Name: 호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 학습하세요 생리적 흐름 조건에서 호중구의 내피 세포 횡단 이동을 실시간 영상화하는 방법을. VE-c�드헤린과 PECAM-1 단백질을 이용해 세포 간 및 세포 내 이동 경로를 구분하고 염증 반응 메커니즘을 규명합니다.

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저자는 원고를 비판적으로 읽어준 P.L. Hordijk 박사에게 감사를 표합니다. AED는 Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research(LSBR) 펠로우십(보조금 #1028)의 지원을 받습니다. JK는 네덜란드 심장 재단(Dutch Heart Foundation)의 지원을 받고 있습니다(2005T3901). JDvB는 NHS Dekker 펠로우(보조금 #2005T039)입니다.

호중구는 동의서에 서명 한 건강한 지원자에서 고립되었다. 연구는 인간의 복지에 대한 제도적 및 국가의 지침에 따라 수행되었습니다. 1 도금 및 인간 제대 정맥 내피 세포의 유지 보수 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 문화 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를). 피브로넥틴에 HUVECs를 성장 (FN)이 미디어를 사용하여 (순수에 용해 10 μg / ㎖) 요리를 코팅 처리 (내피 성장 중간 (EGM-2) singlequots 보충 내피 기초 중간 (EBM-2) 중). 실험 4-8 통로 사이에 세포 배양을 사용합니다. </li><li> 1 일 : 37 ° C에서 최소 2 시간 동안 피브로넥틴 100 ㎕ (PBS에서 10 μg이 / ㎖) 및 5 % CO 2와 코트 흐름 챔버. </li><li> 주 2 : 세포가 80-90% 합류에 도달하면, RT 인산염 완충 생리 식염수에주의 세탁 후 세포를 Trypsinize (PBS)의 pH 7.4, 미디어를 사용하여 800,000 세포 / ml에서 800 XG에 원심 분리기를 Resuspend. 플레이트 80,000 FN 코팅 흐름 챔버의 모든 단일 채널에서 세포와 부드럽게 위아래로 세포 현탁액을 피펫. 37 ° C에서 인큐베이터, 5 % CO 2 문화 O / N. </li><li> 일 3 : 부드럽게 45 ° 각도로 슬라이드를 기울여 흐름 챔버 슬라이드에서 용지를 새로 고칩니다. (그림 1A 참조). 주 : 만 저수지가 아닌 채널 자체가 미디어를 제거하는 것이 좋습니다. 채널 미디어의 제거로 인해 피펫으로 인한 미디어의 드래그 힘 내피 세포 손실 및 사망을 초래할 수 있습니다. </li><li> 내피 세포는 단층 (즉, 100 % 합류)을 형성 한 경우 위상차 현미경으로 확인합니다. 세포가 100 % 합치하지 않은 경우가 100 % 합류점에 도달 할 때까지, 일 미디어 두 번 변경. </li><li> 세포 포화 상태에 도달 한 후, (단계 참조 미디어 세포를 자극1.1) 염증 매개체 (TNF-α (10 ng의 / ㎖)을 함유). , 내피 세포의 염증 표현형에서 TNF-α의 결과 HUVECs를 O / N (즉, 12 시간), 즉 자극., 상향 조절 등 ICAM-1 및 VCAM-1 (13)과 같은 세포 부착 분자. </li></ol> 퍼콜 그라디언트를 사용하여 2 다형 백혈구 분리 <ol><li> 다형 핵 백혈구 (PMN)를 분리하기 전에 : N-2-히드 록시 에틸-N&#39;-2-에탄 술폰산 (흐름 버퍼 이하라고 함) (HEPES) -buffer 준비합니다. 플로우 버퍼는 격리 된 백혈구를 세척하는 데 사용되는 흐름 분석에서 버퍼로. 흐름 버퍼를 준비하려면 : 7.72 g의 NaCl (132 밀리미터), 4.76 g의 HEPES (20 밀리미터), 0.45 g의 KCl (6 밀리미터), 0.25 g의 황산 • 7H 2 O (1 ㎜), K 2 HPO 4 • 3H 희석 이 O 순수의 1 L에 (1.2 mM)을 (이 주식이 몇 주 동안 4 ° C로 유지 될 수있다) pH를 7.4로 조정한다. </li><li> 신선한 100 ㎕의 1 M 염화칼슘이 &amp; # 추가160 (1 ㎜), 2.5 ml의 200g / L의 스톡 농도 100 mL에 (0.5 % v / v)로 0.1 g 포도당 인간 알부민 (w 0.1 % / v)의 흐름 버퍼. 다음에, 0.45 μm의 필터를 사용하여 유동 완충액을 필터. 