증식 조건에서 신경 세포주를 배양함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 잠재적으로 관련성이 있습니다.

두 번째 메신저 경로는 세포주에 신경 보호 치료를 적용하기 전에 약리학적으로 억제됩니다. 다음으로, 다양한 실험 조건에서 실시간 세포 분석기를 사용하여 신경 세포주의 상태를 추적합니다. 궁극적으로, 통계 분석을 사용하여 신경 세포의 세포 보호에 대한 두 번째 메신저 경로의 실시간 관여를 평가할 수 있습니다.

종말점 신경독성 분석법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 신경세포 세포주에서 Tito 보호 및 티토 독성을 실시간으로 라벨이 없는 조건에서 평가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 체외에서 잠재적인 신경 보호 화합물에 대한 보다 높은 처리량 평가에 기여하고 신경 보호와 관련된 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공함으로써 분자 신경생물학 분야의 간단한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 여기에서 인간 신경모세포종 S-K-N-S-H 세포는 PBS와 함께 사용된 다음 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 트립신합니다.

원심분리로 트립신을 제거한 다음 10ml의 증식 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포를 계수한 후, 더 많은 증식 배지를 사용하여 세포를 10 - 5 밀리리터 농도의 5배로 희석한 다음, 실온의 조직 배양 후드에서 EPL 96의 각 웰을 100 마이크로리터의 증식 배지로 평형화합니다. 30분 후 EPL 96을 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터의 실시간 세포 분석 스테이션에 삽입하고 실시간 세포 분석기 소프트웨어를 시작합니다.

그런 다음 레이아웃 페이지에서 실험에 적합한 웰을 선택하고 1단계가 사전 설정된 대로 세포 유형 세포 번호와 관심 있는 화합물의 이름 및 농도를 일정 소프트웨어 페이지의 편집 상자에 입력합니다. 백그라운드 측정의 경우 단계 추가를 선택하고 2단계를 설정하여 96시간 동안 15분마다 셀 인덱스를 측정합니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 1단계를 시작하고 미디어의 배경 임피던스를 측정합니다.

이제 EPL을 제거하고 신경모세포종 세포 현탁액 100마이크로리터를 추가합니다. 각 실험 웰에 EPL 96을 부드럽게 소용돌이쳐 웰을 고르게 코팅한 다음, 조직 배양 후드에서 플레이트를 실온에서 배양하여 30분 후에 세포가 침전되도록 한 다음, EPL 96을 실시간 세포 분석기 스테이션에 다시 로드하고 2단계를 시작합니다. 실험 전반에 걸쳐 셀 인덱스 값을 모니터링하려면 플롯 페이지에서 셀 곡선을 보고 셀 인덱스 페이지에서 원시 셀 인덱스 데이터를 24시간 동안 확인합니다.

세포를 도금한 후 실험을 중지하고 실시간 세포 분석기 스테이션에서 플레이트를 제거합니다. 새로 희석된 관심 억제제 1마이크로리터를 각 웰에 분배한 다음 EPL 96을 재장전한 후 30분 후에 실험 세포 지수 측정을 재개하고, 실험을 다시 일시 중지하고, 부착 세포층을 파괴하지 않도록 피펫 팁의 가장자리를 웰 모서리로 향하게 하여 각 웰에서 증식 배지를 빠르지만 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 즉시 200마이크로리터의 혈청 박탈 배지를 각 웰에 추가하고, 1마이크로리터의 갓 희석된 관심 신경 보호 화합물, 1마이크로리터의 관심 있는 두 번째 메신저 경로 억제제를 적절한 웰에 추가합니다.

그런 다음 데이터를 분석하기 위해 이전에 설정한 대로 96시간 동안 15분마다 세포 인덱스 측정을 계속하고, 이제 플롯 페이지에서 정규화된 세포 인덱스 및 정규화된 시간 함수를 선택하여 세포 배양에 대한 수정 전의 마지막 시점으로 셀 인덱스를 정규화합니다. 실험 간의 변동을 줄이기 위해. 플롯 페이지에서 관심 있는 실험 조건에 대한 웰을 강조 표시하고 추가를 클릭하여 정규화된 세포 인덱스 곡선을 플롯합니다.

그런 다음 세포 색인 소프트웨어 페이지의 모든 세포 색인 시점에 대한 실험 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내 특정 시점의 다양한 처리 조건에서 세포 색인 값의 차이를 통계적으로 분석합니다. 내보낸 스프레드시트 파일 내의 해당 시점에서 셀 인덱스 값을 선택합니다. 마지막으로, 분산의 단방향 또는 양방향 분석을 통해 선택된 시점에 대한 세포 인덱스 값을 분석한 다음, 통계 소프트웨어를 사용하여 세포에 대한 신경독성 자극을 사용하면 세포 인덱스 값이 감소하고, 여기서 세포 인덱스가 증가하고, S-K-N-S-H 세포가 증식 배지에서 성장할 때 세포 인덱스가 증가하고, 세포 인덱스가 떨어지고, 그 후 새로운 낮은 수준에서 안정화됩니다 세포를 혈청 박탈 배지로 전환하는 것이 이러한 그래프에 나와 있습니다.

2 개의 세로토닌 2 수용체 작용제, 5 마이크로 몰, DOI 및 20 마이크로 몰 IDE의 신경 보호 효과는 세포에 혈청 박탈, 배지를 공급할 때 추가 될 수 있습니다. 신경 보호 연구에서 중요한 질문은 세포 증식에 대한 영향이 세포 생존에 대한 관찰된 복합 효과에 기여하는지 여부입니다. 이 그래프에서 SKNS 세포 증식에 대한 5마이크로몰 DOI 치료의 효과 부족은 증식이 관찰된 신경 보호 효과에 기여하지 않음을 시사합니다.

이 최종 그래프에서는 포스파티딜 초기 3 키나아제 억제제 LY 2 9 4 0 0 2의 10 마이크로몰 처리가 세포 생존에 미치는 영향과 DOI가 결핍된 SK NSH 세포에 대한 신경 보호 효과를 관찰할 수 있습니다. LY 2 9 4 0 0 2 는 혈청 결핍 단계에서 DOI의 신경 보호 효과를 예방했지만, 그 자체로 일부 독성 효과도 나타냈다. 이 동영상을 시청한 후에는 실시간 세포 분석기를 사용하여 신경 세포주에서 CTO 보호를 따르는 방법과 보호에 대한 두 번째 메신저 경로의 관여를 설명하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.