에 가이드 생체 단일 단위 기록

다음 실험의 전반적인 목표는 채널 rootin 2를 발현하는 마우스의 피질 간 뉴런에서 고품질 세포 외 단일 단위 기록을 얻는 것입니다. 이는 조직을 통해 고임피던스 기록 전극을 전진시켜 스파이크 반응에서 청색광 펄스에 대한 뉴런 사이를 식별함으로써 달성됩니다. 전기 신호는 적절한 진행 속도 및 안정적이고 잘 격리된 기록을 얻을 가능성을 나타내는 변화에 대해 모니터링됩니다.

양호한 단일 단위 분리를 달성할 수 없거나 반대로 빛에 반응하는 뉴런이 거의 발견되지 않는 경우 기록 전극을 교체하십시오. 그 결과, 빛의 신뢰성은 광학적으로 식별된 뉴런으로의 반응을 불러일으키고, 이 전략으로 얻은 일반적인 신호 대 잡음비를 보여줍니다. 광 자극 접근법은 표준 세포외 증폭기와 청색광을 사용하여 유전적으로 확인된 세포 유형을 표적으로 삼을 수 있는 접근 가능하고 저렴한 방법입니다.

이것은 마취된 청각 피질에서 특정 내부 뉴런을 포주하기 위한 우리의 전략이지만, 더 일반적인 점은 희박한 세포 유형보다 다른 피질 영역에 적용됩니다. 복강내 주사를 통해 케타민 마이네 칵테일로 동물을 마취한 후 정위 택시 또는 기타 머리 고정 장치에 놓고 두개골이 잘 고정되었는지 확인합니다. 이는 안정적인 단일 세포 기록을 유지하는 데 필수적입니다.

다음으로, 안과 연고를 눈에 발라 건조함을 방지하고 동물의 체온을 섭씨 37도로 유지하여 CI 흉골 배액을 수행하여 기록 안정성을 높이고, 메스 날로 후방 두개골 조직을 제거하여 CI 흉골 마그나를 노출시킵니다. 그런 다음 대뇌 척수액을 배출하기 위해 블레이드 끝으로 Dora에 작은 흠집을 냅니다. 이제 메스를 사용하여 관심 있는 피질 부위에 작은 개두술을 수행합니다.

그 후, 경막을 제거한 다음 노출 된 피질을 따뜻한 aros 층으로 덮으십시오. 식염수로 아그로스를 촉촉하게 유지하십시오. 텅 스탠드 전극을 준비합니다.

슈퍼 접착제와 가속기를 사용하여 전극을 유리 모세관 튜브에 붙입니다. 그런 다음 그립을 위해 열 수축 튜브를 추가합니다. 그런 다음 전동 또는 유압식 마이크로미터 매니퓰레이터에 전극을 장착하고 피질 표면에 직각으로 이동하도록 설정합니다.

접지선을 두개골에 대고 피부 아래로 밀어 넣습니다. 머리 옆쪽과 목 뒤쪽의 근육은 myo graphic 아티팩트를 생성할 수 있으므로 접촉을 피하십시오. 전기 신호는 단일 장치 녹음에 적합한 세포 외 증폭기를 사용하여 증폭되며, 임피던스 체크 모드가 장착된 것이 바람직합니다.

진행 중인 스파이크 활동은 두 개의 오실로스코프와 한 세트의 파워드 스피커로 모니터링됩니다. 이제 전극을 아그로스를 통해 전진시키고 임피던스를 테스트하여 7-14메가옴 이내인지 확인합니다. 팁이 피질의 표면을 뚫고 나오면 미크론 매니퓰레이터의 이 위치가 0이 됩니다.

기록의 깊이를 가장 잘 추정하려면 전극 팁이 0의 깊이에서 피질 표면을 빠져 나오는지 육안으로 확인하십시오. 이 0 세트 설정값이 피질의 수준과 일치하는지 확인하기 위해 청각 피질의 침투 끝에서 전극을 빼낼 때 자극이 유발하는 장 전위를 모니터링합니다. 처음 수백 마이크로미터의 조직을 통해 전극을 전진시키는 동안 국소 전위의 극성이 100마이크로미터 깊이 주변에서 반전되는지 확인합니다.

다음으로, 청색 광원에 연결된 광섬유를 수동 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. 지정된 너비와 지속 시간의 TTL 펄스 트레인을 전달할 수 있는 제어 장치로 광원의 출력을 조절합니다. 그런 다음 두 오실로스코프에서 신호를 모니터링합니다.

파워 미터를 사용하여 광섬유 끝의 총 광 전력을 측정합니다. 이 값을 사용하여 섬유 코어의 단면적으로 나누어 방사 조도를 계산합니다. 제곱밀리미터당 10-15밀리와트 범위의 값으로 시작합니다.

현미경을 사용하여 섬유의 끝을 aros의 표면에 최대한 가깝게 배치하십시오. 전극이 조직에 들어갈 빔의 중심을 잡습니다. 이제 aros의 전극으로 가벼운 아티팩트를 확인하십시오.