참고 :이 흐름 버퍼가 모든 실험에 대한 신선한 준비 할 필요가있다. </li><li> 이전 PMN의 분리로, PBS, pH가 7.4에서 10 % 트리 소듐 시트 레이트 (TNC) 솔루션을 준비합니다. </li><li> 건강한 지원자에서 나트륨 heparine의 vacuettes에서 전체 혈액의 20 ML를 수집합니다. 50 ml의 튜브에 10 % PBS / TNC로 1 피펫 20 ㎖를 ((g / ㎖ 1.130의 밀도가 물에 콜로이드 용액) w / w 23 %) 12.5 퍼콜 ml의에 신중하게 혈액을 희석 : 전체 혈액 1을 희석 새로운 50ml의 튜브. 조심스럽게 원심 분리기에서 튜브를 배치하고 800 낮은 가속 XG와 RT로 설정없이 휴식 20 분 동안 회전. 참고 : 퍼콜에 희석 된 혈액을 추가 할 때, 45 ° 각도에서 퍼콜 함유 튜브를 기울여 부드럽게 튜브 재치에 희석 된 혈액을 피펫시간 느린 피펫 소년 설정입니다. </li><li> 모든 액체를 제거하고 이후 500 mL에 얼음처럼 차가운 적혈구 용해 버퍼 (4.15 g NH 4 염소 [0.155 M], 0.5 g의 KHCO 3 [0.01 M] 18.5 mg을 EDTA (삼중 III) [0.1 밀리미터]와 튜브를 채우기 ) 얼음처럼 차가운 H 2 O의 적혈구를 용해한다. 서스펜션이 사용 바꿈 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리 500 XG에 이어 진한 빨간색을, 될 때까지, 때때로 반전 튜브, 얼음에 튜브를 둡니다. 참고 : 펠렛 부분은 적혈구와 함께 백혈구 (호중구, 호산구, 호염기구)가 포함되어 있습니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 얼음처럼 차가운 용해 버퍼에 두 번 펠렛을 씻는다. </li><li> RT에서 유동 완충액으로 펠렛을 재현 탁하고 세포 또는 자동 혈구 계수기를 사용하여 백혈구 농도를 결정한다. 1 × 10 6 세포 / ml에서 흐름 버퍼의 백혈구를 일시 중단하고 실온에서 보관하십시오. </li></ol> 내피 분기점의 3 라벨링알은 VE-cadherin의 및 PECAM-1 <ol><li> 1에서 PECAM 알렉사 플 루어 647 항체 (클론 WM59)를 추가 : 1:50 희석 HUVEC에 배지 100 희석 칼슘 독립적 인 VE-cadherin의-FITC 항체 (클론 55-7H1), (단계 1.1 참조) 전에 생리 유동 조건 하에서 호중구 윤회 중에 내피 세포의 접합부 역학을 가시화 유동 실험을 시작하여 30 분 동안 배양한다. NOTE : 유동 챔버로 직접 표지 된 항체를 첨가하기 전에, 각 채널의 볼륨을 100 ㎕를 초과하지 않도록. 이것은 가능한 한 낮은 항체 비용을 유지할 수. </li></ol> 4 PMN TEM 분석에서 흐름 <ol><li> 이전 흐름 시스템으로 그들을 주입에 37 ° C에서 15 분 동안 물을 욕조에 백혈구를 놓습니다. </li><li> 일을 설정할 때 빈 흐름 챔버에 튜브를 연결하고 형성 방지하기 위해 (예를 들어, 37 ° C) 흐름 버퍼 따뜻한 (단계 참조 4.3) 채우기 공기 - 거품전자 흐름 시스템. </li><li> 20 ㎖ 주사기를 함유하는 실리콘 튜빙을 사용하여 주사기 펌프 유동 시스템에 빈 유동 챔버의 일측을 연결하고 현미경 스테이지로 유동 챔버 넣어. </li><li> 37 ° C의 흐름 버퍼 (그림 1B)로 가득 저수지 플라스크에 빈 흐름 챔버의 다른 쪽을 연결하고 흐름 버퍼 모든 튜브를 작성하기 위해 주사기 펌프를 시작합니다. 펌프는 주사기로 유동 챔버를 통해 저장조로부터 유출 버퍼를 당길 것이다. NOTE :이 튜브는 또한 흐름을 중지하고 기포를 생성하지 않고 백혈구가 실행 실험에 바늘로 주입 될 수있는 줄 루어 주입 포트를 포함한다. </li><li> TNF-α 처리 HUVEC를 포함하는 흐름 챔버와 빈 흐름 챔버를 교체 흐름 버퍼 함유 튜브를 연결하고 현미경 단계 (그림 1C)에 배치합니다. 분리했다 다시 연결하기 전에 튜브를 꼬집어핀치 오프하지 같이, HUVECs를 함유 챔버 m은 배관 및 / 또는 유동 챔버 내부에 기포의 형성을 초래할 수있다. </li><li> 후 모세관 세정맥에서의 생리 학적 유동 속도에 따라, 1 DYN / cm 2 흐름 속도를 조정 (1-5 DYN / cm 2). </li><li> 기록 미분 간섭 대비 (DIC), FITC (488 나노 미터)와 알렉사 플 루어 647 (647 나노 미터)을 동시에 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용. </li><li> 백혈구 1 ㎖의 주사기를 이용하여 인 - 라인 루어 주입구 (도 1D)을 통해 천천히 유동 시스템 (단계 4.1)을 주입한다. </li><li> 몇 분 후, 백혈구을 준수하고, transmigrate, 나타납니다. 