신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

이 절차의 전반적인 목표는 임피던스 기반 기술을 사용하여 뉴런 세포주의 실시간 세포 보호 작용을 추적함으로써 보호 과정에서 2차 전령 경로의 관여도를 규명하는 것입니다. 이는 먼저 임피던스 기반 실시간 세포 분석기에서 증식 조건 하에 뉴런 세포주를 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 잠재적으로 관련이 있는.

신경 보호 처리를 세포주에 적용하기 전, 약리학적으로 2차 전령 경로를 억제합니다. 다음으로, 다양한 실험 조건 하에서 실시간 세포 분석기를 사용하여 신경 세포주의 상태를 관찰합니다. 최종적으로, 통계 분석을 통해 신경 세포의 세포 보호 과정에서 2차 전령 경로가 실시간으로 관여하는지 평가할 수 있습니다.

이 기술의 기존 종말점 신경독성 분석법(endpoint neurotoxicity assays)과 같은 방법 대비 주요 장점은, 표지 없이 실시간으로 신경 세포주에서 Tito 보호 및 Tito 독성을 평가할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 in vitro에서 잠재적인 신경 보호 화합물을 더욱 고처리량으로 평가하고, 신경 보호에 관여하는 분자적 기전에 대한 통찰력을 제공함으로써 분자 신경생물학 분야의 신속한 의문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 먼저 부착성 신경 세포주 층을 세척하는 것부터 시작하십시오. 예를 들어, 여기서는 인간 신경모세포종 S-K-N-S-H 세포를 PBS로 세척한 후 37 °C에서 5분 동안 트립신 처리합니다.

원심분리를 통해 트립신을 제거한 후, 세포를 10 milliliters의 증식 배지에 재현탁합니다. 세포 수를 측정한 후, 증식 배지를 더 추가하여 세포 농도를 3 × 10⁵ cells/milliliter로 희석하고, 조직 배양 후드 내의 실온 상태에서 EPL 96의 각 웰에 100 microliters의 증식 배지를 넣어 평형을 맞춥니다. 30분 후, 37 °C의 이산화탄소 배양기 내에 있는 실시간 세포 분석기 스테이션에 EPL 96을 삽입하고 실시간 세포 분석 소프트웨어를 실행합니다.

그런 다음 레이아웃 페이지에서 실험에 적합한 웰을 선택하고, 단계 1이 미리 설정되어 있으므로 스케줄 소프트웨어 페이지의 편집 상자에 세포 종류, 세포 수, 그리고 관심 있는 화학 화합물의 이름과 농도를 입력합니다. 배경 측정의 경우, '단계 추가'를 선택하고 단계 2를 96시간 동안 15분마다 세포 지수(cell index)를 측정하도록 설정합니다. 그 후 '시작'을 클릭하여 단계 1을 개시하고 배지의 배경 임피던스를 측정합니다.

이제 EPL을 제거하고 100 µL의 신경모세포종 세포 현탁액을 추가합니다. 각 실험 웰에 EPL 96을 조심스럽게 회전시켜 웰에 고르게 코팅한 다음, 세포가 가라앉을 수 있도록 조직 배양 후드 내의 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 EPL 96을 실시간 세포 분석기 스테이션에 다시 장착하고 2단계를 시작합니다. 실험 전반에 걸쳐 세포 지수 값을 모니터링하려면, 플롯 페이지의 세포 곡선과 세포 지수 페이지의 24시간 raw 세포 지수 데이터를 확인하십시오.

세포를 플레이팅한 후, 실험을 일시 정지하고 실시간 세포 분석기 스테이션에서 플레이트를 제거합니다. 각 웰에 갓 희석한 관심 억제제 1 µL를 분주한 다음, EPL 96을 다시 장착하고 30분 후에 실험적 세포 지수 측정을 재개합니다. 다시 실험을 일시 정지하고, 부착된 세포층이 손상되지 않도록 피펫 팁의 끝을 웰의 모서리에 대고 각 웰에서 증식 배지를 빠르고 조심스럽게 제거합니다. 그 후 즉시 각 웰에 혈청 결핍 배지 200 µL와 갓 희석한 관심 신경 보호 화합물 1 µL, 그리고 해당되는 웰에 관심 2차 전령 경로 억제제 1 µL를 추가합니다.

그 다음, 데이터 분석을 위해 이전에 설정한 대로 96시간 동안 15분 간격으로 세포 지수(cell index) 측정을 계속합니다. 이제 플롯 페이지에서 정규화된 세포 지수(normalized cell index)와 정규화된 시간(normalized time) 함수를 선택하여, 세포 배양에 변화를 주기 전 마지막 시점을 기준으로 세포 지수를 정규화합니다. 이는 실험 간의 편차를 줄이기 위함입니다. 플롯 페이지에서 관심 있는 실험 조건의 웰(well)들을 강조 표시하고 '추가(add)'를 클릭하여 정규화된 세포 지수 곡선을 플롯합니다.

그다음, 특정 시점에서 서로 다른 처리 조건에 따른 세포 지수(cell index) 값의 차이를 통계적으로 분석하기 위해, 세포 지수 소프트웨어 페이지에서 모든 세포 지수 시간대별 실험 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 내보낸 스프레드시트 파일에서 각 시간대에 해당하는 세포 지수 값을 선택합니다. 마지막으로, 통계 소프트웨어를 사용하여 선택한 시간대의 세포 지수 값을 일원 또는 이원 분산 분석(one or two way analysis of variance)으로 분석한 후 사후 검정을 수행합니다. 세포에 신경독성 자극을 가하면 세포 지수 값이 감소합니다. 여기 그래프에는 S-K-N-S-H 세포를 증식 배지에서 배양했을 때의 세포 지수 증가와, 세포를 혈청 결핍 배지로 교체한 후 세포 지수가 하락했다가 새로운 낮은 수준에서 안정화되는 과정이 나타나 있습니다.

세포에 혈청 결핍 배지를 공급했을 때 5 µM의 DOI와 20 µM의 IDE라는 두 가지 세로토닌 2A 수용체 작용제를 첨가하면 신경 보호 효과를 관찰할 수 있습니다. 신경 보호 연구에서 중요한 질문 중 하나는 세포 증식에 미치는 영향이 관찰된 화합물의 세포 생존 효과에 기여하는지 여부입니다. 이 그래프에서는 5 µM DOI 처리가 SKNS 세포 증식에 아무런 영향을 미치지 않음을 보여주며, 이는 세포 증식이 관찰된 신경 보호 효과에 기여하지 않는다는 것을 시사합니다.

마지막 그래프에서 10 µM의 phosphatidylinositol 3-kinase 억제제인 LY 2 9 4 0 0 2 처리가 세포 생존에 미치는 영향과 혈청 결핍 SK NSH 세포에 대한 DOI의 신경 보호 효과를 관찰할 수 있습니다. LY 2 9 4 0 0 2는 혈청 결핍 단계 동안 DOI의 신경 보호 효과를 차단했으며, 자체적인 일부 독성 효과 또한 나타냈습니다. 이 영상을 시청한 후, 실시간 세포 분석기를 사용하여 신경 세포주에서 CTO 보호를 추적하는 방법과 보호 과정에서 이차 전령 경로의 관여를 규명하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.