펄스 변형을 전달합니다. 입사광의 각도를 변경하기 위해 전극을 기준으로 광섬유를 재배치하여 일시적인 광 아티팩트를 제거합니다. 아티팩트가 지속되면 조명 강도를 줄여 보십시오.

다음으로, 초당 약 1마이크로미터의 속도로 뇌를 통해 전극을 천천히 전진시킵니다. 하나의 오실로스코프를 사용하여 전극의 지속적인 활동을 모니터링합니다. 레이저 펄스를 트리거링하는 데 다른 하나를 사용합니다.

오디오 모니터에서 스파이크를 유발하는 빛의 희미한 해시를 들어보십시오.이 해시는 전극이 채널 옵신 양극 셀에 접근하고 있음을 나타냅니다. 그런 다음 빛이 불러 일으키는 즉시 진행 속도를 늦추십시오. 스파이크는 오실로스코프에서 개별적으로 트리거할 수 있을 만큼 충분히 큽니다.

그렇게 하기 시작하십시오. 수평 축의 스케일을 조정하여 스파이크 파형의 정확한 모양을 관찰합니다. 이 시점에서 전극의 전진을 멈추고 전극이 조직에 정착할 때까지 기다립니다.

이는 안정적인 녹음을 위해 매우 중요합니다. 몇 분 후에도 신호 대 잡음비가 개선되지 않으면 5마이크로미터 더 전진하고 기다립니다. 다시 말하지만, 활동 전위의 피크 또는 최저점이 전압 임계값으로 안정적으로 캡처될 수 있을 때까지 이 프로세스를 반복합니다.

녹음하는 동안 노이즈 플로어보다 훨씬 높게 설정합니다. 첫 번째 오실로스코프에서 진행 중인 활동을 모니터링합니다. 동시에 두 번째 오실로스코프를 사용하여 스파이크의 크기와 모양에 주의를 기울이고 스피커에서 사운드 품질을 기록하십시오.

세포가 전극에 너무 가까이 다가오거나 멀어지고 있음을 나타내는 급격한 변화를 주의 깊게 들어보십시오. 스파이크가 커지고 뒤틀리면 전극을 빼내십시오. 더 작아지면 전극을 전진시키십시오.

스파이크의 품질을 확인하기 위해 두 마이크로미터 단위로 천천히 움직입니다. 모든 스파이크 파형을 광범위한 임계값에 걸쳐 중첩합니다. 균일한 높이의 일관된 스파이크 모양만 보여야 합니다.

대부분의 PV 포지티브 셀은 1초 동안 발화를 지속할 수 있습니다. 신호가 이웃 뉴런의 스파이크로 오염되면 전극을 전진시키고 각 침투에서 새로운 세포를 찾은 다음 피질의 전체 깊이를 통해 전극을 낮추십시오. 많은 침투 후에도 빛에 반응하는 뉴런을 만나지 못하거나 그 반대로, 녹음이 일상적으로 이웃 채널, 옵신 음성 세포의 스파이크로 오염되면 새 전극을 시도하십시오.

이 그림은 광학적으로 식별된 세 가지 유형의 뉴런 간(inter neuron)에 대한 기록의 예를 보여줍니다. 세포는 신뢰할 수 있는 스파이크 버스트로 검색 펄스 트레인에 반응합니다. 여기에 표시된 것은 100 tr 라인 스파이크와 평균 보간 된 파형입니다.

이 명단 플롯은 빛이 스파이크를 유발하는 일관된 타이밍을 보여줍니다. 전력 샘플에 대한 첫 번째 스파이크 대기 시간입니다. Volin positive inter neuron이 여기에 제시되어 있습니다.

광 자극 접근 방식은 개념적으로 매우 간단하지만 놀라울 정도로 까다롭고 수율이 낮을 수 있습니다. 실제로. 유리 패치 전극은 초금속 뉴런 쪽으로 강하게 편향되어 있기 때문에 내부 뉴런을 자주 얻지 못합니다.

반면에 테트로스를 사용하면 빛에 반응하는 인터 뉴런을 많이 얻을 수 있지만 스파이크가 작고 겹치는 파형이 많기 때문에 단일 단위로 안정적으로 분류하기가 매우 어렵습니다. 우리는 이를 다양한 방법으로 달성하려고 노력하며, 내부 뉴런의 경우 이 날카로운 10-14메가 전극이 청취 반경 측면에서 적절한 균형을 이루는 것을 발견했으며, 이는 멀리서 참나무 스파이크의 빛을 감지할 수 있을 만큼 커야 하지만 우수한 단일 장치 격리를 달성하기에 충분히 제한적이어야 합니다. 그래도 부두교가 있습니다.

그것을 달성할 수 없다면 해당 전극을 버리고 작동하는 전극을 찾을 때까지 다음 전극으로 넘어가는 것만으로도 많은 시간을 절약할 수 있습니다.