흐름 챔버로 흐름 챔버와 피펫 정착액 (PBS에서 3.7 % 포름 알데히드)에서 튜브를 분리하여 원하는 순간에 실험을 중지합니다. 10 분 동안 고정을 허용, PBS로 세척 하였다. 데이터는 이미징 소프트웨어 (재료 및 장비 표 참조)를 사용하여 분석한다. NOTE : 37 ° C, 5 % CO 2에서 항온과 기후 챔버를 구비 한 공 초점 레이저 주사 현미경, 63X 및 실험에 사용한 그 시일 링 목적을 수행한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

이것은 세포 자멸사 및 파쇄 단층의 원인이되므로이 프로토콜의 경우, 이는, 유동 챔버의 기포 형성을 방지하는 것이 중요하다. 이를 방지하기 위해, 우리는 튜브가 흐름 챔버에 연결되어있는 단계 4.2 및 4.5에 특별한 관심을 지불 강조하고 싶습니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 이전의 흐름 챔버 (단계 4.1)에 주입에 37 ° C에서 15 ~ 30 분을 배양하여 실온에서 보관하는 백혈구의 프라이밍이다. 이것은 그들이 같은 내피 세포에서 ICAM-1 또는 VCAM-1과 같은 부착 분자에 부착 할 수 있도록, 백혈구 인테그린 프라이밍의 결과. 이 프로토콜은 호중구의 윤회를 연구하기 위해 제한되지 않습니다. 이러한 단핵구 또는 림프구와 같은 또 다른 유형의 백혈구가 사용될 수있다. 백혈구의 종류에 따라 상이 할 수 백혈구를 프라이밍, 즉 해당 단계 4.1을합니다. 또한, 내피 세포의 다른 유형을 사용할 수있다. 이를 위해이 여전히 중요같은 TNF-α와 IL-1β 적절한 염증 자극으로 내피 세포를 자극한다. 호중구 transmigrating 응답하지 않으면, 하나의 N-포르 밀-L-메티 오닐-L-로이 실-L-페닐알라닌 (FMLP) 펩티드 16 호중구 간단히 (5 분) 처리 고려할 수있다. 이 내피 세포에 부착하기가 더 많은 경향이있어 더욱 특히 자신의 인테그린에, 호중구를 자극 할 것이다. 일반적으로 1 DYN / ㎝ 2 흐름 속도가 사용됩니다. 이 흐름 속도는 후 모세관 정맥, 대부분의 백혈구 transendothelial 마이그레이션 (17)를 발생 사이트로 측정됩니다. 설명한 플로우 챔버를 사용하면, 10 DYN / cm 2 유동 속도까지 증가시킬 수있다. 그러나, 더 전단을 증가하지 않는 것이 좋습니다. 이 흐름 챔버에서 세포의 튜브와 분리의 원치 않는 노출시키는 결과를 가져올 수 있습니다. 도 3에 설명 된 결과는 이러한 것을 나타항체는 시각화하고 백혈구 diapedesis 동안 내피 세포 - 세포 접합의 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 기존 윤회 분석법 이외에이 프로토콜은 실시간 흐름 생리적 조건 하에서 세포 횡단 이동부터 세포층을 구별 할 수있다. 항체는 세포 - 세포 접합을 얼룩 때문에, 하나는 / PECAM - 한 사이트-cadherin의를 VE 정이 대 VE-cadherin의 / PECAM-1 양성 접합을 교차 백혈구의 수를 점수 수 있습니다. 이 방법으로, 세포 횡단 마이그레이션은 세포층의 마이그레이션 구별 할 수 있습니다. 본 연구에서 사용 PECAM-1 항체가 상기 제 외 도메인에 대하여 지시한다 : 이들 항체들은 바인딩 단백질의 기능을 방해하지 않는 것을 강조하는 것이 중요하다. 항체는 적어도하지 않았다는 것을 시사 확산 또는 단일 층을 형성하는 결함을 나타내지 않았다 항체의 존재하에 도금 된 내피 세포,내피 세포 사이의 동형 상호 작용을 방해합니다. 그 외에도, 두 항체가 내피 단층으로 마이그레이션하는 호중구의 능력을 손상하지 않는다. 또한, 부재 또는 항체의 존재하에 내피 단층 걸쳐 transmigrate 호중구의 수 (데이터는 도시하지 않음)를 변경하지 않는다. 중요한 것은, 공 초점 레이저 주사 현미경은 우리에게 동시에 서로 다른 형광 채널 및 DIC를 기록 할 수있는 가능성을 준다. 호중구는 내피 세포 - 세포 접합을 교차하고 백혈구 세포 횡단 대 다른, 즉, 세포층을 통해 하나의 경로를 선택하는 이유를 이해하는 데 도움이 될 것입니다 경우에 따라서,이 분석은 동시에 VE-cadherin의 및 PECAM-1의 역학을 공부하고 있습니다.

효율적이고 엄격하게 제어 백혈구 transendothelial 마이그레이션 (TEM)은 이러한 면역 감시 및 급성 염증 생리 학적 과정의 핵심 중요하다. 그러나, 특정 병태 생리 조건 하에서, 제어되지 않는 과도 TEM 및 만성 염증성 질환 (예, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 천식)에서 얻어진 관찰된다. 종양 세포는 1-3 전이하는 순환을 떠나는 또한 종양 세포 전이 동안 transendothelial 마이그레이션 프로세스 수단이다. 구체적으로는 과도한 백혈구 또는 종양 세포 TEM을 방해하기 위해,이 프로세스의 상세한 규정의 이해가 필요하다. 그것은 TEM 프로세스가 여러 단계를 통해 발생하는 것으로 생각된다. 정육점 및 스프링에 의해이 수십 년 전에 검토 정액 연구는, TEM 4,5의 과정을 설명하는 다단계 모델로했다. 이 모델은 여전히​​ 광고하지만, 사실이 보유하고ditional 단계 6를 포함하고있다. 알론은 외. 내피 (7)의 표면에 고정화 케모카인의 존재에 대한 필요성을 설명했다. 최근에, 그들은 내피 세포 자체가 내피 선 단면 팔에서 발표하는 케모카인을 생성 것을 보여 주었다. 또한, 동일 그룹 TEM 7 중에 유동 조건의 중요성을 제안했다. 최근, 두 개의 서로 다른 노선의 백혈구에 초점을 맞춘 여러 서적은 TEM의 최종 diapedesis 단계에서 걸릴 수 있습니다. 그들은, 즉, 세포 - 세포 접합을 통해 세포층의 마이그레이션 경로를 이동하거나, 세포 횡단 마이그레이션 경로를 9로 알려진 내피 세포의 몸을 통해 통과 할 수 있습니다. 전차 승무원 및 동료에서는 이러한 경로를 공부하고 제대 정맥 내피 단일 층 (10)을 횡단 할 때 백혈구가 우선적으로 세포 횡단 노선 (10 %)를 통해 세포층의 마이그레이션 경로 (90 %)을 선택할 것을 결론을 내렸다.그러나, 다른 기원에서 내피 세포가 사용 된 때, 예를 들면, 뇌 미세 혈관보다 백혈구 세포 횡단 경로 (30 %) (11)을 사용했다. 이 VE-cadherin의 알파 - 카테닌에 대한 키메라 Vestweber 그룹은 최근 세포 - 세포 접합이 내생를 대체 노크 동물 모델을 사용하여 서로 해리 수 없습니다 때 VE-cadherin의를 보여 백혈구 TEM 완전히 12을 차단되었습니다 . 놀랍게도, 저자는 TEM 여러 차단, 전부는 아니지만, 조직 된 것으로 나타났습니다. 전반적으로,이 우아한 실험은이 결정을 트리거 규제 신호는 아직 알 수 있지만 백혈구, 세포 횡단 노선을 통해 세포층의 경로를 선호하는 것으로 나타났다. 백혈구의 대부분이 세포층 이동 경로를 선호한다하더라도, 그것은 두 경로를 구별하는 것은 여전히​​ 어렵다. 내피 세포 - 세포 junct의 역할에 초점을 맞추고 몇몇 연구에도 불구하고 그 외에있어서이온은 이러한 접합의 역학, 특히 접합부 단백질은 VE-cadherin의 및 PECAM-1, 백혈구 횡단 논쟁에서 여전히 동안. 우리는 이러한 접합 분자가 형광 표지 된 항체를 사용하여 유동 생리적 조건 하에서 백혈구 diapedesis 중에 실시간으로 모니터링 할 수있는 비교적 간단한 분석을 개발 하였다. 이러한 항체는 방해 또는 표적 단백질의 접합부 무결성이나 이동성을 차단하지 않았다. 이 분석은 우리가 세포층 TEM 과정에서 접합부 단백질의 역학을 수행 할 수 있습니다. 또한,이 분석은 또한 파라 및 세포 횡단 이동 경로 간의 판별한다.

<table><tbody><tr><td>&mu;-슬라이드 VI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>플로우 챔버</td></tr><tr><td>0.45 &mu; M 필터&nbsp;</td><td>Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>20ml 주사기&nbsp;</td><td>BD Discardit II</td><td>366296</td><td></td></tr><tr><td>21g 바늘&nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>알부민&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>염화 암모늄 (NH4Cl)</td><td>Merck</td><td>1009245000</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘(CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 기초 매체 + EGM-2 SingleQuot 키트 공급 & 성장 인자</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td>미디어</td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 튜브&nbsp;</td><td>Corning 생명 과학</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td>FN</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>인라인 Luer 주입 포트&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 (MgSO4&bull; 7H2O)</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>클론 WM59</td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Fresenius Kabi&nbsp; Nederland</td><td>M090001 / 01NL</td><td>PBS</td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>탄산 수소 칼륨 (KHCO3)</td> <td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>인산 칼륨 이염기성 삼수화물 (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 Tygon 3350 튜빙</td><td>VWR</td><td>228-4331</td><td>튜빙</td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>모델 번호 55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td>종양 괴사 인자</td></tr><tr><td>시트르산 삼나트륨;</td><td>Merck</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, 독일</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>560411</td><td>클론 55-7H1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, 예나, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, 예나, 독일</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

염증 동안 백혈구는 혈액 순환을 떠나 기본 조직에서 병원균 침입 싸울 내피 교차합니다. 이 과정은 백혈구 transendothelial 이주로 알려져있다. 내피 단일 층을 통과하는 백혈구에 대한 두 가지 방법으로 설명되었다 : 즉, 세포 - 세포 접합 및 세포 횡단 노선을 통해 세포층의 경로, 즉, 내피 세포의 몸을 통해. 그러나 파라 및 세포 횡단 경로를 구별하는 것은 기술적으로 곤란 하였다. 우리는 내생의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1을 생리 흐름 조건에서 호중구 transendothelial 마이그레이션하는 동안 공부를 할 수있는 간단한 체외 분석을 개발했다. 호중구 관류 이전에, 내피 세포 간단히 VE-cadherin의 및 PECAM-1에 대한 형광 표지 항체를 처리 하였다. 전기 세포 substra 의해 결정되었을 때 이러한 항체는, 두 단백질의 기능을 방해하지 않았다테 임피던스 감지 및 FRAP 측정. 이 분석을 사용하여, 우리는 내생의 분포가 흐름 조건에서 transendothelial 마이그레이션하는 동안 및 PECAM-1-cadherin의를 VE 및 내피 세포에서 백혈구의 파라와 세포 횡단 마이그레이션 경로를 구별 수행 할 수 있었다.

항체는 내피 세포의 장벽 기능을 방해하지 않은 경우 우리는 첫번째 테스트했다. 우리는 전기 세포 - 기질 임피던스 센서 (ECIS)를 사용하여 내피 세포 단일 층의 저항을 측정 하였다. 자세한 내용은 반 Buul 외. 13 항 VE-cadherin의 형광 표지 된 항체를 세포 (도 2A)를 첨가했을 때의 저항의 변화가 관찰되지 않았다 참조. 차단 잘 인식되고 항-VE 카드 헤린 항체 함수 극적 (도 2A)을 저항을 감소 VE-카드 헤린의. 또한,의 역학을 변경하지 않는 영상에 사용되는 항체는 VE-cadherin의를, 사진 표백 (FRAP) 후 형광 복구를 측정하여 평가 하였다으로 (그림 2B)-cadherin의-GFP를 VE. 1-2 분 후, 호중구는 DIC 채널 (그림 3A)에 시각화 할 수 있기 때문에 활성화 된 내피 세포 단일 층에 부착. 5-30 자체에 대한 크롤링 후C, 중성 백혈구의 대부분은 PECAM-1에 대항하는 항체로 표지 및 VE-cadherin의를 한 세포 - 세포 접합을 통해 내피 세포 단일 층을 통해 transmigrated. diapedesis의 과정에서의 분포 VE-카드 헤린 및 PECAM-1은 실시간 (도 3b)에 따랐다. 호중구 diapedesis의 부위에서, VE-cadherin의 국부적 교란 및 PECAM-1 이상의 고리 형 구조를 보였다. diapedesis 완료 후, 가까이 접합 VE-cadherin의 및 PECAM-1 명확하게 diapedesis의 사이트 (그림 3C)에 이전. 호중구는 내피 세포의 BASO - 측면에 도달하면 안티 PECAM-1 항체의 부품이 호중구의 표면에 검출되었다합니다. 그러나, 이는 내피를 건너로부터 호중구를 방지하지 않았다. 호중구 transendothelial 마이그레이션하는 동안 실시간으로의 관찰 역학 VE-cadherin의는 쇼와 동료에 의해 작업과 일치 하였다 사람공 초점 현미경을 사용하여, 보여 VE-cadherin의-GFP 형질 VE-cadherin의-GFP가 백혈구가 내피 세포 - 세포 접합 (14)를 교차 할 때 가로 방향으로 확산 내피 세포를. 스와와 동료 PECAM-1의 우리의 관찰을 강조하여도 작동합니다. 그들은 백혈구 통로에 측면 옆에, 즉 VE-cadherin의 확산을 보여 PECAM-1은 로컬 transmigrating의 호중구 (15) 주위에 반지에 재분배된다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400"> 관내 유량 용기에서 그림 1. (A)는 화살표 매체가 새로 고칠 필요가있는 저수지를 나타냅니다. 튜빙 (화살촉)를 분리하지 않고 백혈구 주입에 사용되는 인라인 루어 주입구로 유동 챔버를 연결하는 (B) 실리콘 호스. (C) 코네티컷37 ° C의 흐름 버퍼 (화살촉) 가득 저수지 플라스크에 빈 흐름 챔버의 ection. (D) 흐름 버퍼 함유 튜브에 TNF-α 처리 된 HUVEC과 흐름 챔버의 연결 및 현미경 단계 (화살촉)에 배치. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500"> 도 2는 VE-cadherin의 접합부 역학 또는 기능을 방해하지 않는 항체. (A) 내피 세포 단층 ECIS 임피던스를 이용하여 측정된다. Y 축은 옴의 임피던스를 표현하고, X 축은 시간의 시간을 나타낸다. 항체 cl75 (검은 선)을 차단-cadherin의 VE 반면, VE-cadherin의 항체 ALEXA647 (파란 선)으로 표시 복제 55-7H1, 또는 임피던스를 감소, 내피 세포 단일 층의 임피던스를 변경하지 마십시오의 IgG-ALEXA647 제어 (빨간 선) 않았다 이소 타입 . (B <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500"> 도 3은 VE-카드 헤린 및 PECAM-1 분포를 실시간으로 호중구 TEM 중에. (A) 호중구가 내피에 부착 및 분포에 영향을주지 않고 세포 간 접합을 횡단 (흰색 선으로 표시) VE-카드 헤린 및 PECAM -1. (B) 호중구는 세포 - 세포 접합을 통해 내피 세포 단일 층을 건너. 의 로컬 분산 VE-cadherin의 호중구는 세포 간 접합을 통해 돌출 될 때 및 PECAM-1이 관찰 될 수있다. 화이트 라인은 내피 세포의 상단에 여전히 호중구의 존재를 보여줍니다. 노란색 선은 호중구 막 그쪽을 보여줍니다t는 내피 세포 아래에 이미 사용 중입니다. (C) 호중구가 완전히 내피 세포 단일 층을 교차하고있다. VE-cadherin의 및 PECAM-1 diapedesis의 사이트에 재배치된다. 노란색 선이 transmigrated 호중구의 테두리를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

이 절차의 전반적인 목표는 생리학적 흐름 조건에서 백혈구 트랜스 내피 이동 중 내인성 연접, terin 및 pcam one의 분포를 추적하는 것입니다. 이는 먼저 프로코 구배(proco gradient)를 사용하여 건강한 지원자의 전혈에서 다형성 핵 백혈구 또는 PMN을 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 유동 실험을 시작하기 30분 전에 유동 슬라이드에서 배양된 A TNF 알파 자극 인간 제대 정맥 내피 세포 단층에 형광 표지된 항체를 추가하는 것입니다.이를 통해 생리학적 흐름 조건에서 호중구 전이(neutrophil transmigration) 동안 내피 세포의 접합 역학(junectal dynamics)을 시각화할 수 있습니다. 다음으로, 형광 표지된 TNF 알파 자극 인간 제대 정맥 내피 세포를 포함하는 플로우 슬라이드를 플로우 시스템에 연결하고 현미경 스테이지에 놓습니다. 펌프는 흐름 챔버를 통해 저장소에서 주사기로 흐름 버퍼를 당깁니다.마지막 단계는 주입 포트를 통해 PMN을 유량 시스템에 천천히 주입하는 것입니다. 궁극적으로 PMN은 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 시각화됩니다. 몇 분 후 백혈구가 나타나 부착하고 전이합니다.실험은 원하는 순간에 중단할 수 있습니다. 정적 전이 분석과 같은 다른 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 생리학적 흐름 조건에서 실생활에서 접착 및 전이동을 연구할 수 있다는 것입니다. 이것은 백혈구가 다른 뿌리보다 한 뿌리를 선택하는 이유, 즉 PGA 대 세포 간 이동을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.우리는 형광 표지된 항체가 있는 세포 세포 접합을 시각화하여 이를 수행합니다. 이 실험을 위한 인간 제대 정맥 내피 세포 또는 HU X는 내피 성장이 보충된 배지를 사용하여 피브로넥틴 코팅 접시에 대한 제조업체의 지침에 따라 배양됩니다. 보통. 세포 배양은 세포가 80에서 90%에 도달하면 4-8개의 계대 사이에서 사용되며, Confluence는 pH 7.4에서 실온 PBS로 조심스럽게 세척한 다음 트립신과 원심분리 후 세포입니다.우리는 800, 미디어를 사용하여 밀리리터 당 000 세포를 중단합니다. 이 실험은 전날 플레이트에 피브로넥틴으로 코팅된 플로우 챔버를 사용합니다. 80, fibronectin의 각 수로에 있는 000의 세포는 교류 약실을 암호화하고 37 섭씨 온도 그리고 5%carbon 다음날에 5%carbon에 인큐베이터에서 밤새 배양 왔다갔다 세포 현탁액을 온화하게 피펫으로 삐걱거린다.슬라이드를 45도 각도로 부드럽게 기울여 플로우 챔버 슬라이드의 미디어를 새로 고칩니다. 채널 자체가 아닌 저장소의 미디어만 제거하는 것이 좋습니다. 채널에서 배지를 제거하면 파이펫팅으로 인한 배지의 드래그 힘으로 인해 내피 세포 손실 및 사멸이 발생할 수 있습니다.위상차 현미경으로 확인 내피 세포가 단층을 형성했는지 여부. 세포가 100% cofluent가 아닌 경우 100% confluence에 도달할 때까지 하루에 두 번 미디어를 교체합니다. 세포가 100% 유창성에 도달하면 염증 매개체를 포함하는 배지로 세포를 자극합니다.TNF 알파는 TNF 알파와 함께 하룻밤 사이에 uix를 자극하여 ICAM one 및 VA M1과 같은 세포 접착 분자의 내피 IE 상향 조절의 염증성 표현형을 초래합니다. 다형성핵 백혈구 또는 PMN을 분리하기 전에.분리된 PMN을 세척하고 이전에 준비된 원액 100ml에 대한 유동 분석에 사용하기 위한 유동 완충액을 준비합니다. 100 마이크로 리터의 신선한 1 몰 염화칼슘, 2.5 리터 당 200 그램의 원료 농도에서 인간 알부민 및 0.1 그램의 포도당.0.45미크론 필터를 사용하여 흐름 버퍼를 필터링합니다. pH 7.4의 PBS에 있는 10%Trisodium citrate 또는 TNC 용액도 PMN을 분리하기 전에 준비됩니다. PMN은 건강한 지원자의 나트륨 헤파린 ette에 수집된 20ml의 전혈에서 분리됩니다.먼저 15 밀리리터 튜브에 10 % PBST NNC로 전혈을 일대일로 희석합니다. 다음으로, 가장 느린 설정에서 피펫 보이를 사용하여 새로운 50 밀리리터 튜브에서 밀리리터당 1.130 그램의 밀도로 물에 있는 12.5 밀리리터의 콜로이드 용액에 희석된 혈액 20 밀리리터를 조심스럽게 조심스럽게 피펫팅합니다. 콜당 함유 튜브는 혈액을 추가하는 동안 45도 각도로 기울어져야 합니다.튜브를 원심분리기에 조심스럽게 놓고 실온에서 20분 동안 낮은 가속으로 800Gs로 회전하고 원심분리가 완료되면 브레이크를 비활성화합니다. 모든 액체를 제거하고 각 튜브에 얼음처럼 차가운 적혈구 용해 완충액을 채워 적혈구를 잿물로 만듭니다. 튜브를 얼음 위에 두고, 브레이크를 작동시킨 상태에서 서스펜션이 섭씨 4도에서 5분 동안 500GS에서 짙은 빨간색 원심분리기로 바뀔 때까지 때때로 튜브를 뒤집습니다.생성된 펠릿 분획에는 적혈구와 함께 PMN이 포함되어 상층액을 제거하고 펠릿을 얼음에서 두 번 세척합니다. 500Gs에서 섭씨 4도에서 5분 동안 저온 용해 완충액. 두 번째 세척에서 상등액을 제거한 후, 실온에서 플로우 버퍼로 펠릿을 다시 현탁시키고 자동화된 셀 카운터를 사용하여 PMN 농도를 측정합니다.마지막으로, 유량 완충액의 PMN을 10배에서 밀리리터당 6개의 셀로 현탁하고 실온에서 유지하여 내피 접합 VA cadherin 및 pcam 1을 표시합니다. pcam LOR 6 47 항체를 1 대 100 희석하고 칼슘 독립 FE cadherin ZI 항체를 1 대 50 희석으로 VE 배양액에 첨가한 후 유동 챔버에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 분석을 위해 PMN을 준비하려면 유량 시스템에 주입하기 전에 섭씨 37도에서 15분 동안 수조에 넣습니다.튜브를 빈 흐름 챔버에 연결하고 따뜻한 흐름 버퍼로 채워 기포 형성을 방지합니다. 흐름 시스템을 설정할 때. 실리콘 튜브를 사용하여 빈 플로우 챔버의 한쪽 면을 20ml 주사기가 들어 있는 시린지 펌프 플로우 시스템에 연결합니다.플로우 챔버를 현미경 스테이지에 놓습니다. 분석은 63 x 오일 대물렌즈와 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소로 설정된 기후 챔버가 장착된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행됩니다. 빈 플로우 챔버의 다른 쪽을 섭씨 37도의 유량 버퍼로 채워진 저장 플라스크에 연결하고 주사기 펌프를 시작하여 모든 튜브에 플로우 버퍼를 흐름 버퍼로 채우면 펌프는 플로우 챔버를 통해 저장소에서 주사기로 흐름 버퍼를 당깁니다.이 튜브에는 인라인 루어 주입 포트도 포함되어 있어 흐름을 중단하거나 기포를 생성하지 않고 실행 중인 실험에 바늘로 PMN을 주입할 수 있습니다. 다음으로, 빈 플로우 챔버를 TNF 알파 처리된 VE가 포함된 플로우 챔버로 교체하고, 튜브를 분리했다가 다시 연결하기 전에 튜브를 집어 VE.To 시스템의 기포를 방지하려면 튜브를 꼬집고 고정하는 것이 중요합니다. 셀이 포함된 슬라이드를 연결하는 경우.플로우 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 모세관 후 es의 생리적 유속에 따라 유속을 1 센트 제곱으로 조정하며, 이는 센티미터 제곱당 1-5 딘 기록 차동 간섭 대비 또는 DIC fite LOR 6 47입니다. 동시에 1ml 주사기를 사용하여 인라인 루어 주입 포트를 통해 PMN을 흐름 시스템에 천천히 주입합니다. 몇 분 후, 백혈구가 나타나고, 부착하고, 전이되어 원하는 순간에 실험을 중단합니다.유동 챔버에서 튜브를 분리하고 유동 챔버에 고정제를 피펫팅하여 내피 단층의 저항을 측정하여 항체가 내피의 장벽 기능을 방해하는지 여부를 테스트했습니다. VE가 항체 클론 55 7 H one을 들을 수 있거나 isotype control이 세포에 추가되었을 때 내성의 변화는 관찰되지 않았습니다. 대조적으로, VE 대구는 차단 항체 CL 75를 듣게 되어 내성이 크게 감소했습니다.RAP 분석에서는 VE CADHERIN 55 7 H 단일 항체의 유무에 따라 형광 회복에 변화가 없음을 확인했으며, 이는 항체가 호중구 트랜스 내피 이동 또는 TEM 동안 VE cadherin, VE cadherin 및 pcam one 분포의 역학을 실시간으로 변경하지 않았음을 나타냅니다. 상단 패널은 흰색으로 윤곽선이 그려진 호중구가 내피에 부착되어 VE coherent 및 pcam one의 분포에 해를 끼치지 않고 세포를 가로질러 세포 접합부로 이동하는 것을 보여줍니다. 투아페데시스(diapedesis) 동안, VE coherent와 P chem one의 국소 분산은 호중구가 세포를 통해 돌출되어 흰색으로 표시된 세포 접합부로 돌출될 때 관찰할 수 있으며, 이는 내피 상부에 있는 호중구입니다.노란색 윤곽선은 이미 내피 아래에 있는 호중구막을 나타냅니다. 기저귀 치료가 완료된 후, 접합부가 닫히고 일관성이 있으며 pcam one은 기저귀 치료 부위로 재배치됩니다. 트랜스 마이그레이션된 호중구의 경계는 노란색으로 윤곽선이 그려져 있습니다.이 절차에 따라 백혈구가 bagga 또는 transcellular root를 사용하여 내피를 교차하는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 백혈구 trans endothelial migration을 수행할 수 있습니다.

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 마우스 노상 강도의 백혈구가 추적 연구 비침습 두 개의 광자 (2P) 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 우리는 조직 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포의 미세 영상은 cytoskeletal 구조에서 동적 변화 특성화 수 있습니다. 고정 표본을 사용하는 기술과는 달리,이 방법은 전에 동일한 세포에있는 굴지의 cytoskeleton의 시간적 변화에 대한 자세한 평가, 동안 다양한 물리적, 약리, 또는 염증성 자극 후를 제공합니다.

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

호중구 이동은 화학 유인 물질 및 세포 외 미세 환경과의 상호 작용에 대한 반응으로 원형질막의 빠르고 지속적인 리모델링에 의존합니다. 본원에서는 마취된 마우스의 귀에 주입된 호중구에서 막 리모델링의 역학을 조사하기 위한 Intravital Subcellular Microscopy에 기초한 절차가 설명됩니다.

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

학습하세요 생리적 흐름 조건에서 호중구의 내피 세포 횡단 이동을 실시간 영상화하는 방법을. VE-c�드헤린과 PECAM-1 단백질을 이용해 세포 간 및 세포 내 이동 경로를 구분하고 염증 반응 메커니즘을 규명합니다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

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